DypB活性蛋白異源高表達的方法及應用與流程
2023-10-17 09:35:24 3
本發明屬於基於工程
技術領域：
,具體涉及一種DypB活性蛋白異源高表達的方法及應用。
背景技術：
：木質素是一種廣泛存在於植物體中的無定形的、分子結構中含有氧代苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物。木質素屬天然芳香族高分子聚合物,由苯基丙烷單元通過醚鍵(C-OC)和碳-碳鍵(C-C)連接聚合而成的複雜的、無定形的三維空間結構,依苯丙烷的側鏈取代基不同,木質素又可以分為松柏醇(Coniferylalcohol)、香豆素(p-Coumarylalcoho1)和芥子醇(Sinapylalcoho1)等結構單元。這些結構單元存在多樣性，重複單元間缺乏規律性和有序。自然界中，木質素幾乎全部與纖維素伴生，木質素與半纖維素以共價鍵形式結合,將纖維素分子包埋在其中,一方面極大提高了纖維素在纖維垂直方向上的剛性，另一方面形成一種天然阻礙，使纖維素酶類不易與纖維素分子大面積作用，維持纖維素分子的穩定性。這也造成在纖維素酶解過程中由於酶作用方式受到木質素-纖維素緊密結構的影響不能同時多點消化底物，造成實際酶解效果相對遲滯，給纖維素水解造成內因性困難。由於木質素結構的複雜性,相應降解木質素的酶系也很複雜,牽涉到胞外大分子氧化降解和胞內小分子分解代謝反應。木質素的生物降解代謝是通過微生物產生的木質素酶的作用實現的，研究結果表明，在自然界中木質素的降解是真菌、放線菌和細菌三者共同作用的結果。國內外關於木質素酶的研究主要是基於白腐真菌-黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，它可分泌出一套可降解木質素的多酶系統，主要以以下三種酶為主：木質素過氧化物酶(LiP)，代表一系列含有Fe3+、卟啉環的同工酶。LiP的催化底物具有非特異性，包括酚類和非酚類芳香化合物，可以氧化木質素單體，二體，三體以及多環芳烴等底物，方式是在H2O2的驅動下，通過電子傳遞體進攻木質素，從苯環上奪取電子，將其氧化成自由基，以此形成鏈式反應產生更多的不用自由基，最終導致木質素的骨架鍵斷裂，是迄今為止發現的唯一一種可以單獨氧化降解非酚型木質素結構的過氧化物酶。錳過氧化物酶(MnP)同樣含有血紅素，且還含有Mn2+。MnP只能氧化酚型木質素，MnP血紅素中的Fe3+與H2O2結合形成鐵過氧化物聯合體，形成複合物I，Mn2+作為電子供體將複合物I還原為複合物II，同時自身被氧化為Mn3+，隨後複合物II再被1個螯合的Mn2+還原為初始MnP，放出2分子H2O。Mn3+通過整合作用與有機酸(如草酸、丙二酸、蘋果酸等)結合形成穩定的高氧化還原電勢。螯合的Mn3+作為低分子量可擴散的物質，成為氧化還原中介體，是可滲透或擴散到木質素結構中的氧化劑，可以氧化苯酚、甲氧基芳香族化合物、硝基/氯代芳香族化合物，催化斷裂芳香族的烷基-芳基鍵和苯酚的Cα。漆酶(Laccase)，是一種含Cu2+的多酚氧化酶，反應是不需要H2O2。當分子氧存在時能將羥基脫質子化形成酚氧離子，是木質素酚型結構單元的側鏈斷裂，包括C-C鍵，脫羥基，脫甲氧基等，其中Cu2+起關鍵作用。但Laccase由於氧化還原點位低，只能在低分子物質作為介質時，漆酶才可以氧化非酚型結構的木質素。當下被使用的木質素酶製品主要來源於黃孢原毛平革菌，而它的培養條件(低氮，高溫，次生代謝，靜置培養，輔基的相互影響，通氧需求等)大大制約了其木質素酶製劑的效力和品位，生產規模和產率也因為上述原因難以簡單擴大，不利於這一工業酶製品的推廣和應用。近些年，科學家們也嘗試將木質素酶進行異源表達。1998年，首次將黃孢原毛平革菌的LiP在E.coli中成功表達，相繼國內外科學家在E.coli中表達MnP和Laccase。還嘗試將Lip在畢赤酵母中表達。但Lip和MnP中卟啉是必須組分，使得其在E.coli中表達積累後不具有活性，需要另添加昂貴的輔酶；而採用酵母表達體系重組表達Lip的表達量低，活性也顯著低於天然水平。綜上，到目前木質素酶只能在生物製漿，生物漂白，造紙廢水處理，印染廢水處理，纖維廢水處理，飼料工業等方面得到初步應用。Dye-decolorizingperoxidaseB(細菌木質素過氧化物酶，簡稱DypB)於2011年首次被Eltis等人報導，其基因來源於紅球菌RhodococcusjostiiRHA1。該酶能夠在E.coli中重組表達，但需經體外結合卟啉後才具有降解木質素活性，增加了生產環節，提高了產品成本，降低了生產效率。本發明擬通過基因重組，在表達宿主中整合DypB基因和血紅素合成相關基因，解決DypB在異源表達中卟啉自產的活性的問題。技術實現要素：本發明要解決的技術問題為：DypB蛋白在異源表達中卟啉自產的活性的問題。本發明解決技術問題的技術方案為：提供一種DypB活性蛋白異源高表達的方法及應用。本發明的DypB活性蛋白異源高表達的方法，包括以下步驟：a、構建表達宿主BL21-AL構建表達框架，所述表達框架從5』到3』方向依次為tac啟動子、核苷酸序列為SeqIDNo.1的hemA基因、核苷酸序列為SeqIDNo.2的hemL基因、thrA基因，插入到pET28a質粒上構建成pET28a-hemAL；以質粒pkd3為模板，PCR擴增氯黴素抗性基因與兩側的FRT位點，添加E.colithrA基因5′端同源臂，插入到pET28a-hemAL，構建成pET28a-hemAL-Cm；將質粒pkd46轉入大腸桿菌BL21(DE3)，構建成大腸桿菌BL21-46，再將pET28a-hemAL-Cm導入到BL21-46，進行red重組後，導入質粒pCP20，敲除氯黴素抗性基因，構建成表達宿主BL21-AL；b、構建表達載體pCspA-dypB將核苷酸序列為SeqIDNo.3的DypB基因插入到pET28a載體中，構建pET28-dypB，以E.coli為模板，PCR擴增cspA基因啟動子，插入到pET28-dypB中，構建成表達載體pCspA-dypB；c、DypB蛋白的表達與純化將步驟b中的表達載體pCspA-dypB導入步驟a所述的表達宿主BL21-AL中，IPTG誘導表達，Ni親和層析法進行純化，得到高純度的DypB活性蛋白。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟a中所述的hemA基因和hemL基因來自枯草芽孢桿菌。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟a中所述的構建pET28a-hemAL載體時，插入位點為BglⅡ和EcoRⅠ。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟a中所述構建pET28a-hemAL-Cm時，插入位點為SphⅠ和BglⅡ。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟b中所述的cspA基因由核苷酸序列如SeqIDNo.4所示的啟動子調控表達。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟b中所述的PCR擴增的引物為核苷酸序列如SeqIDNo.5和SeqIDNo.6所示的引物。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟b中所述的插入位點為NdeⅠ和HindⅢ。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟c中所述的IPTG誘導表達溫度為14～25℃，誘導表達時間為10～24h。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟c中所述的Ni親和層析操作條件為：10～50mMTris-HCl，200～500mMNaCl，0～10mMimidazole平衡；10～50mMTris-HCl，200～500mMNaCl，30～100mMimidazole洗脫雜蛋白；10～50mMTris-HCl，200～500mMNaCl，300mM～1Mimidazole洗脫目的蛋白。具體的，上述DypB活性蛋白異源高表達的方法中，步驟a和步驟c中的導入方式均為化轉的方式。本發明還提供一種上述方法製備得到的DypB活性蛋白的應用，用於降解木質素。本發明還提供一種重組載體，其包含核苷酸序列為SeqIDNo.3的DypB基因和pET28a載體。本發明中，先將來自於枯草芽孢桿菌的表達血紅素的相關基因hemA與hemL串聯，將其添加至pET28a質粒上構建pET28a-hemAL載體，再通過PCR擴增氯黴素抗性基因與兩側的FRT位點，插入到pET28a-hemAL，構建成pET28a-hemAL-Cm載體，導入到BL21-46宿主中，進行red重組、陽性篩選，再導入質粒pCP20中，敲除氯黴素抗性基因，構建成的表達宿主BL21-AL中，能大量表達血紅素,表達宿主中血紅素含量高，為DypB蛋白的表達提供了基礎。隨後再構建表達載體pCspA-dypB，將其導入表達宿主BL21-AL中，IPTG誘導表達，誘導表達採用冷誘導，誘導表達溫度為16℃，解決了DypB蛋白異源表達沒有時沒有活性的問題，獲得了DypB活性蛋白。並且，通過採用冷誘導表達，顯著提高了DypB活性蛋白的表達量，使DypB活性蛋白的純度提高。本發明的有益效果為：本發明在宿主的基因組中整合表達了2個血紅素合成途徑的相關基因，提高了宿主體內血紅素的表達量，使之能滿足DypB活性蛋白表達的需求，實現了DypB蛋白異源表達從沒有活性到有活性的質的飛越；本發明同時還採用了cspA基因的啟動子對dypB進行冷誘導，最大化的推動dypB活性蛋白的表達量，使dypB活性蛋白表達穩定，並且純度高，實現了dypB活性蛋白在異源宿主中穩定高效的表達，能有效的降解木質素，提高了生產效率，降低了生產成本。附圖說明圖1所示為pET28a-HemALT7引物驗證HemALPCR電泳圖；圖2所示為pET28a-HemAL-Cm驗證氯黴素抗性基因PCR電泳圖，1為pET28a-HemAL-Cm，2為pET28a-HemAL；圖3所示為BL21-AL表達宿主驗證氯黴素抗性基因PCR驗證電泳圖，1為BL21(DE3)，2為BL21-AL；圖4所示為pET28-dypBT7引物驗證dypBPCR電泳圖，1為pET28a，2為pET28-dypB；圖5所示為pCspA-dypBXbaⅠ與HindⅢ酶切驗證電泳圖，1和2均為pCspA-dypB；圖6所示為dypB蛋白純化電泳圖。具體實施方式下面通過實施例對本發明的具體實施方式做進一步的解釋說明，但不表示將保護範圍限制在實施例所述範圍內。實施例中，dypB基因，hemA與hemL基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；大腸桿菌培養與dypB蛋白重組表達均採用LB培養基：Tryptone1％，Yeastextraction0.5％，NaCl1％，pH7.0；限制性核酸內切酶購自大連寶生物公司，鎳親和純化預裝柱購自Novagen公司，BCA蛋白定量試劑盒購自天根生化科技有限公司，其餘生化試劑購自sigma公司，PCR引物由上海生工公司合成。實施例1BL21-AL表達宿主的構建(1)重組載體pET28a-hemAL-cm的構建通過NCBI調取枯草芽孢桿菌的hemA基因和hemL基因，優化密碼子，通過同義突變去除E.coli表達稀有密碼子，得到核苷酸序列為SeqIDNo.1的hemA基因和核苷酸序列為SeqIDNo.2的hemL基因，兩基因串聯，(G4S)x2為linker，tacpromoter啟動表達，hemL端添加核苷酸序列為SeqIDNo.11的thrA基因3端36bp同源臂，最後在兩端添加酶切位點(BglⅡ)和(EcoRⅠ)交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。合成序列經(BglⅡ)和(EcoRⅠ)插入到pET28a質粒上構建成pET28a-hemAL。以質粒pkd3模板,用核苷酸序列為SeqIDNo.7的引物1與核苷酸序列為SeqIDNo.8的引物2，PCR擴增氯黴素抗性基因(CAT)與兩側的FRT位點，利用引物1添加E.colithrA基因5端36bp同源臂，酶切位點(SphⅠ)和(BglⅡ)分別存在於引物1和引物2上，並以此酶切位點插入到pET28a-hemAL，構建成pET28a-hemAL-Cm。red重組整合目的基因首先將pkd46導入到BL21(DE3)中，構建成BL21-46。然後將重組質粒pET28a-hemAL-Cm導入到BL21-46中，復甦過程加入阿拉伯糖誘導進行red重組，用氯黴素平板進行篩選，轉化子用核苷酸序列為SeqIDNo.9的引物3與核苷酸序列為SeqIDNo.10的引物4，PCR驗證氯黴素抗性基因與肉眼觀測菌液顏色變為紅色確定為陽性。最後導入質粒pCP20,42℃誘導敲除氯黴素抗性基因，最終完成BL21-AL表達宿主的構建。實施例2pCspA-dypB表達載體的構建dypB基因來源於紅球菌(RhodococcusjostiiRHA1)，通過NCBI調取紅球菌dypB基因序列，優化密碼子，兩端添加酶切位點(NdeⅠ)與(HindⅢ)，交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。合成序列經上述酶切位點插入到pET28a載體，構建成pET28-dypB。以E.coli為模板，用核苷酸序列為SeqIDNo.5的引物5與核苷酸序列為SeqIDNo.6的引物6，PCR擴增cspA基因啟動子，在兩端添加酶切位點XbaⅠ與NcoⅠ並以此酶切位點插入到pET28-dypB中，構建成pCspA-dypB。實施例3dypB蛋白的表達與純化將質粒pCspA-dypB分別導入到BL21-AL與BL21(DE3)表達宿主中，將陽性單菌落在37℃培養至OD600＝0.8時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，於16℃誘導20小時；收集菌體用1/4菌液體積的緩衝液重懸(20mMTris-HCl，5％glycerol)，超聲波破碎，收集上清；用鎳親和層析法純化：20mMTris-HCl，500mMNaCl，5mMimidazole平衡，20mMTris-HCl，500mMNaCl，60mMimidazole洗脫雜蛋白，20mMTris-HCl，500mMNaCl，500mMimidazole洗脫目的蛋白。將洗脫液用20mMTris-HCl，5％glycerol透析12小時進行置換，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，並調節濃度到1mg/ml於-80保存。DypB的活性測定：Kraftlignin購自sigma公司，配製成25mg/mL，succinatebuffer配製成pH5.5,50mM，MnCl2配製成50mM,DypB定濃到1mg/ml，H2O2配製成40mM，按照下述順序和濃度加入各個成分，30℃反應10min，在465nm測定吸光值，以不加酶作為對照：30℃反應10min，在465nm處測定吸光值。酶活單位U:30℃,pH5.5，一分鐘消化1ugKraftlignin的酶量。DypB活性測定結果如下表1所示。表1DypB活性測定結果樣品吸光值酶活DypB源於BL21(DE3)NotdeterminedNotdeterminedDypB源於BL21-AL0.121.2U由實施例可知，本發明通過重組改造，在表達宿主中整合血紅素合成相關基因提高其體內積累濃度，然後通過冷誘導方式大量表達DypB，結果顯示：DypB經BL21-AL宿主表達後具有了降解木質素的活性，酶活達到1.2U，能有效的對木質素進行降解。SEQUENCELISTING四川愛奇生物科技有限公司DypB活性蛋白異源高表達的方法及應用A170022K11PatentInversion3.511335DNAArtificialSequencehemA的核苷酸序列1gtgcatattcttgttgttagtgtaaattatcgaacagcccctgtagaatttcgtgagaaa60ctcacatttcaggcagcagagctagagcgagcaatgacgacattacaaaatcaaaagagc120gtgttagagaatgtcattgtatcaacttgtaatcgtactgagatttacgctgttgtcgat180caattacacacgggacggtattatattaagaaatttttagctgattggtttcagcttgaa240atagaagaagtcgcaccatatttaactatttttgaacaagatggtgcaatagatcattta300ttccgcgtaacgtgcggtttagattctatggtagttggagagacgcaaattttaggtcaa360ataaaagatagctttttagaagcgcaacaagtaaaagcaacaggaacaatttttaatgaa420ttgtttaagcaagtcattacattagcaaaacgcgcgcactcagaaacgacaattggtgaa480agtgcgatgtctgttagttatgctgctgttgagttagggaagaaaatattcggcgagtta540acagattgtcacgtgcttattctcggtgctggtaaaatgggtgaacttgcactgcagaac600ttatatggaagcggtgctcgtaaagtaacagttatgaataggacgctttcaaaagcagaa660ataatggctgagaaatatatgggacatgcaaaacctttaagtgaattacaatgtgcatta720ttagaagctgatattttaattagttcaacgggtgcatcggattatgttattacgaaagag780atgatgacaaaggtagagaaaatgcgctctggccgtccattatttatggttgatattgca840gtgccgcgtgatattgatccagcgattgatgagctagaaggttctttcttatatgacatt900gatgatttgcaaggagtagtggaagcaaaccgtgctgaacgtttgaaagaagcagagaaa960attcaatttatgattgaagaggaaattgttttatttaaaacgtggttaagtacacttggt1020gtcgttccgttaatatcagctcttcgtgataaggcacttgctatccaaagtgaaacgatg1080gaaagtctggaacgaaaaataccgaatcttagtgatcgtgagagaaaagtaattagtaag1140catacgaaaagtattattaatcaattattaaaagacccaattttagtagcgaaagaaata1200gctgctgaagagggagcagacgaaaaattagcgttatttgcaaagattttcgatttagaa1260atggaagacgtagagagtcgtgcggaagaagtagaacataaaagagtgtggacaccatcc1320gttccatctttataa133521299DNAArtificialSequencehemL的核苷酸序列2gtgaaattcacaaaatcagaagcattacataaagaagctttagaacatatcgttggcggc60gttaatagtccttctcgttcttttaaagcagttggcggcggcgctcctattgctatggaa120cgcggaaaaggtgcttatttctgggatgtagacggaaataaatatatcgattatttagca180gcatacggtcctattattactggacacgctcacccacacatcacaaaagcaattacaact240gctgctgaaaatggtgtactttacggaacaccaacagcactagaagtaaaatttgcaaaa300atgttaaaagaagcaatgcctgcattagataaagtccgcttcgtaaactctggtactgaa360gcagtaatgacaacaattcgtgtcgctcgtgcttacacaggccgcacaaaaattatgaaa420tttgctggttgttaccatggtcattctgatttagtacttgtagcagctggatctggccct480tctacactaggaacccctgactcagccggtgtaccacaaagtatcgctcaagaagttatt540actgttccatttaataatgtagaaactttaaaagaagcattagataaatggggacatgag600gtagcagctattcttgtagaaccgattgttggaaacttcggtattgtagagccaaaacct660ggcttccttgagaaagtgaatgaacttgttcatgaagctggtgcattagtaatttatgat720gaagttattaccgctttccgcttcatgtacggtggcgctcaagacttacttggcgtaaca780ccagacttaacagcgcttggtaaagttatcggcggcggactaccaatcggtgcttacggt840ggtaagaaagaaattatggaacaagttgccccgctcggacctgcatatcaagctggtaca900atggcaggaaatcctgcttctatggcatctggtattgcttgtctagaagttcttcaacaa960gaagggctttatgagaaattagatgagcttggtgcaatgcttgaaaaaggaattttagag1020caagctgcaaaacataatatcgatattacattaaaccgtctaaaaggtgctttaactgta1080tacttcacaacaaatacaattgaagattacgatgcagcacaagatacagatggggaaatg1140ttcggcaacttcttcaagctaatgcttcaagaaggcgttaacttagcaccttctaaatat1200gaggcatggttcttaacaacagagcatacaaaagaagatattgaatatacaattgaagct1260gtaggcagagcatttgctgctttagcagacaataaataa129931053DNAArtificialSequencedypB基因的核苷酸序列3atgccaggcccagtcgcgagattggcaccacaagcagtcctcactccgcccagcgccgcc60tccctcttcctggtgctcgtcgccggggactccgacgacgaccgcgcgacggtgtgcgac120gtgatctccgggatcgacggaccgctcaaggcggtgggattccgcgaactcgccggttcc180ctgtcctgcgtggtcggtgtcggtgcgcagttctgggaccgcgtgagcgcgtcgtcgaag240ccggcgcacctgcatccgttcgtcccgctgtccgggccggtccacagcgcgccctccacg300ccgggtgacctcctgttccacatcaaggccgcccgcaaggatctgtgcttcgaactgggc360cgccagatcgtctccgcgctgggctccgccgccaccgtggtcgacgaggtgcacggcttc420cgctatttcgactcccgcgacctcctcggattcgtcgacggcaccgagaatcccaccgac480gacgacgccgcggactccgccctgatcggcgacgaggaccccgacttccggggcggcagt540tacgtgatcgtgcagaagtacctgcacgacatgagcgcgtggaacacgctgagcaccgag600gaacaggaacgggtcatcgggcgcaccaagctcgagaacgtcgaactcgacgacgacgcc660cagcccagcaattcgcacgtcaccctcaacaccatcgtcgacgacgacggcgtcgaacac720gacatcctccgcgacaacatggcattcggcagcctcggcgaggcggaatacggcacctac780ttcatcgggtacgccaaggaccccgccgtcaccgagctgatgttgcgacgcatgtttctc840ggcgagccgcccggcaactacgaccgcgtcctcgacttctccacggcggccaccggcaca900ttgttcttcgtgccgagccgggacgtgctcgaatcgctcggcgacgagccggccggcgcg960gagtcggcacccgaagacccggtcgagcccgccgcggccggcccgtacgacctgtccctg1020aaaatcggtggtctcaaaggagtatcgcaatga10534200DNAArtificialSequencecspA啟動子基因的核苷酸序列4attgttgcatcacccgccaatgcgtggcttaatgcacatcaacggtttgacgtacagacc60attaaagcagtgtagtaaggcaagtcccttcaagagttatcgttgatacccctcgtagtg120cacattcctttaacgcttcaaaatctgtaaagcacgccatatcgccgaaaggcacactta180attattaaaggtaatacact200531DNAArtificialSequence構建表達載體pCspA-dypB的引物5的核苷酸序列5agatctattgttgcatcacccgccaatgcgt31631DNAArtificialSequence構建表達載體pCspA-dypB的引物6的核苷酸序列6ccatggagtgtattacctttaataattaagt31769DNAArtificial構建表達載體pET28a-hemAL-Cm的引物1的核苷酸序列7gcatgccggtacatcagtggcaaatgcagaacgttttctgcggaagttcctatactttct60agagaatag69834DNAArtificialSequence構建表達載體pET28a-hemAL-Cm的引物1的核苷酸序列8agatctaatatcctccttagttcctattccgaag34925DNAArtificial構建表達宿主BL21-AL的引物3的核苷酸序列9tgataccgggaagccctgggccaac251025DNAArtificial構建表達載體pET28a-hemAL-Cm的引物2的核苷酸序列10tcattaagcatctgccgacatggaa25112463DNAArtificialthrA基因核苷酸序列11atgcgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcaaatgcagaacgttttctgcgtgtt60gccgatattctggaaagcaatgccaggcaggggcaggtggccaccgtcctctctgccccc120gccaaaatcaccaaccacctggtggcgatgattgaaaaaaccattagcggccaggatgct180ttacccaatatcagcgatgccgaacgtatttttgccgaacttttgacgggactcgccgcc240gcccagccggggttcccgctggcgcaattgaaaactttcgtcgatcaggaatttgcccaa300ataaaacatgtcctgcatggcattagtttgttggggcagtgcccggatagcatcaacgct360gcgctgatttgccgtggcgagaaaatgtcgatcgccattatggccggcgtattagaagcg420cgcggtcacaacgttactgttatcgatccggtcgaaaaactgctggcagtggggcattac480ctcgaatctaccgtcgatattgctgagtccacccgccgtattgcggcaagccgcattccg540gctgatcacatggtgctgatggcaggtttcaccgccggtaatgaaaaaggcgaactggtg600gtgcttggacgcaacggttccgactactctgctgcggtgctggctgcctgtttacgcgcc660gattgttgcgagatttggacggacgttgacggggtctatacctgcgacccgcgtcaggtg720cccgatgcgaggttgttgaagtcgatgtcctaccaggaagcgatggagctttcctacttc780ggcgctaaagttcttcacccccgcaccattacccccatcgcccagttccagatcccttgc840ctgattaaaaataccggaaatcctcaagcaccaggtacgctcattggtgccagccgtgat900gaagacgaattaccggtcaagggcatttccaatctgaataacatggcaatgttcagcgtt960tctggtccggggatgaaagggatggtcggcatggcggcgcgcgtctttgcagcgatgtca1020cgcgcccgtatttccgtggtgctgattacgcaatcatcttccgaatacagcatcagtttc1080tgcgttccacaaagcgactgtgtgcgagctgaacgggcaatgcaggaagagttctacctg1140gaactgaaagaaggcttactggagccgctggcagtgacggaacggctggccattatctcg1200gtggtaggtgatggtatgcgcaccttgcgtgggatctcggcgaaattctttgccgcactg1260gcccgcgccaatatcaacattgtcgccattgctcagggatcttctgaacgctcaatctct1320gtcgtggtaaataacgatgatgcgaccactggcgtgcgcgttactcatcagatgctgttc1380aataccgatcaggttatcgaagtgtttgtgattggcgtcggtggcgttggcggtgcgctg1440ctggagcaactgaagcgtcagcaaagctggctgaagaataaacatatcgacttacgtgtc1500tgcggtgttgccaactcgaaggctctgctcaccaatgtacatggccttaatctggaaaac1560tggcaggaagaactggcgcaagccaaagagccgtttaatctcgggcgcttaattcgcctc1620gtgaaagaatatcatctgctgaacccggtcattgttgactgcacttccagccaggcagtg1680gcggatcaatatgccgacttcctgcgcgaaggtttccacgttgtcacgccgaacaaaaag1740gccaacacctcgtcgatggattactaccatcagttgcgttatgcggcggaaaaatcgcgg1800cgtaaattcctctatgacaccaacgttggggctggattaccggttattgagaacctgcaa1860aatctgctcaatgcaggtgatgaattgatgaagttctccggcattctttctggttcgctt1920tcttatatcttcggcaagttagacgaaggcatgagtttctccgaggcgaccacgctggcg1980cgggaaatgggttataccgaaccggacccgcgagatgatctttctggtatggatgtggcg2040cgtaaactattgattctcgctcgtgaaacgggacgtgaactggagctggcggatattgaa2100attgaacctgtgctgcccgcagagtttaacgccgagggtgatgttgccgcttttatggcg2160aatctgtcacaactcgacgatctctttgccgcgcgcgtggcgaaggcccgtgatgaagga2220aaagttttgcgctatgttggcaatattgatgaagatggcgtctgccgcgtgaagattgcc2280gaagtggatggtaatgatccgctgttcaaagtgaaaaatggcgaaaacgccctggccttc2340tatagccactattatcagccgctgccgttggtactgcgcggatatggtgcgggcaatgac2400gttacagctgccggtgtctttgctgatctgctacgtaccctctcatggaagttaggagtc2460tga2463當前第1頁1 2 3