[b9穀氨酸，b10門冬氨酸]人胰島素的製作方法
2023-10-11 04:26:04 6
專利名稱：[b9穀氨酸，b10門冬氨酸]人胰島素的製作方法
作為治療糖尿病的特效藥，胰島素應用於臨床已有70多年，是臨床上用量最大的蛋白質類藥物。胰島素的生理功能在於保持人正常的血糖水平。通常，飯後30-60分鐘內血胰島素達到高峰，120-180分鐘內恢復到基礎水平，與進餐後的血糖高峰協調一致。目前臨床上使用的含鋅胰島素製劑主要以六體等多聚體形式存在，而胰島素是以單體形式表現其生理功能。因此，注射到皮下後需逐漸解離成單體，120分鐘血中才出現高峰，並且此峰值一直持續到180-240分鐘，造成病人一段時間內因血中胰島素濃度過低而出現高血糖症狀，隨後又因血胰島素濃度過高而表現為低血糖(Brange J，et al.，Diabetes Care，1990，13923)。為了改善這種狀況，改進胰島素性能，以得到能迅速降低血糖水平的單體胰島素製劑已成為臨床治療的迫切需要(Brange J，et.al.，Nature，1988，333679；Brange J，et al.，Cur Opin Struct Biol，1991，934)。
胰島素單體聚合為二體時由B12Val、B24與B25Pne、B16與B26Tyr等組成的疏水面、B鏈羧端反平行β摺疊以及其它一些氫鍵等參與作用。三個二體依靠極性和非極性作用，以及配位鍵形成六體。因此，改變參與形成二體的胺基酸殘基以阻礙二體的形成，即有可能獲得單體胰島素類似物。
胰島素的三維結構分析表明，B9Ser位於形成胰島素二聚體的疏水面內(Baker EN，et al.，Phi Trans Roy Soc London B.，1988，319369)，基於此，Brange等(Nature，1988，333679)將B9的Ser改為Asp，以排斥二聚體的形成，獲得在藥劑濃度下以單體形式存在的胰島素，成為臨床需要的速效胰島素(Kang S，et al.，Lancet，1990，335303)，本實驗室用Glu取代B9Ser，得到了類似的結果。但它們的生物活力明顯降低，約為天然胰島素的二分之一。此外，本實驗室用Asp代替B10His獲得高活力[B10Asp]人胰島素。Burke等(Biochem Biophys Res Comm，1990，173982)用化學合成方法比較了一系列與B10Asp組合的胰島素類似物，發現B10His被Asp取代後，能普遍提高相應的胰島素類似物的生物活力。
基於以上結果，本發明利用蛋白質工程方法製備了單體胰島素類似物——[B9 X，B10 Y]人胰島素，其中X、Y均為酸性胺基酸(具體實施為[B9G1u，B10Asp]人胰島素；含豬胰島素前體(porcine insulinprecursor，PIP)突變基因的表達型質粒的酵母菌株Saccharomycescerevisiae YS92/pLL[B9E，B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC N0.M95042)已保藏在中國典型培養物保藏中心(中國·武漢·武漢大學校內)。[B9G1u，B10Asp]人胰島素的受體結合能力為豬胰島素的34.4％，體內生物活力則與天然胰島素基本相同。因此，本發明可望作為單體速效胰島素應用於臨床。
本發明的技術特徵在下述的實施例中作具體描述。
本發明的附圖作以下說明
圖1.豬胰島素前體(PIP)基因的突變。
圖2.突變胰島素B鏈改變區域的DNA序列圖譜。
圖3.表達產物在Sephadex G-50柱(2.6×160cm)上的層析圖譜。
峰3為[B9Glu，B10Asp]PIP。
圖4.聚丙烯醯胺凝膠電泳(pH8.3)圖譜。
圖4(a).Sephadex G-50純化之[B9Glu，B10Asp]PIP(A)及進一步經HPLC純化的[B9Glu，B10Asp]PIP(B)。
圖4(b).B30Thr(But)-OBut[B9Glu，B10Asp]人胰島素(A)；[B9Glu，B10Asp]人胰島素(B)；對照(C)上麵條帶為B30Thr(But)-OBut人胰島素，靠下條帶為豬胰島素。
圖5.胰島素HPLC圖譜。
圖5(a).純化的[B9Glu，B10Asp]PIP。
圖5(b)[B9Glu，B10Asp]人胰島素。
圖6.轉肽反應混合物的HPLC圖譜。
圖7.[B9Glu，B10Asp]人胰島素(o-o)和豬胰島素(x-x)與人胎盤細胞膜胰島素受體的結合曲線。
實施例1.豬胰島素前體(PIP)基因的突變採用標準的克隆步驟(Sambrook J，et al.(eds.)MolecularcloningA laboratory manual，1989，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)，突變的原理與步驟如圖1所示。大腸桿菌JM103在2YT培養基中生長，用氯化鈣方法轉化。質粒pVT102-U為Thierry Vernet(Biotechnology Research Institute，Montreal)所贈，Saccharomyces cerevisiae XV700-6B(Leu2，Ura3，Pep4)為Michael Smith(University of British Columbia，Vancouver)所贈，在YPD培養基中生長，用醋酸鋰方法轉化。轉化的酵母細胞用選擇培養基(2％瓊脂，0.75％酵母含氮鹼基，2％葡萄糖和各100μg/ml的胺基酸)選擇。
突變引物為5′-CTTGTGCGGTGAAGACTTGGTTGAGGC-3′，其中B9Ser和B10His密碼子TCC和CAC，在引物中分別用Glu和Asp的密碼子GAA和GAC代替。含尿嘧啶單鏈DNA按Sambrook等(Sambrook J，et al.(eds.Molecular cloningA laboratory manual，1989，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)方法製備，參照李等(李亦平等，生物工程學報，1987，390)方法，用缺口雙鏈DNA方法進行基因的定位突變。
按Sanger等(Sanger FG，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1977，475463)方法測定突變子的DNA順序，結果表明突變已正確發生(圖2)。並將它轉化到酵母菌。含突變基因的表達型質粒的酵母菌珠Saccharomyces cerevisiae YS92/pLL[B9E，B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC NOM95042)已保藏在中國典型培養物保藏中心(中國·武漢·武漢大學校內)。
實施例2.[B9Glu，B10ASp]PIP在酵母中的分泌表達及產物的分離純化將轉化的酵母細胞接種於5ml不含瓊脂的YPD培養基中，30℃培養一天後轉接到250mlYPD培養基，30℃繼續培養兩天表達[B9Glu，B10Asp]PIP，表達產物分泌於發酵液中，表達量用胰島素放射免疫藥盒(上海生物製品研究所產品)測定。離心去菌體，用三氯乙酸沉澱，沉澱用離心收集後溶解並通過SephadexG-50柱(2.6 x 100cm)分離，用1mole/L醋酸洗脫。收集[B9Glu，B10Asp]PIP峰，凍幹，進一步用HPLC分離獲得HPLC純(圖5a)和電泳純(圖4a)的[B9Glu，B10ASp]PIP。
實施例3.[B9Glu，B10ASp]PIP的胰蛋白酶轉肽及[B9Glu，B10Asp]人胰島素的鑑定將純化的[B9Glu，B10Asp]PIP溶解於1，4-丁二醇/二甲基亞碸/水(體積比70∶15∶15)，[B9Glu，B10Asp]PIP的濃度為50mg/ml，加克分子過量100倍的Thr(But)-OBut)。將溶液pH調至6.5，加TPCK-胰蛋白酶(為[B9Glu，B10Asp]PIP重量的五分之一)。反應液在25℃保溫6小時，加丙酮使蛋白質沉澱。用半製備柱RP-300在Beckman HPLC儀器上分離(圖6)，其中峰1為未反應的[B9Glu，B10Asp]PIP，峰2為去B30[B9Glu，B10Asp]人胰島素，峰3是轉肽產物B30Thr(But)OBut[B9Glu，B10Asp]人胰島素(圖4b)。收集峰3，用三氟乙酸去保護基即得[B9Glu，B10Asp]人胰島素(圖4b，圖5b)(蛋白濃度按276nm紫外吸收測定)。
取適量純化的[B9Glu，B10Asp]人胰島素樣品，用5.7N HCl於110℃水解24小時，蒸乾水解液，用胺基酸自動分析儀測定胺基酸組成。其胺基酸組成與理論值相符(表1)。
實施例4.[B9Glu，B10Asp]人胰島素的生物活力測定純化的[B9Glu，B10Asp]人胰島素與人胎盤細胞膜胰島素受體的結合能力按馮等(馮佑民等，生物化學與生物物理學報，1982，14137)方法測定，結果如圖7所示。以取代125I-胰島素50％時，所需未標記樣品的量計算，[B9Glu，B10Asp]人胰島素為豬胰島素的34.4％。
表1. [B9Glu，B10Asp]人胰島素的胺基酸組成分析胺基酸 [B9Glu，B10Asp]人胰島素Asp 3.896(4)*Thr 2.881(3)Ser 2.189(2)Glu 8.168(8)Gly 4.000(4)Ala 0.971(1)Val 4.088(4)Ile 1.998(2)Leu 6.173(6)Tyr 4.133(4)Phe 2.877(3)Lys 0.962(1)His 0.906(1)Arg 0.915(1)*括號中為理論殘基數。人胰島素的整體活力用半定量小白鼠驚厥法測定，其整體活力與豬胰島素相同(表2)。表2.豬胰島素和[B9Glu，B10Asp]人胰島素的體內小白鼠驚厥反應活力測定樣品 濃度(μg) 反應活力*豬胰島素 1.010/100.5 8/100.252/10[B9Glu，B10Asp]人胰島素 1.010/100.5 7/100.252/10*產生反應小鼠數目/給藥小鼠數目
權利要求
1.[B9Glu，B10Asp]人胰島素，其特徵在於胰島素的B鏈第9位與第10位胺基酸均為酸性胺基酸。
2.根據權利要求1所述的胰島素的B鏈第9位與第10位胺基酸均為酸性胺基酸，其特徵在於B鏈第9位是G1u，B鏈第10位是Asp。
3.根據權利要求1、2所述的胰島素，其特徵在於可用蛋白質工程的方法來製得。
4.根據權利要求1、2所述的胰島素，其特徵在於也可用化學合成的方法來獲得。
5.根據權利要求1至4所述的胰島素，其特徵在於類似物的體內生物活性與天然胰島素相同。
6.根據權利要求2所述的胰島素，其特徵在於含突變基因的表達型質粒的酵母菌珠Saccharomyces cerevisiae YS92/pLL[B9E，B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC NoM95042)。
全文摘要
本發明為一種利用蛋白質工程方法獲得的人胰島素——[B9Glu，B10Asp]人胰島素，其特徵在於B鏈第9位與第10位均為酸性胺基酸，[B9Glu，B10Asp]人胰島素的受體結合能力為豬胰島素的34.4％，體內生物活力則與天然胰島素基本相同。本發明很有希望作為單體速效胰島素應用於臨床。
文檔編號C07K14/435GK1155548SQ96116230
公開日1997年7月30日 申請日期1996年1月25日 優先權日1996年1月25日
發明者馮佑民, 梁鎮和, 唐月華, 劉濱, 張友尚 申請人:中國科學院上海生物化學研究所