一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用的製作方法

2023-10-11 20:02:14

一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用。本發明所提供的dsRNA，為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。實驗證明，飼餵羧酸酯酶基因dsRNA後，麥長管蚜羧酸酯酶基因有不同程度的降低，說明麥長管蚜通過口針攝入的dsRNA進入了麥長管蚜的細胞內發生了RNAi級聯反應，目的基因的表達受到了幹擾。在形態學角度來看，麥長管蚜的生長狀態均發生了變化，飼餵羧酸酯酶基因dsRNA的麥長管蚜的蛻皮指數比對照顯著降低。這表明羧酸酯酶基因dsRNA可以用於麥長管蚜的防治，本發明為下一步利用植物介導的RNAi技術創建小麥新種質奠定了基礎。
【專利說明】一種羧酸酯酶基因 dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種羧酸酯酶基因 dsRNA及其在防治麥長管蚜中 的應用。

【背景技術】
[0002] 小麥是我國的主要糧食作物。小麥田內害蟲種類很多，主要害蟲有地下害蟲、小 麥吸漿蟲、麥蚜、麥蜘蛛、食葉的粘蟲等，其中麥蚜對小麥的危害最為嚴重。麥蚜屬同翅目 蚜科，俗稱膩蟲、由汗、蜜蟲等，是我國小麥上的主要害蟲之一。其種類主要包括麥長管蚜 (Sitobion avenae)、麥二叉蟲牙（Schizaphis graminum)、禾穀溢管蟲牙（Rhopalosiphum padi Linnaeus)、麥無網長管姆（Acyrthosiphon dirhodum)等。麥長管姆、麥二叉姆和禾穀糹益管 蚜在世界各個地區廣泛分布，我國小麥種植區內均有發生。麥二叉蚜主要分布在西北、華北 地區，麥長管蚜危害南北麥區，禾穀縊管蚜在南方地區發生嚴重。麥蚜的發生受氣候影響較 大，在小麥生不同的生長期內，麥蚜的危害優勢種有所不同，在小麥拔節期，麥二叉蚜種群 密度大，到達抽穗期，麥長管蚜逐漸變為優勢種，麥二叉蚜與麥長管蚜混合發生，小麥抽穗 以後，禾穀縊管蚜發生嚴重。
[0003] 麥蚜以若蚜、成蚜聚集在小麥葉片、莖幹，吸食小麥汁液，造成小麥葉片出現黃斑 或枯萎，在苗期危害嚴重時造成小麥苗枯死，後期危害穗部，造成小麥籽粒乾癟，使小麥品 質變劣，產量降低。麥蚜排出的廢物覆蓋在葉片上使葉片變黑，光合作用受到嚴重影響。此 夕卜，麥姆還分泌毒素，傳播病害，嚴重影響小麥產量和品質。因麥姆的危害造成小麥減產一 般在10% -20%，麥蚜危害嚴重時小麥減產量達到30%。麥蚜還可以傳播小麥與大麥黃矮 病毒，使小麥產量降低。
[0004] RNAi的基本過程包括起始階段和效應階段。在起始階段，dsRNA穿過細胞膜進入 細胞後，細胞質中的一種RNA酶III家族的內切酶Dicer酶特異識別dsRNA，Dicer酶將dsRNA 切割成許多 21bp_23bp 的小片段（small interference RNA，siRNA)，每個 siRNA 都有 2 個突出的核苷酸。效應階段，siRNA與一個酶複合物形成一種沉默複合物（RNA-indueed sileneeing eomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，攜帶的雙鏈siRNA被RISC變成單鏈 siRNA分子，變成具有活性的RISC(Slicer)。之後Slicer與外源性基因表達的mRNA分子結 合，RISC在結合部位開始切割mRNA。切割後的mRNA誘導細胞降解這些mRNA片段。siRNA還 能引導目的RNA結合RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)，合成新的 dsRNA， 然後由Dicer酶切割產生新的siRNA，又引發新一輪的合成切割過程，沉默信號逐漸擴大。 [0005] 目前常用的dsRNA導入的方法有注射法、浸泡法、飼餵法、組織培養法、植物介導 法等。注射法是通過顯微注射儀將dsRNA導入到昆蟲體內，是目前最常用的方法。這種方 法既有優點又有缺點，優點是效率高，缺點是體外合成保存dsRNA成本高，難以避免注射的 傷口影響昆蟲生長。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆蟲組織或細胞，可以有效地抑制基因表 達。浸泡法有一定的局限性，只適合於昆蟲一定的發育階段和易吸收dsRNA的細胞組織， 在研究中應用較少。飼餵法操作方便且簡單，對昆蟲的影響小。餵食dsRNA在許多昆蟲中 都取得了成功，例如半翅目、鱗翅目、鞘翅目昆蟲。組織培養法將dsRNA混入培養基，昆蟲 細胞從培養基裡吸收dsRNA。目前利用這種方法取得成功的昆蟲有果蠅、埃及伊蚊、白紋伊 蚊。這種方法要求的培養基條件嚴格，不容易培養得到符合要求的細胞，對這種方法的使用 受一定限制。轉基因植物介導法是藉助植物持續不斷的產生穩定的dsRNA，昆蟲持續取食 這種植物會不斷的攝入dsRNA。但是這種方法也有一定的局限性，不同昆蟲或同一昆蟲的 不同基因對通過口腔進入的RNAi的敏感性不同，影響餵食dsRNA的成功率的關鍵因素是昆 蟲的上皮細胞攝入dsRNA的效率。Walshe等發現利用餵食方法可以抑制刺舌蠅（Glossina morsitans morsitans)中腸表達TsetseEP,卻不能抑制脂肪體的傳遞蛋白基因2A192的表 達。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種羧酸酯酶基因（CarE基因）dsRNA及其在防治麥長管蚜 中的應用。
[0007] 本發明所提供的dsRNA，具體為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補序 列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。
[0008] 編碼所述dsRNA的DNA分子也屬於本發明的保護範圍。
[0009] 所述DNA分子的核苷酸序列具體為序列表中序列2。
[0010] 含有所述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞系也屬於本發明 的保護範圍。
[0011] 所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表達盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞 系，在如下（al)_(a4)任一中的應用也屬於本發明的保護範圍：
[0012] (al)防治麥長管蚜或製備防治麥長管蚜的產品；
[0013] (a2)抑制麥長管蚜生長或製備抑制麥長管蚜生長的產品；
[0014] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數或製備降低麥長管蚜蛻皮指數的產品；
[0015] (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達或製備抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達的 產品。
[0016] 進一步，所述應用為將所述dsRNA導入麥長管蚜，從而實現防治麥長管蚜、抑制麥 長管蚜生長、降低麥長管蚜蛻皮指數或抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達。
[0017] 在本發明中，所述導入的方式具體為飼喂。
[0018] 更加具體的，所述飼餵為：將所述dsRNA混合於液體飼料中，得到混合液；用所述 混合液飼餵麥長管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的終濃度具體為20ng/μ L。
[0019] 所述飼餵持續的時間可為6天以上，具體如6天。
[0020] 在本發明中，所述麥長管蚜具體為4齡至成蟲期的麥長管蚜，具體如4齡麥長管蚜 或麥長管姆成蟲。
[0021] 活性成分為如下A-C中任一種的產品也屬於本發明的保護範圍：
[0022] A、所述 dsRNA;
[0023] B、所述DNA分子；
[0024] C、所述表達盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞系；
[0025] 所述產品具有如下（al)-(a4)功能中的至少一種：
[0026] (al)防治麥長管蚜；
[0027] (a2)抑制麥長管蚜生長；
[0028] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數；
[0029] (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達。
[0030] 另外，抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達的物質，在如下（al)_(a3)任一中的應用 同樣屬於本發明的保護範圍：
[0031] (al)防治麥長管蚜或製備防治麥長管蚜的產品；
[0032] (a2)抑制麥長管蚜生長或製備抑制麥長管蚜生長的產品；
[0033] (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數或製備降低麥長管蚜蛻皮指數的產品。
[0034] 本發明將麥長管蚜CarE基因 dsRNA (序列1)採用體外飼餵的方法飼餵麥長管蚜， 實際上是利用RNAi技術對CarE基因的表達進行幹擾。結果顯示，從mRNA水平上檢測飼餵 後的麥長管蚜CarE基因有不同程度的降低，說明麥長管蚜通過口針攝入的dsRNA進入了麥 長管蚜的細胞內發生了 RNAi級聯反應，目的基因的表達受到了幹擾。在形態學角度來看， 麥長管蚜的生長狀態均發生了變化，飼餵CarE基因 dsRNA的麥長管蚜的蛻皮指數比對照降 低。這表明CarE基因 dsRNA可以用於麥長管蚜的防治，本發明為下一步利用植物介導的 RNAi技術創建小麥新種質奠定了基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為麥長管蚜總RNA的提取結果。
[0036] 圖2為麥長管蚜羧酸酯酶基因（CarE基因）cDNA片段的PCR擴增。M為標準DNA marker ; 1 為 CarE 基因。
[0037] 圖3為體外轉錄所得麥長管蚜CarE基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA的瓊脂糖凝膠 電泳結果。M :D2000plus ;1 :麥長管蚜CarE基因體外轉錄產物dsRNA ;2 :GFP基因體外轉錄 產物dsRNA ;可以看到，得到目的轉錄產物。
[0038] 圖4為不同齡期麥長管蚜CarE基因的表達量分析。其中，L1-L4為1-4齡麥長管 蟲牙幼蟲，Adult為麥長管蟲牙成蟲。圖中，*表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01。
[0039] 圖5為不同濃度的dsCarE飼餵麥長管蚜後CarE基因的表達水平分析。圖中，*表 示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0040] 圖6為飼餵dsCarE後不同處理組中麥長管蚜的存活率統計。圖中，*表示Ρ〈0. 05， ** 表示 Ρ〈〇· 01。
[0041] 圖7為飼餵dsCarE 6天後不同處理組中麥長管蚜的蛻皮指數統計。圖中，*表示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0042] 圖8為飼餵dsCarE 6天後不同處理組中麥長管蚜CarE基因的表達水平分析。圖 中，* 表示 P〈〇. 05, ** 表示 P〈0. 01。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045] 麥長管姆（Sitobion avenae):從中國農業大學上莊實驗站小麥試驗田獲得，按 照"王春芝，3種小麥蚜蟲的形態識別與防治技術，農技服務，2008, 25 (3) :50, 58" 一文記載 的方法，鑑定證實確為麥長管姆（Sitobion avenae)。其形態學特徵如下：無翅孤雌姆體長 3. 1mm，寬1.4mm，長卵形，草綠色至橙紅色，有時頭部帶紅色或褐色，腹部兩側有不明顯的灰 綠至灰黑色斑。觸角黑色，第3節有8 -12個感覺圈排成一行。腹部第6-8節及腹面具橫 網紋，無緣瘤。喙粗大，黑色，長度超過中足基節。腹管長圓筒形，黑色，長為體長的1/4,在 端部有十幾行網紋。有翅孤雌蚜體長3. Omm，橢圓形，綠色。喙不達中足基節。腹管長圓筒 形，黑色，端部具15?16行橫行網紋，尾片長圓錐狀，有8?9根毛。若蚜體綠色，有時粉紅 色，複眼紅色，一般體較短。麥長管姆的飼養條件是：溫度（22±1)°C，光周期16 L : 8 D， 相對溼度控制在85 % -90 %。用溫水浸泡小麥種子4h-8h，然後將小麥種子種在直徑8cm， 高為12cm的花盆中，放在人工氣候培養箱中培養（溫度22±1°C，光周期16 L : 8 D，RH 85% -90% )。待5天後，小麥葉片長出約5cm時在小麥上接蚜蟲。
[0046] pEGAD質粒：GenBank N0:AF218816. 1，購於美國俄亥俄州立大學。在文獻"Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency" Proc Natl Acad Sci USA. 97(7)，3718-3723(2000) 中報導過。
[0047] 總 RNA 提取試劑 TRIzol，FastQuant RT Kit (With gDNase)，PCR 產物純化試劑 盒，質粒小提試劑盒、突光定量試劑SuperReal PreMix(SYBR Green)均購自天根生化科技 (北京）有限公司。T 載體 PMDl9-T Simple Vector、Ex Taq? 購自 TaKaRa。?7 RiboMAX expression RNAisystem購自promega。2 X Taq MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限 公司。乙醇、異丙醇均為國產試劑。
[0048] 麥長管蚜的人工飼料：製備過程可參考文獻"李彩霞，高麗鋒，高玲玲，李 潤植.全純人工營養液飼養蚜蟲的研究.山西農業大學學報，1997, 17(3) :225-228. Li C X, Gao L F, Gao L L, Li R Z. Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets. Journal of Shanxi Agricultural University, 1997, 17(3):225-228. (in Chinese) "進行，用0. 2 μ m的細菌過濾器過濾人工飼料，分裝到2. 0 mL滅菌的離心管保存 於-20°C的冰箱中，避免反覆凍融。
[0049] 實施例1、麥長管蚜羧酸酯酶基因 dsRNA的獲得
[0050] -、麥長管蚜總RNA的提取及反轉錄
[0051] 1、總 RNA 提取
[0052] 1)取50頭麥長管姆放入無 RNA酶的I. 5 mL EP離心管中，加入60 μ LTrizol Reagent,用電動研磨器研磨至勻楽狀態；
[0053] 2)取出1-2 μ L總RNA進行L 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，同時用NanoDrop測定 260/280吸光值、260/230吸光值和核酸濃度，剩餘的放於-80°C備用。
[0054] 結果如圖1所示，可見提取的總RNA比較完整，總RNA的5S、18S、28S條帶比較清 晰，RNA未降解。
[0055] 2、反轉錄
[0056] 按反轉錄試劑盒進行操作，操作如下：
[0057] (1)配製基因組 DNA 去除體系混合液：5 X gDNA buffer 2 μ 1 ;總 RNAl μ g ;RNase free ddH20 補足 10 μ 1。
[0058] 42°C孵育3min，冰上放置。
[0059] (2)配製反轉錄反應體系混合液：RT Enzyme Mix 1 μ I ;10XFast RT buffer 2μ I ;FQ_RT Primer Mix 2μ I ;RNasefree ddH20 補足 10μ 1。
[0060] (3)將步驟⑴配得的混合液加入步驟⑵中配得的混合液中，充分混勻。42°C孵 育15min之後95°C孵育3min。將反轉錄後得到的cDNA存放於-20°C保存。
[0061] 二、含有麥長管蚜羧酸酯酶基因片段的重組質粒的構建
[0062] 根據棉蚜的羧酸酯酶基因（CarE基因）（GenBank登錄號：EU783916. 1)序列設計 引物，引物如下：
[0063] 引物 CarE-F :5' -TACCCTACGCTCAACCAC-3'（序列 5 的第 1-18 位）；
[0064] 引物 CarE-R :5' -GAACAGACGCTGATCCTG-3'（序列 5 的第 469-486 位的反向互補序 列）。
[0065] 以步驟一反轉錄所得cDNA為模板，採用引物CarE-F和CarE-F進行PCR擴增。反 應條件是：94°C 3min ;94°C 30s、55°C 30s、72°C 40s，38 個循環；72°C lOmin。
[0066] 將所得PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。如圖2所示，可見PCR產物大小約為486bp。 將PCR產物膠回收後與pMD19-T Simple Vector相連，得到重組質粒，命名為pMD19-CarE。 測序表明，重組質粒pMD19_CarE在pMD19_T Simple Vector的缺口處連入了序列表中序列 5所示DNA片段。
[0067] 三、麥長管蚜羧酸酯酶基因 dsRNA的獲得
[0068] 1、引物的設計
[0069] 體外合成dsRNA需要帶有T7序列的引物，利用Primer5. 0設計併合成如下引物：
[0070] 針對CarE基因的引物對如下：
[0071] dsCarEFt :5' -TAATACGACTCACTATAGGGGATGGTCTGGAGTTTT-3' (無下劃線部分為序 列2的第1-17位）；
[0072] dsCarERt : 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGAACAGACGCTGATCCTG-3 '（無下劃線部分為 序列2的第410-427位的反向互補序列）。
[0073] 針對作為對照的GFP基因的引物對如下：
[0074] dsGFPFt : 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3 '（無下劃線部分為 序列4的第1-19位）；
[0075] dsGFPRt :5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGTTC-3 '（無下劃線部分為 序列4的第402-420位的反向互補序列）。
[0076] 引物中標有下劃線的序列為T7啟動子序列。
[0077] 2、合成DNA模版
[0078] 將步驟二所得重組質粒pMD19_CarE稀釋成濃度為5ng/ μ 1，作為模板，用帶有T7 啟動子序列的引物對dsCarEFt/dsCarERt做PCR合成帶有Τ7序列的DNA。
[0079] 將pEGAD質粒稀釋成濃度為5ng/l·! 1，作為模板，用帶有T7啟動子序列的引物對 dsGFPFt/dsGFPRt做PCR合成帶有T7序列的DNA。
[0080] PCR反應體系：2XTaq Master Mix 10μ I ;ddH20 8 μ 1 ;上遊引物 0· 5μ 1 ;下遊引 物 〇. 5μ1 ;模板 Ιμ?。
[0081] 反應條件：94°C 3min ;94°C 30s、53°C 30s、72°C 40s，38 個循環；72°C lOmin。
[0082] 反應結束後進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，採用引物對dsCarEFt/dsCarERt 擴增得到大小約為465bp的DNA片段，進一步測序為"TAATACGACTCACTATAGG+序列 2+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。採用引物對 dsGFPFt/dsGFPRt 擴增得到大小約為 458bp 的 DNA 片段，進一步測序為 "TAATACGACTCACTATAGG+ 序列 4+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。
[0083] 3、合成 dsRNA
[0084] 以步驟2獲得的兩端帶有T7啟動子序列的DNA片段為模板，利用T7 RiboMAX expression RNAisystem(promega)試劑盒體外高效轉錄生成麥長管姆的dsRNA片段。
[0085] 體外轉錄的（T7RiboMax)反應體系：RiboMaxTM Express T72 X bufferlO μ L ;DNA 模版 I U g ;Enzyme Mix 2 μ L ;RNase Free 水補充至 20 μ L。
[0086] I)將上述溶液輕輕混勻，置於37°C中金屬浴中孵育2hr-6hr ;
[0087] 2)孵育結束後將反應液放於70°C水浴IOmin,緩慢降至室溫,約20min ;
[0088] 3)向冷卻至室溫的反應液中加入1 μ L RQl RNase-Free DNase和1 μ L RNase Solution (RNase Solution 稀釋 200 倍）去除模板 DNA 和單鏈 RNA，37°C溫浴 30min ;
[0089] 4)加入與管中溶液等體積的3M醋酸鈉水溶液，冰浴5min ;
[0090] 5) 15000rpmin 離心 IOmin ;
[0091] 6)棄上清，用500 μ L 70% (體積分數）乙醇洗兩次，棄上清，空氣中乾燥15min， 加 50 μ L RNase Free 水溶解；
[0092] 7)將產物電泳檢測後，放於_80°C超低溫冰箱中保存。
[0093] 反應結束後，取反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0094] 結果如圖3所示，M :D2000plus ;1 :麥長管蚜CarE基因體外轉錄產物dsRNA ;2 : GFP基因體外轉錄產物dsRNA ;可以看到，得到目的轉錄產物。
[0095] 將麥長管蚜CarE基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA分別測序，結果如下：
[0096] 麥長管蚜CarE基因 dsRNA為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸 序列為序列表中的序列1，其反義鏈的核苷酸序列為序列表中的序列1的反向互補序列；
[0097] GFP基因 dsRNA為雙鏈RNA，由正義鏈和反義鏈組成，其正義鏈的核苷酸序列為序 列表中的序列3,其反義鏈的核苷酸序列為序列表中的序列3的反向互補序列。
[0098] 當然，也可以直接人工合成序列1所示的麥長管蚜CarE基因 dsRNA和序列3所示 的GFP基因 dsRNA用於下述實施例。
[0099] 實施例2、麥長管蚜CarE基因 dsRNA在防治麥長管蚜中的應用 [0100] 一、不同齡期麥長管蚜CarE基因的表達量分析
[0101] 在做飼餵實驗之前，挑取處於不同齡期的麥長管蚜分別檢測CarE基因的表達量。 每個齡期（1齡幼蟲、2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲和成蟲）選取20頭左右的蚜蟲提取總RNA 然後檢測基因表達量。
[0102] 利用Primer5. 0分別設計不同基因的螢光定量引物，螢光定量引物如下：
[0103] 用於檢測麥長管蚜CarE基因的引物：
[0104] CarERTF :5, -TCCTGGAAACGTGGGCTTGAA-3'（序列 2 的第 300-320 位）；
[0105] CarERTR :5' -AACAGACGCTGATCCTGCACTTT-3'（序列 2 的第 404-426 位的反向互補 序列）。
[0106] 用於檢測內參基因 RpL7Actin的引物：
[0107] 內參基因 RpL7ActinF :5' -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3' ；
[0108] 內參基因 RpL7ActinR :5' -GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3'。
[0109] 採用的螢光定量試劑盒為SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)，所用的PCR反應 體系為：2 X SuperReal PreMix Plus 10 μ L，50 X ROX Reference Dye 2 μ L，ddH20 5.8 μ L， 上遊引物F 0. 6yL，下遊引物0. 6yL，cDNA模板lyL。擴增反應條件為：94°C 15min ; 94°〇1〇8,571：2〇8,721：3〇8,40個循環。每個樣本重複3次，最後結果用2-^"法（(^表示 循環數）進行計算，AACt=(目的基因的Ct-內參基因的目的基因的Ct-內 參基因的Ct)對照組，對照組是將1齡幼蟲的Δ Ct = Ct目的基因 _Ct _基因定乂為1. 0,其餘齡期 作為實驗組，計算各組的平均值，進行差異顯著性分析。
[0110] 結果如圖4所示，可以看出，4齡、成蟲的CarE基因表達量顯著高於其他齡期 (P〈0. 05)，說明從若蟲到成蟲，麥長管蚜的CarE基因的表達量逐漸升高，到若蟲末齡和成 蟲期CarE基因表達量達到高峰，CarE的解毒作用最強。後續試驗中採用4齡麥長管蚜作 為研究對照。
[0111] 二、dsRNA的飼餵及最佳飼餵濃度的確定
[0112] 1、麥長管蚜的dsRNA飼餵方法
[0113] 飼餵麥長管蚜時採用的是兩端開口直徑為2-3. 5cm、長度為3-4cm的玻璃通管。將 Parafilm膜截成I. 5cm2,用手拉展開膜覆蓋在玻璃管的一端，放在紫外燈下照射15分鐘，然 後在Parafilm膜表面加上150 μ L的人工飼料或者是人工飼料與dsRNA的混合液，再在其上 面另覆蓋一層Parafilm膜。將麥長管蚜放入管內，玻璃管的另一端用細棉紗網封住以防止 蚜蟲逃逸。將玻璃管放到光照培養箱中飼養，溫度22°C ±1°C，相對溼度為85%?90%， 光周期16 : 8(L : D)。選用同齡的蚜蟲為供試群體，飢餓4小時左右後接入玻璃管內，每 管內接麥長管蚜15頭，每個處理重複2管，實驗重複3次。
[0114] 2、飼餵濃度的確定
[0115] 為了確定比較合適的CarE基因 dsRNA的飼餵濃度，先採用三個不同濃度的dsRNA 飼餵麥長管蚜（4齡幼蟲），飼餵實驗在飼餵6天後檢測基因的表達量（具體操作參見步驟 一）。採用三組不同的CarE基因 dsRNA終濃度分別為Srig/yLaOng/uLdOng/yL(以 5ng/ μ L為例，為將CarE基因 dsRNA與人工飼料混合，形成混合液，CarE基因 dsRNA在所述 混合液中的終濃度為5ng/yL。其餘濃度所表示含義以此類推）。在實驗中以相同濃度的 GFP基因 dsRNA的飼餵為對照。將IOng/ μ L GFP基因 dsRNA組的Λ Ct = Ct __-Ct _基 H定義為1. 〇,計算各組的平均值，進行差異顯著性分析。
[0116] 結果顯示，採用三種不同濃度的CarE基因 dsRNA飼餵麥長管蚜時，與對照相比，麥 長管蚜的CarE基因表達量只有在20ng/μ L的濃度下才顯著降低（P〈0. 05)，所以在後續實 驗中採用20ng/ μ L這個濃度對麥長管蚜進行RNA幹擾實驗（圖5)。
[0117] 三、dsRNA飼餵後麥長管蚜存活率、蛻皮指數及CarE基因表達量的測定
[0118] 1、實驗方法
[0119] 以4齡麥長管蚜為研究對象，參照上文所述方法對其進行dsRNA飼喂，dsRNA的 濃度選用20ng/ μ L，同設置3個處理，即CarE基因 dsRNA飼餵組（簡稱dsCarE)、GFP基 因 dsRNA飼餵組（簡稱dsGFP)、以及向人工飼料中加入等量的DEPCH2O的對照組。共飼餵 6天。用dsRNA飼餵蚜蟲後每天觀察麥長管蚜的生長狀態，記錄麥長管蚜的存活數和蛻皮 數。每天計算每個處理的麥長管蚜的存活率，飼餵6天後計算每個處理的麥長管蚜的蛻皮 指數。另外，飼餵6天後檢測每個處理的麥長管蚜CarE基因的表達量，其中AACt =(目 的基因的Ct-內參基因的Ct) -(目的基因的Ct-內參基因的Ct) ，將DEPCH2O對照 組的Λ Ct = Ct g_H-Ct _?Η定義為1. 0, dsCarE飼餵組和dsGFP飼餵組作為實驗組,計 算各組的平均值，進行差異顯著性分析。
[0120] 計算公式如下：
[0121] 存活率=前一天的存活蟲數/當天的存活蟲數X 100% ;
[0122] 蛻皮指數（Im) = Σ (蛻皮數/前一天的存活蟲數）。
[0123] 2、實驗結果
[0124] (1)麥長管蚜存活數
[0125] 結果顯示，在進行飼餵試驗的6天時間內，dsCarE處理組的麥長管蚜存活率均與 對照組相比差異不明顯（P>〇. 05)。分析原因可能有以下幾種：一是選取的幹擾片段不能使 蚜蟲的數量迅速降低；二是選取的CarE基因片段翻譯的蛋白不是蚜蟲存活所必須的蛋白。 結果詳見圖6。
[0126] (2)麥長管蚜蛻皮指數
[0127] 結果顯示，dsCarE飼餵能顯著降低麥長管蚜的蛻皮指數（P〈0. 05)，阻礙麥長管 蚜的生長，dsCarE處理組麥長管蚜的蛻皮指數為I. 34±0. 05 (平均值土標準誤），dsGFP 對照組的蛻皮指數為1.73±0. 07 (平均值土標準誤），DEPCH2O對照組的蛻皮指數為 1.75±0. 10(平均值土標準誤）。結果詳見圖7。
[0128] (3) CarE基因的表達量
[0129] 結果顯示，與對照相比，dsCarE處理組的麥長管蚜的CarE基因表達量降低，顯著 低於dsGFP處理組和DECH 2O對照組（P〈0. 05)。結果詳見圖8。
[0130] 本發明受農業部行業項目"作物蚜蟲綜合防控技術研究和示範推廣（201103022) " 的支持。
【權利要求】
1. 一種dsRNA，為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組 成的雙鏈RNA。
2. 編碼權利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中序列2。
3. 含有權利要求2所述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞系。
4. 權利要求1所述的dsRNA、或權利要求2所述的DNA分子、或權利要求3所述的表達 盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞系，在如下（al)-(a4)任一中的應用： (al)防治麥長管蚜或製備防治麥長管蚜的產品； (a2)抑制麥長管蚜生長或製備抑制麥長管蚜生長的產品； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數或製備降低麥長管蚜蛻皮指數的產品； (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達或製備抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達的產品。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於：所述應用為將權利要求1所述的dsRNA導 入麥長管蚜，從而實現防治麥長管蚜、抑制麥長管蚜生長、降低麥長管蚜蛻皮指數或抑制麥 長管蚜羧酸酯酶基因表達。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於：所述導入的方式為飼喂。
7. 根據權利要求6所述的應用，其特徵在於：所述飼餵為：將所述dsRNA混合於液體飼 料中，得到混合液；用所述混合液飼餵麥長管蚜； 所述dsRNA在所述混合液中的終濃度為20ng/ μ L ; 所述飼餵持續的時間具體為6天以上。
8. 根據權利要求4-7中任一所述的應用，其特徵在於：所述麥長管蚜為4齡至成蟲期 的麥長管蚜。
9. 產品，其活性成分為如下A-C中任一種： Α、權利要求1所述的dsRNA ; B、 權利要求2所述的DNA分子； C、 權利要求3所述的表達盒、重組載體、重組菌或轉基因系細胞系； 所述產品具有如下（al)_(a4)功能中的至少一種： (al)防治麥長管蚜； (a2)抑制麥長管蚜生長； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數； (a4)抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達。
10. 抑制麥長管蚜羧酸酯酶基因表達的物質，在如下（al)_(a3)任一中的應用： (al)防治麥長管蚜或製備防治麥長管蚜的產品； (a2)抑制麥長管蚜生長或製備抑制麥長管蚜生長的產品； (a3)降低麥長管蚜蛻皮指數或製備降低麥長管蚜蛻皮指數的產品。
【文檔編號】C12N15/63GK104293809SQ201410474665
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】趙章武, 梁榮奇, 鄧菲 申請人:中國農業大學