一種提高基因工程異戊醯螺旋黴素主組分含量的基因串連技術的製作方法

2023-10-11 00:42:29

專利名稱：一種提高基因工程異戊醯螺旋黴素主組分含量的基因串連技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術在提高抗生素組分中的應用。
背景技術：
必特螺旋黴素(原名生技黴素)[專利號zl97104440.6]是本實驗室利用基因工程技 術研製的螺旋黴素衍生物。螺旋黴素是一個大環內酯類抗生素，其主核是一個由16元環 組成的內酯環與普拉特內酯同質，含有三個糖分子福洛糖胺、碳黴糖胺和碳黴糖，而必 特螺旋黴素主組分是螺旋黴素碳黴糖4'位羥基被異戊醯基酯化的衍生物。由於螺旋黴素
內酯環3位r羥基可以被乙醯或丙醯基酯化，而形成相應的螺旋黴素i、 n、 m組分， 所以必特螺旋黴素至少含有異戊醯螺旋黴素i、 n、 m三個組分，必特螺旋黴素主組分
的化學結構如下
OR'
福洛糖胺
普拉特內酯
碳黴糖胺
必特螺旋黴素結構
碳黴糖
異戊醯螺旋黴素ni 異戊醯螺旋黴素n 異戊醯螺旋黴素i
r=c0ch2ch3
r=c0ch3
r=h
r' =c0ch2ch(ch3): r' =c0ch2ch(ch3): r, =c0ch2ch(ch3):
必特螺旋黴素對革蘭氏陽性菌有較強的活性，尤其對支原體、衣原體活性強，對紅黴素和(3-內醯胺類抗生素耐藥菌、流感桿菌、軍團菌、產氣莢膜梭菌具有抗菌活性，與 同類藥沒有完全交叉耐藥性。必特螺旋黴素有較高的親脂性，口服吸收快，組織滲透性 強，分布廣，體內維持時間長，有較好的抗生素後效應。目前已完成的基因工程必特螺 旋黴素二期臨床試驗研究表明，必特螺旋黴素治療上呼吸道感染的總有效率為93%，與 目前臨床使用的同類最好對照藥阿奇黴素無差異，並有抗泌尿道感染的潛在應用價值。 必特螺旋黴素作為國家一類新藥，現己完成臨床三期試驗研究，顯示了良好的療效和安 全性。
必特螺旋黴素是基因工程菌的發酵產物，其形成需要以下幾個要素和步驟 首先，由螺旋黴素產生菌發酵產生螺旋黴素；
其次，從碳黴素產生菌克隆碳黴糖4'位羥基異戊醯基(ist)轉移酶基因； 再次，將ist基因轉入螺旋黴素產生菌獲得基因工程菌；
最後，ist基因表達產物(酶)在螺旋黴素產生菌中有脂肪醯(異戊醯)基團底物 存在的情況下，能夠催化螺旋黴素分子中的碳黴糖4'位羥基，進行O —醯基化反應，使 碳黴糖4'位羥基異戊醯酯化,而這種碳黴糖4'異戊醯酯化的螺旋黴素即稱為必特螺旋 黴素。由於微生物發酵過程中有多種脂肪醯代謝物存在，如乙醯、丙醯、丁醯等，而異 戊醯基(ist)轉移酶基因雖然主要識別異戊醯，但對其它脂肪醯基的識別具有一定的寬 容性，因此，在發酵過程中，螺旋黴素碳黴糖4'位羥基還可能被乙醯化、丙醯化和丁醯 化，形成乙醯、丙醯和丁醯螺旋黴素等組分。為了使必特螺旋黴素成品中的異戊醯成為 其主組分(新藥申報質量標準要求，其異戊醯螺旋黴素含量不應低於65%)，通常需要在 發酵液提取過程中增加水洗提取液的次數，然而，每次水洗均會降低提取收率，增加生 產成本。所以，抗生素髮酵過程產物多組分問題給生產中的後提取工藝及質量標準控制 帶來諸多困難與挑戰。如果能從源頭提高菌種合成主組分的能力，對於簡化提取流程， 降低生產成本，改善環境保護和優化質量標準控制具有顯著的經濟效益和社會效益。
螺旋黴素是由螺旋鏈黴菌(S.印z'raw;;cetoMS)或產二素鏈黴菌 Caw6o/ade"s)產生 的。螺旋黴素生物合成基因簇(長度約90kb)已得到克隆[FKarrayetalMicrobilogy 2007，153:4111-4122]，其大環內酯主核系由約40kb的聚酮合酶I型基因產物介導合成， 包括5個閱讀框(SrmGI、 II 、 HI、 IV、 V)，它們利用4個丙二醯CoA、 1個乙基丙 二醯CoA、l個甲基丙二醯CoA和一^^甲氧基丙二醯CoA組成大環內酯;5個基因(orf5承、 orf22c、 orf23c、 orf24c和orf25c)與甲氧基丙二醯攜帶蛋白相關； 一個編碼p450基因
5(orfl)與C20位羥基化有關； 一個編碼醯基轉移酶基因(orf6*)與內酯環羥基醯基化 形成螺旋黴素n和in組分相關;orf31編碼酮基還原酶與內酯環C9酮基還原有關，C9位 酮基被還原為羥基後進而被糖基化，形成福洛糖胺內酯。在螺旋黴素生物合成基因簇中， orfl承c、 orf2陽8、 orf9c 、 orfl2、 orfl5c、 orfl9、 orf20、 orf21c禾口 orf27等15個基 因與螺旋黴素分子中三個糖基的合成相關；orf3*c、 orf2*c、 orfl6-18和orf26等編碼 糖基轉移酶；此外，還有orf751^、 orfllc (srmB)和orf29與抗性相關；orf10 (srmR)、 orfl3c 、 orf28c和orf32c為螺旋黴素生物合成的調節基因。已知螺旋黴素產生菌除了產 生螺旋黴素以外，還產生一種角聚酮類化合物，其生物合成由PKSII酶基因介導[PangX et al Antimicrob. Agents Chemother. 2004，48(2):575-588]。
異戊醯螺旋黴素是由異戊醯基轉移酶介導，使螺旋黴素異戊醯基化而產生的。因此， 異戊醯螺旋黴素的產量依賴於螺旋黴素的產量，同時，異戊醯基轉移酶的活性，直接影 響螺旋黴素的轉化率和異戊醯螺旋黴素的產率，而異戊醯基轉移酶的活性，又受基因劑 量、基因啟動子強度和環境因素(即發酵條件)的調節。
基因劑量即基因拷貝數，對基因表達水平有重要影響。 一般而言，質粒載體的高拷 貝數常與目的基因的劑量相對應。許多報導表明，質粒拷貝數的增加可以使目的蛋白產 量得到提高[Coronado C et al Plasmid 1994, 32:336-341, Sl)en SH et al PNAS 1984， 1:4627-4631];有人利用雙拷貝人oc型心鈉素基因，在大腸桿菌中提高了心鈉素的 分泌表達[周春燕等生物化學雜誌，1992, 8(1) :26-32];也有人曾構建了含8個串連重 復心鈉素基因表達載體，提高了心鈉素的產量[Lennick et al Gene 1987,61:103-112]。 基因拷貝數對腫瘤壞死因子TNF、破傷風毒素和鼠表皮生長因子在重組畢赤酵母中的表達 有明顯影響，Sreekrishna等分別將l、 10和20個拷貝的TNF基因整合在畢赤酵母的染 色體上，TNF表達水平分別為0. 05、 4. 0和10g/L， 20個拷貝的TNF重組子的表達水平是 單拷貝的200倍。14個破傷風毒素基因串連整合在畢赤酵母染色體的重組子表達水平比 單拷貝的提高了 6倍[Clare J J et al Biotechnol. 1991， 9:455-460]。整合19個拷貝 的鼠表皮生長因子在重組畢赤酵母中的表達水平提高了 13倍[Clare J J et al Gene 1991， 105:205-212]。有報導說，在棒狀鏈黴菌(5". c7arah'gertAs5W-")將棒酸生物合 成正調控基因CcaR在染色體整合使其增加了一個拷貝，導致棒酸產量提高了 1. 54倍[白 小佳等食品研究與開發2008,29(8):]。
啟動子是位於結構基因5'端上遊的一段DNA序列，能夠指導RNA聚合酶全酶(holoenzyme)同DNA模板正確結合，活化RNA聚合酶，啟動基因轉錄。RNA聚合酶同啟動 子結合的區域稱為啟動子區。在原核生物中一般為一10區和一35區。基因啟動子的結構 不同，包括啟動子一10區與一35區之間核苷酸數目的差異，會影響啟動子的活性。採 用不同啟動子，能夠影響基因轉錄活性，從而影響基因的表達。目前認為，紅黴素產生 菌(5"acc力aropo"印ora eryz^raea)中，抗性基因啟動子ermEp具有較強的啟動活性， Schmitt JohnT等比較了幾種不同結構的啟動子，包括化學合成的類似於大腸桿菌基因 保守序列啟動子，新黴素抗性基因aphl啟動子，黑色素基因melC啟動子，受硫鏈絲菌 素誘導的啟動子tipA和ermEp等在變鉛青鏈黴菌中對分泌表達澱粉酶抑肽 (tendamistat)的影響，結果表明，採用ermEp啟動子可獲得500mg/ml澱粉酶抑肽,化 學合成類似大腸桿菌啟動子可獲得10mg/ml的產量，melC啟動子為200mg/ml， tipA啟動 子為0. 5-40mg/ml的產量[Schmitt-John T etal .ApplMicrobial. Biotechnol.1992, 36(4):493-8]。
紅黴素抗性基因ermE有兩個啟動子ermEpl和ermEp2，前者的轉錄起始點緊挨ermE 起始密碼子GTG前面的鹼基G，其一10區的序列為TAGGAT， 一35區序列為TGGACA，兩者 相距14bp;ermEp2轉錄起始點位於ermE起始密碼子上遊72bp，其一10區序列為GAGGAT， —35區序列為TTGACG,兩者相距18bp。兩個啟動子的轉錄方向相同。將ermEpl-35區 的TGG密碼子實施缺失突變，更改為GGCACA序列，獲得了更強的啟動子ermE*p [Schmitt JT Applied Microbiology Biotechnology, 1992, 36: 493-498 ， Bibb MJ Molecular and General Genetics, 1986， 203: 468-478]。而ist基因啟動子在閱讀框起始密碼子ATG上 遊36bp —10區TAGACA和_35區上遊61bp TTGCCC，核糖體位點在上遊6bp GAGG [NCBI基因庫D3182]。
本發明的目的是，採用基因整合技術，將必特螺旋黴素基因工程菌中與螺旋黴素異 戊醯基化密切相關的ist基因進行串連，使ist基因在螺旋黴素產生菌中增加其拷貝數， 通過增強其基因劑量提高產生菌異戊醯基化能力;同時也利用強啟動活性的啟動子如紅 黴素抗性基因ermE啟動子序列替換原ist基因啟動子序列，以增強ist基因的表達，從
源頭提高基因工程菌產生異戊醯螺旋黴素主組分的比例。本發明所說的提高基因工程異 戊醯螺旋黴素主組分含量的基因串連技術，迄今為止，尚未見有國內外的相關報導
發明內容
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本發明提供的雙拷貝ist基因的串連，可以採用重複串連方式，將兩個帶自身啟動子的ist基因1和2片段進行串連；也可以將第一個帶自身啟動子的ist基因與第二個不 帶啟動子的ist基因進行串連，使轉錄能夠連續進行；為了實施以上方案，ist基因上遊引 物可以分別根據ist基因閱讀框起始密碼子ATG上遊，包括啟動子或不包括啟動子區進 行設計；ist基因下遊引物設計則可採用帶轉錄終止子和不帶轉錄終止子序列兩種方案， 在兩個ist基因連續轉錄的情況下，第一個ist基因下遊引物設計應該在終止密碼子附近， 不包含轉錄終止序列。以含有ist基因的pSW4質粒[ShangGuandongetal The J of antibiotics 2001 54(1):66-73]為模板，利用所設計的引物進行PCR，獲得兩個ist基因， 將兩個ist基因通過酶切位點進行連接實施其串連，同時加入選擇性標記基因，以便對基 因轉化子進行篩選。
本發明所提供雙拷貝ist基因與宿主菌染色體的整合，可以採用同源基因重組雙交換 或直接使用整合型質粒載體。前一方案中，為了使串連的ist外源基因能整合在螺旋黴素 產生菌的染色體上，可以在其兩側加上兩段與染色體DNA同源的片段。應當採用確實與 螺旋黴素生物合成不相關的基因片段進行同源重組，以保證同源基因重組時不影響螺旋 黴素的形成。本發明採用前期從螺旋黴素產生菌克隆的PKSn基因，作為與宿主菌染色 體DNA同源重組的基因片段，根據PKSn基因序列設計兩對引物，在引物核苷酸序列 兩端加入與ist基因片段相連的相應酶切位點和克隆至載體的酶切位點。擴增兩段lkb左 右基因片段，分別連接在串連ist基因片段的兩側。PKSn基因來源於本實驗室的克隆 pCG4[唐莉等，生物工程學報，1991， 7 (1): 24]，基因序列已送交NCBI基因庫收 錄，編號為AY779544。
本發明所提供的另一方案是，採用整合型質粒載體，使雙拷貝ist基因直接整合在染 色體上。原則上可以採用多種鏈黴菌整合型載體，本發明採用pSET152載體[BiermaiiM etal Gene 1992,116:43-49]，它是一個可以在鏈黴菌/大腸桿菌中接合轉移質粒載體，含有 大腸桿菌的pUC18複製點，不含鏈黴菌的複製點，因而不能在其中以游離形式存在，而 是含有(DC31整合酶基因，以鏈黴菌噬菌體OC31附著位點整合至宿主菌的染色體進行復 制。將串連的ist基因克隆到鏈黴菌整合型載體，通過轉化轉入螺旋黴素產生菌，根據選 擇性標記及PCR驗證，可以確定串連ist基因在染色體的整合。
本發明還採用鏈黴菌強啟動子如紅黴素抗性基因ennE的啟動子ennEp，以提高串連 ist基因在宿主菌中的表達，繼而提高基因工程菌合成異戊醯螺旋黴素主組分的產率。 發明效果:
8本發明將異戊醯基轉移酶基因在螺旋黴素產生菌中串連表達，可以從源頭提高必特 螺旋黴素產生菌產生主組分異戊醯螺旋黴素的比例，從而大大簡化提取工藝，降低生產 成本，改善環境保護和優化質量標準的控制，產生明顯的的經濟和社會效益。


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圖l、同源重組雙交換ist基因雙拷貝質粒(pKC1139—5)的構建及基因整合示意圖
其中l一螺旋黴素產生菌原株染色體；2—同源重組雙交換ist基因雙拷貝在染 色體的整合；E、 K、 S、 H、 B、 X和P分別為-EcoRI、 Kpnl、 Sphl、 HindIII、 BamHI、 Xbal和PstI酶切位點。 圖2、整合型雙拷貝ist基因重組質粒pSET—4的構建
其中E、 K、 S、 Sa、 B、 X、 H和EV分別為EcoRI、 Kpnl、 Sphl、 Sall、 BamHI、 Xbal禾卩HindIII酶切位點。 圖3、整合型雙拷貝ist基因在變鉛青鏈黴菌表達轉化子轉化螺旋黴素產生異戊醯螺旋 黴素的HPLC分析。
其中A—必特螺旋黴素標準；B—螺旋黴素標準；C一pSET152—2 (ist單拷貝質 粒)在變鉛青鏈黴菌TK24的轉化子，對螺旋黴素異戊醯基化的HPLC分析；D— pSET152—4 (ist雙拷貝質粒)在變鉛青鏈黴菌TK24的轉化子，對螺旋黴素異戊 醯基化的HPLC分析；1， 2， 3-為異戊醯螺旋黴素i、 n、 m;i' ，2' ，3'為螺
旋黴素i 、 n、 m。
圖4、同源重組雙交換雙拷貝&基因PCR鑑定。
其中M—XDNA/HindlII酶切標記；1 —螺旋黴素產生菌原株； 2-6—新構建的含同源重組雙交換雙拷貝^基因工程菌株。
圖5、同源重組串連ist基因在螺旋黴素產生菌中提高異戊醯螺旋黴素組分的HPLC分析。 其中pSW4—對照；pKC11395 —同源重組雙拷貝ist基因工程菌。
實施方案:
以下給出的實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限 制本發明。
:兩個帶自身啟動子雙拷貝ist基因的串連
雙拷貝ist基因l和2的串連，採用包括其自身啟動子的重複串連方式，在ist基因 起始密碼子ATG上遊-129kb和終止子TAG下遊-41設計Pl-P2和P3-P4引物(表一)，以含有ist基因的pSW4質粒為模板，經PCR擴增出2個約1.3kb左右帶有不同酶切位點， 即istl基因(尺戸I—5awHI)和ist2基因(5a;n//1—片段，利用相同的5awHI 酶切位點可以實施雙拷貝帶自身啟動子ist基因之間的串連。 :雙拷貝ist基因串連轉錄的構建
在ist基因起始密碼子ATG上遊-lllbp和終止子TAG下遊-24bp(不包括轉錄終止序 列)設計P5-P6引物，在ATG上遊-105bp和終止子下遊-80bp (包括轉錄終止序列)設 計P7-P8引物(表一)，雙拷貝ist基因串連引物設計部位見圖1。以含有ist基因的pSW4 質粒為模板，經PCR分別獲得ist 3基因(含5amHLvY&al位點)和ist 4基因(含乃al-5WI 位點)片段，利用相同的J^al酶切位點，實施雙拷貝ist基因的串連。' :同源重組雙交換ist基因雙拷貝質粒(pKC1139-5)的構建
利用P9-P10引物以pCG4質粒為模板，經PCR擴增出l.lkb左右的同源片段H,，利 用P11-P12引物以pCG4質粒為模板，經PCR擴增出1.1kb左右的同源片段H2，用以構 建ist基因兩側同源重組雙交換的片段。用^ZwI-屍Wl酶切pWSl質粒[ShangGuandong et al The J of antibiotics 2001 54(1):66-73]，獲得長約1.3kb硫鏈絲菌素抗性基因 (Ts/)片段，作為同源重組雙交換的篩選標記。將&片段(五coR I-Xpw 1)、實施例l所 述的istl基因(K戸I-5flmHI)、 ist2基因(5ami/I-jaa I)以及Tsr"基因CHw ) 和H2(屍WI—州wdlII)片段直接連接到溫敏型質粒載體pKC1139質粒[BiermanM,etal. Gene， 1992， 116:43-49] ￡coR I—歷"d III位點上，轉化大腸桿菌DH5a [Takara公司]，通 過質粒提取、測序，獲得可進行同源重組雙交換的雙拷貝ist基因的重組質粒pKC1139-5 (圖1)。
表一 實施例1一3中所用引物的序列
~ 1 5，CGGGGTACCGCCGTGCAGCGGTGGGAAC3，(尺。"I)
P2 5 ，CGCGGATCCAACTCCACGGGCGCTGACGC3 ， (5a附H I)
P3 5 ，CGCGGATCCGCCGTGCAGCGGTGGGAAC3 ，
P4 5，CTAGTCTAGAAACTCCACGGGCGCTGACGC3，(倫I)
P5 5 ，-CGCGGATCCGCCGTGCAGCGGTGGGAAC-3 ，(醜amHI)
P6 5 ，CTAGTCTAGAGCACCGGTCGTCCCGCGTC-3 ，(勘I)
P7 5 ，國CTAGTCTAGAGCCGTGCAGCGGTGGGAAC-3'勘I
P8 5，-ACGCGTCGACGATCACACTCTTCGAGGAAC國3' &/I
P9 5 ，CCGGAATTCCAGGTCGCACTCAGGGTCG3 ，(五coRI)
P105 ， CGGGGTACCCCTCATCACGTCGGGTCGC3 ，(輛I)Pll5，ACATGCATGCGGGACGTGGAGCTACCG3， ，1) P125，CCCAAGCTTCCGCATAGTGGTGGCAG3， (//zwdl11)
5' CCGGAATTCTCCTCGGGACGGGTCAGC3 ， ( ￡coR I)
P13
:串連ist基因構建中的PCR反應
PCR反應的主要技術參數為反應體積20nl ，採用TakaRa公司LATaq酶和2xGC緩 衝液I;模板基因DNA取50-100ng; 96。C變性3min，退火溫度為61°C， 72。C延伸1.5 min， 進行30個循環，72。C延伸5min，結束反應。 :整合型強啟動子雙拷貝ist基因重組質粒的構建
從質粒pGH113 [莫宏波生物工程學報2004,20(5):662-666]中，將紅黴素抗性基因 啟動子區[BibbMJetal Gene, 1985,38:215-226]進行K; "I和5amM雙酶切，獲得279bp 片段，與實施例2中所述ist3基因(SamM-力fll)及ist4基因CY&al-Sa/I)片段進行連 接，並克隆於pUC18質粒(Promega公司)i^"I一Sa/1酶切位點，然後將外源片段以五coRI 一SphI酶切，再與pSET152質粒[Bierman M et al Gene 1992,116:43-49〗￡coRI—￡coRV 酶切片段進行半平末端化連接，獲得pSET152-4重組質粒(圖2)。以相似的方法，將ist 單基因克隆至pSET152載體，獲得pSET152-2重組質粒，作為對照。 <實施例6〉整合型強啟動子雙拷貝ist基因異源表達提高螺旋黴素異戊醯化活性確認
分別將ist單拷貝的pSET152—2對照及所構建的pSET152-4重組質粒轉入鏈黴菌通 用宿主菌變鉛青鏈黴菌(5: 7iwVa/7S TK24) [T Kieser et al Practical Str印tomyces Genetics The John Innes Foundation, Norwich, 2000，p425]。
取新鮮的變鉛青鏈黴菌斜面孢子接種於R2YE培養基[蔗糖10.3 %,葡萄糖1.0%， 酵母淨出液0.4%，胰蛋白腖0.2%，蛋白腖0.4% ，酪蛋白水解胺基酸0.4% ，K2S04 0.025 %，無水CaCl2 0.216%， KH2P04 0.005%, MgCl2.6H20 1.012%， 100ml培養基中加入 NaOH(lM) 0.5ml ， Tris-HC1(0.25M) pH7.2 10ml,微量元素溶液0.2ml (ZnCl2 0.004%, FeCl3.6H20 0.02%， CuCl2.2H20 0.001%， MnCl2.4H20 0.001 %， Na2B4O7.10H2O 0.001 %， (NH4)6Mo702.4H20 0.001%)]，用蒸餾水配製pH6.5， 37'C搖瓶振蕩培養48h，培養 物以10%的轉種量轉種於新鮮的補加了 2%甘氨酸的R2YE培養基中，28'C振蕩培養20h。 取10ml菌液於離心管中，3000r/min離心收集菌絲體，沉澱用P緩衝液[lmol/L Tris-HCl(pH8.0) 0.31ml， CaCl2.2H20 0.368%， MgCl2.6H20 0.204%，蔗糖10.3%，葡萄
11糖0.1 % ，微量元素0.2ml/100ml]， pH 7.6，洗滌3次。加入10ml含2mg/ml溶菌酶的P 緩衝液，混合均勻，於37'C水浴中保溫1 2h，每隔10 15min振蕩一次，促進原生質 體的釋放。經脫脂棉過濾，濾液離心後，用P緩衝液洗滌2次。最後用lmlP緩衝液懸 浮原生質體。
取100pl原生質體，加入l(Hil質粒DNA溶液，輕彈管壁混勻，迅速加入400^1含25% PEG-1000的P緩衝液，吹吸混勻，室溫放置lmin，取200nl塗布於千燥的R2YE平板上， 28'C培養略見菌苔(約16 35h)後，以50微克/ml阿普黴素溶液覆蓋，28'C繼續倒置培養 3 5天，挑取轉化子。將轉化子斜面培養物接種於轉化培養基[澱粉2.0%，葡萄糖2.0%， (NH4)2SO40.3%， 酵母粉0.5%， 黃豆餅粉1.0%， KH2PO4 0.05%， MgS04.7H20 0.02%， CaCO30.5%]， 28'C培養30h後，加入200微克/毫升螺旋黴素，再培養2天，培養 液過濾後調pH至8.0，用乙酸乙酯提取，濃縮後溶於甲醇進行HPLC分析，採用島津 LC-10ATvp液相色譜議，色譜柱為Kromasil C18 4.5xl50mm，流動相為甲醇/1 %磷酸二氫 鈉溶液(55/45)，流速為lml/min，檢測波長為231nm。根據轉化子將螺旋黴素轉化為異 戊醯螺旋黴素的比值，驗證所構建ist串連基因在變鉛青鏈黴菌表達異戊醯化酶的活性。 以螺旋黴素和必特螺旋黴素中異戊醯化螺旋黴素的保留時間(RT)為標準，根據紫外吸 收峰比值，計算轉化子異戊醯螺旋黴素形成量和螺旋黴素殘留量的比值，以此代表異戊 醯化酶的活性，結果見表二。代表性的HPLC分析見圖3。
表二、變鉛青鏈黴菌轉化子異戊醯螺旋黴素形成量和螺旋黴素殘留量的比值
質粒螺旋黴素殘留量 (峰值％)異戊醯螺旋黴素形 成量(峰值％)異戊醯螺旋黴素形成量和螺旋黴素殘 留量的比值
pSET152-234.5683.8411.0
pSET152-415.04612.56453.6%
由表中結果可見，利用ermEp強啟動子串連表達ist基因可以明顯提高螺旋黴素異戊 醯化活性，使異戊醯螺旋黴素形成量和螺旋黴素殘留量的比值提高138%。
:同源重組串連ist基因在螺旋黴素產生菌中提高異戊醯螺旋黴素組 分的驗證。
分別將重組載體pKC1139-5和pSET152-4採用類似於實施例6原生質體轉化的方法， 導入至螺旋黴素產生菌S. ^n'raw^c幼'c"s [中國普通微生物菌種保藏管理中心 CGMCC4.118]中，獲得抗性轉化子。將pKC1139-5轉化子在28。C加有TW平板[黃豆餅粉-澱粉培養基]上培養生長，經分離後在37'C無抗性的平板上傳代，分離挑選在Tsr1" 平板生長但在Amr平板上不生長的菌株，獲得W基因整合到宿主染色體上的工程菌。 pKC1139-5質粒與宿主菌染色體同源重組雙交換見圖1。以&j^'ramyc幼'c^原株和新構 建的工程菌基因組總DNA為模板，用P1-P2為引物的PCR進行W基因檢觀!I;用表一中 所述的P13引物(Hl同源片段外測序列的引物)和P12 (H2同源片段的下遊引物)為組 合引物擴增全長為5片段基因產物，以驗證雙拷貝W基因在宿主染色體中的整合(圖4)。 五株新構建的雙拷貝&基因菌株和原必特螺旋黴素基因工程菌經種子培養[葡萄糖 1-3%，澱粉2-4%，黃豆餅粉1-3%， NaC10.4%， CaC03 0.3-0.8%]和發酵培養[澱粉2-6%， 魚粉1-3%，玉米漿0.5-1.5%, NH4NO30.6%， KH2P040.01-0.08%， MgS040.1-0.2%, NaCl 1-2%,CaC03 0.3-0.7%]後，發酵液經乙酸乙酯提取，進行HPLC檢測，計算發酵產物中 異戊醯螺旋黴素組分比例，結果見表三。代表性的HPLC分析見圖5。
表三、雙拷貝W基因工程菌發酵產生異戊醯螺旋黴素組分的比例
菌株 異戊醯螺旋黴素(％)
pSW4克隆株(對照) 32.62% .pKC1139-5克隆株 52.76%
注表中結果為三次發酵的HPLC檢測平均值
由表中結果可見，同源重組雙拷貝ist基因工程菌產生的異戊醯螺旋黴素主組分提高 了62%。
權利要求
1、一種可提高基因工程異戊醯螺旋黴素主組分含量的基因串連技術，其特徵是，所說串連技術包括以下方案a、兩個帶自身啟動子雙拷貝ist基因的串連；b、雙拷貝ist基因串連轉錄的構建；c、同源重組雙交換ist基因雙拷貝質粒pKC1139-5的構建；d、整合型強啟動子雙拷貝ist基因重組質粒的構建；e、整合型強啟動子雙拷貝ist基因異源表達提高螺旋黴素異戊醯化轉化率的確認；f、同源重組串連ist基因在螺旋黴素產生菌中提高異戊醯螺旋黴素主組分的鑑定。
2、 權利要求1所述的基因串連技術，其特徵是，兩個帶自身啟動子雙拷貝ist基因的 串連，系根據ist基因閱讀框起始密碼子和自身啟動子上遊以及終止密碼子下遊序列設 計引物，並在引物設計中加入相應的酶切位點序列，以含有ist基因的pSW4質粒為模 板，經PCR擴增，獲得兩個ist基因片段，利用相應的酶切位點，實施帶自身啟動子雙 拷貝ist基因之間的串連。
3、 權利要求1所述的基因串連技術，其特徵是，雙拷貝ist基因串連轉錄的構建，在 於第一個ist基因下遊引物設計，位於終止密碼子下遊但不包括其轉錄終止序列，第二 個ist基因下遊引物設計包括轉錄終止序列，並在引物設計中加入相應的酶切位點，以 含有ist基因的pSW4質粒為模板，經PCR擴增，獲得兩個ist基因片段，利用相應的 酶切位點，使第二個ist基因與第一個ist基因實施串連並連續轉錄。
4、 權利要求l所述的基因串連技術，其特徵是，同源重組雙交換ist基因雙拷貝質粒 pKC1139—5的構建，採用引物設計及PCR方法以螺旋黴素產生菌染色體為模板，擴增 兩個與螺旋黴素生物合成不相關的基因片段如PKSII型基因，並在引物設計中加入相應 的酶切位點，分別連接在權利要求2所述串連ist基因片段的兩側，同時，添加選擇性 標記如硫鏈絲菌素抗性基因，將上述五個片段克隆至溫敏型質粒載體如pKC1139，獲得 可用於同源重組雙交換ist基因雙拷貝質粒pKC1139—5。
5、 權利要求l所述的基因串連技術，其特徵是，整合型強啟動子雙拷貝ist基因重組 質粒的構建，利用鏈黴菌強啟動子如紅黴素抗性基因ermEp片段，通過相應的酶切位點 與權利要求3所述雙拷貝ist基因串連轉錄片段連接，並克隆到鏈黴菌整合型質粒載體 如pSET152，獲得整合型強啟動子雙拷貝ist基因重組質粒pSET152—4。
6、 權利要求l所述的基因串連技術，其特徵是，通過在鏈黴菌如變鉛青鏈黴菌異源表 達權利要求5所述的整合型強啟動子雙拷貝ist基因重組質粒pSET152 —4，用HPLC分 析轉化子對外源加入的螺旋黴素轉化為異戊醯螺旋黴素形成量，確認整合型強啟動子雙 拷貝ist基因異源表達提高螺旋黴素異戊醯化的轉化率。
7、 權利要求l所述的基因串連技術，其特徵是，同源重組串連ist基因在螺旋黴素產生 菌中提高異戊醯螺旋黴素的主組分，系將權利要求4所述同源重組雙交換ist基因雙拷貝 質粒pKC1139—5轉入螺旋黴素產生菌，獲得轉化子，經分離後在無抗性平板上傳代， 獲得&基因整合至宿主染色體上的工程菌，經發酵培養、提取並對產物進行HPLC分析， 根據異戊醯螺旋黴素組分含量，鑑定其提高的比例。
全文摘要
本發明涉及基因工程技術在提高抗生素組分中的應用，具體來講，涉及一種提高基因工程異戊醯螺旋黴素主組分含量的基因串連技術，它是將必特螺旋黴素基因工程菌中與螺旋黴素異戊醯基化密切相關的ist基因進行串連，通過增強其基因劑量提高產生菌異戊醯基化能力；同時也利用強啟動活性的啟動子紅黴素抗性基因ermE基因啟動子序列替換原ist基因啟動子序列，以增強串連ist基因的表達，從源頭提高基因工程菌產生異戊醯螺旋黴素主組分的比例。
文檔編號C12N15/76GK101649325SQ20091014876
公開日2010年2月17日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者戴劍漉, 李瑞芬, 楊永紅, 武臨專, 王以光, 範迎春, 赫衛清 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所;瀋陽同聯集團有限公司