低聚核苷酸類似物的製作方法

2023-10-26 04:23:12

專利名稱：低聚核苷酸類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及低聚核苷酸類似物及其製備方法和應用。
根據本發明，可製備這樣的低聚核苷酸類似物，它們對單鏈和雙鏈核酸具有良好的雜化性質、核糖核酸酶H-活化性質、良好的水解穩定性以及對核酸酶分裂的良好穩定性，易於用作基團表達抑制劑，例如通過反義作用，以及在治療疾病例如癌症和病毒例如流感、皰疹和蕁麻疹中用作藥物。
因此，本發明提供了一種有10-200個天然的和/或合成的核苷單元的低聚核苷酸類似物，核苷單元通過核苷間鍵連接，其中至少一個核苷間鍵具有下式結構
式中所示的亞甲基連接到核苷的3′碳原子，所示的氧原子連接到相鄰核苷的5′碳原子，R1為氫、羥基、O-、硫醇基、S-、-NH2或者式R1a、-OR1a、-SR1a、-NHR1b或-NR1bR1c的基團，其中R1a為未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，R1b和R1c各自獨立為未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R1b和R1c與連接在上面的氨原予一起構成五元或六元雜環，以及X為氧或硫。
在低聚核苷酸類似物中核苷單元的數目是可變化的，例如從15變化到100，它與低聚核苷酸類似物作為目標的核酸序列的性質有關。優選的是，低聚核苷酸類似物有15-40、特別是15-25個核苷單元。低聚核苷酸類似物對一些目標更優選有15-20個核苷單元，對另一些目標有20-25個核苷單元，對另一些目標有18-25個核苷單元，而對另一些目標有18-22個核苷單元。
在本發明的低聚核苷酸類似物中，式Ⅰ的核苷間鍵的數目隨所需的性質變化。例如，對於某些目的來說，一種式Ⅰ的核苷間鍵可能是足夠的，而對於另一些目的來說，所有的核苷間鍵可為式Ⅰ，並且可為相同的或不同的。對於大多數目的來說，至多75％，例如至多50％，特別是至多25％的核苷間鍵可為式Ⅰ。
在本發明的一些實施方案中，在低聚核苷酸類似物中，至少有兩個連續的核苷間鍵，例如2個、3個、4個、5個或6個連續的核苷間鍵為式Ⅰ，它們可為相同的或不同的。在低聚核苷酸類似物的每一端可有這樣的連續核苷間鍵序列；更通常的是，在有其他核苷間鍵的核苷序列之間有一個式Ⅰ的這樣的連續核苷間鍵序列。在本發明有兩個或更多式Ⅰ的核苷間鍵的其他實施方案中，式Ⅰ的核苷間鍵可用其他核苷間鍵交替，例如沿低聚核苷酸類似物的整個長度，或在低聚核苷酸的一端或兩端的區域，或在低聚核苷酸類似物的中部區域。
在本發明不是所有的核苷間鍵都為式Ⅰ的實施方案中，其餘的核苷間鍵可為天然的磷酸二酯鍵合或其他合成取代基，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯(-O-P(O)(R)O-)、亞氨膦酸酯、短鏈烷基、環烷基、短鏈雜原子、-NHCOCH2-、CH2NHCO-、-CONHCH2-、-CH2CONH-、-CH2NHO-、-CH2N(CH3)O-、-CH2ON(CH3)-、-CH2N(CH3)N(CH3)-或-ON(CH3)CH2-鍵合，或者兩個或多個這樣的鍵合的組合。優選的是，其餘的核苷間鍵為磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵合或這三種類型鍵合中兩個或多個的組合，特別是磷酸二酯、硫代磷酸酯或磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵合的混合物。在某些特別優選的實施方案中，其餘的核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵合。優選的是，不大於50％的核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵合。
在本發明的一些實施方案中，低聚核苷酸間鍵或它與硫代磷酸酯或磷酸二酯鍵合混合物的區域之間含有一個有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷間鍵的區域，特別是在兩個有式Ⅰ核苷間鍵或它與硫代磷酸酯或磷酸二酯鍵合的混合物的區域之間含有一個有硫代磷酸酯鍵合的區域。
在一些特別優選的實施方案中，本發明的低聚核苷酸類似物在兩個僅由式Ⅰ的核苷間鍵連接的核苷區域之間有至少6個由硫代磷酸酯鍵合連接的核苷的區域。
在本發明的低聚核苷酸類似物中，核苷單元可為天然的或合成的有嘌呤或嘧啶鹼的核苷，例如腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或者這些鹼的類似物，例如2-氨基腺嘧啶、6-羥基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶或二氫尿嘧啶，它們連接到呋喃糖的1′碳原子上。正如熟悉本專業的技術人員理解的，當低聚核苷糖用於反義時，這樣選擇核苷的序列，以便與目標RNA序列互補。例如，本發明的低聚核苷酸類似物可與人體C-raf激酶的mRNA的區域互補；在這種情況下，優選的序列為WO95/32987中Seq.IDNo.8公開的5′-TCC CGC CTGTGA CAT GCA TT-3′，或者本發明的低聚核苷酸類似物可與人體PKC-α的mRNA區域互補；在這種情況下，優選的序列為WO95/02069中Seq.ID No.2公開的5′-GTT CTC GCT GGT CAG TTT CA-3′。
在本發明一些低聚核苷酸類似物中，至少一個核苷在其2′位被改性，例如提高對給定目標的鍵聯親合性和/或提高抗核酸酶性。所有的核苷都可這樣改性，或者至多80％，例如至多70％、至多60％、至多50％、至多40％、至多30％、至多20％或至多10％的核苷可這樣改性。2′位改性原子和基團的例子，即可代替氫原子或羥基連接到核苷的2′位進行改性的原子或基團的例子包括滷素原子，例如氟、氯和溴原子；C1-C10未取代的或取代的烷基，例如甲基、三氟甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基或癸基；C6-C10芳基，例如苯基、甲苯基或二甲苯基；C7-C13芳烷基，例如苄基；氨基，C1-C10烷基氨基，例如甲氨基、乙氨基或辛氨基；C1-C10烷硫基，例如甲硫基、乙硫基或辛硫基；疊氮化物；硝酸酯；亞硝酸酯；氰化物；氰酸酯；甲烷磺酸酯；C1-C10氨烷基氨基；式-OR2的基團，其中R2為C1-C10脂族基團；取代的甲矽烷基；RNA分裂的基團；膽甾烯基；共軛基團；信息基團；嵌入劑，一種改進低聚核苷酸藥物動力學性質的基團；以及一種改進低聚核苷酸的藥效性質的基團。
在2′位上優選的改性原子和基團是滷素原子，特別是氟，以及式-OR2的基團，其中R2為C1-C10脂族基團，它可為未取代的或取代的C1-C10烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丁基、己基、辛基、癸基、三氟甲基、乙氧基乙基、甲氧基乙基或丁氧基乙基；或者C2-C6鏈烯基，例如乙烯基、烯丙基或甲基烯丙基。特別優選的改性原子和基團是氟和式-OR2的基團，其中R2為未取代的或取代的C1-C10烷基、優選C1-C4烷基，C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基，或者式-(CH2CH2O)-nR3的基團，其中R3為甲基或乙基，n為2-4。特別優選的式-OR2基團是其中R2為甲基、乙基、甲氧基乙基、乙氧基乙基的那些基團或式-(CH2CH2O)-3CH3的基團。
當在2′位改性的核苷存在時，本發明的低聚核苷酸類似物例如可有至少兩個通過磷酸二酯核苷間鍵連接的、在2′位改性的連續核苷，和/或它可在2′位來改性的核苷和2′位改性的核苷的5′碳原子之間有一式Ⅰ的核苷間鍵。
正如熟悉本專業的技術人員理解的，在低聚核苷酸類似物中的末端核苷可分別有游離的5′和3′位羥基，或者可有改性基團，例如磷酸酯、硫醇、烷基硫、硫代烷基、硫代磷酸酯、氨烷基、吖啶基、膽甾烯基或螢光素基代替這些羥基中的一個或兩個。
在式Ⅰ的鍵合中，R1a、R1b或R1c作為取代的烷基、鏈烯基、環烷基、芳基或芳烷基可被取代，例如被羥基、C1-C4烷氧基、滷素(優選氯或氟)、氰基、三(C1-C15烴基)甲矽烷基或伯、仲或叔氨基取代。
在式Ⅰ的鍵合中，其中R1為R1a、-OR1a或-SR1a,R1a作為C1-C10烷基例如可為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、戊基、己基、辛基、壬基或癸基，優選C1-C4烷基；R1a作為C2-C10鏈烯基或為乙烯基、烯丙基、甲基烯丙基、1-丙烯基、異丙烯基、2-丁烯基、1-丁烯基、異丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基或癸烯基，優選C2-C5鏈烯基；R1a作為C3-C8環烷基例如可為環丙基、環丁基、環戊基、甲基環戊基、環己基、甲基環己基、二甲基環己基、環庚基或環辛基，優選C5-C8環烷基；R1a作為C6-C10芳基例如可為苯基、鄰甲苯基、間甲苯基、對甲苯基、鄰二甲苯基、間二甲苯基、對二甲苯基或萘基，優選C6-C8芳基；R1a作為C7-C13芳烷基例如可為苄基、4-甲基苄基、2-苯基乙基、2-苯基丙基、3-苯基丙基或二苯基甲基，優選C7-C9芳烷基。R1作為-NHR1b可為C1-C10烷氧基，例如甲氨基、乙氨基、異丙氨基、丁氨基、戊氨基、己氨基、辛氨基或癸氨基，優選C1-C4烷氨基；C2-C10鏈烯基氨基，例如烯丙基氨基、甲基烯丙基氨基、1-丙烯基氨基、異丙烯基氨基、異丁烯基氨基、己烯基氨基、辛烯基氨基或癸烯基氨基，優選C3-C5鏈烯基氨基；C3-C8環烷基氨基，例如環丙基氨基、環丁基氨基、環戊基氨基、環己基氨基、環庚基氨基、環辛基氨基或二甲基環己基氨基，優選C5-C8環烷基氨基；C6-C10芳氨基、例如苯氨基、鄰-、間-或對-甲苯氨基、鄰-、間-或對-二甲苯氨基或萘氨基，優選C6-C8芳氨基；C7-C13芳烷基氨基，例如苄氨基、4-甲基苄氨基、2-苯基乙氨基、3-苯基丙氨基或二苯基甲氨基，優選C7-C9芳烷基氨基。R1作為-NR1bR1c可為二(C1-C10烷基)氨基，例如二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基、二異丙基氨基、二丁基氨基或二辛基氨基，優選二(C1-C4烷基)氨基；N,N-二(C2-C10鏈烯基)氨基，例如二烯丙基氨基、二甲基烯丙基氨基、烯丙基甲基烯丙基氨基、二丙烯基氨基、二丁烯基氨基、二戊烯基氨基、二己烯基氨基、二辛烯基氨基或二癸烯基氨基，優選二(C3-C5鏈烯基)氨基；N,N-二(C3-C8環烷基)氨基，例如二環丙基氨基、環丙基環戊基氨基、二環丁基氨基、二環戊基氨基、二環己基氨基、二環庚基氨基或二環辛基氨基，優選N,N-二(C5-C8環烷基)氨基；N-C3-C8環烷基-N-C1-C10烷基氨基，例如N-環戊基-N-甲基氨基、N-環戊基-N-乙基氨基、N-環己基-N-甲基氨基、N-環己基-N-乙基氨基，優選N-(C5-C8環烷基)-N-C1-C4烷基氨基；N-C6-C10芳基-N-C1-C10烷基氨基，優選N-C6-C8芳基-N-C1-C4烷基氨基，例如N-苯基-N-甲基氨基、N-甲苯基-N-甲基氨基或N-苯基-N-乙基氨基；N,N-二(C7-C13芳烷基)氨基，例如二苄基氨基、二(4-甲基苄基)氨基、二(苯乙基)氨基或二(苯丙基)氨基，優選N,N-二(C7-C9芳烷基)氨基；或N-C7-C13芳烷基-N-C1-C10烷基氨基，優選N-C7-C9芳烷基-N-C1-C4烷基氨基，例如N-苄基-N-甲基氨基或N-苄基-N-乙基氨基，或通過氮原子連接到式Ⅰ中所示的磷原子的五元或六元N雜環的基團，例如1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基或嗎啉基。如上所述，上述基團中任何一個都可為未取代的或取代的。
在一些優選的實施方案中，R1為氫、羥基、O-、SH、S-、未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基、或-OR1a的基團(其中R1a為未取代的或取代的C1-C4烷基、C3-C5鏈烯基、C5-C8環烷基或C7-C9芳烷基)或式-SR1a的基團(其中R1a為未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基)，任選取代基為上述的。在某些特別優選的實施方案中，R1為氫、羥基、O-、SH、S-、甲氧基、乙氧基或2-氰基乙氧基。
在式Ⅰ中的R1為O-的場合下，本發明的低聚核苷酸類似物可為藥物學上可接受的鹽的形式，例如金屬鹽，優選鹼金屬鹽，或未取代的或取代的銨鹽，例如一、二或三C1-C10烷基-或羥烷基-銨鹽、N-乙基哌啶鎓鹽或N,N′-二甲基哌嗪鎓鹽。在R1為O-的特別優選的實施方案中，低聚核苷酸類似物為鈉鹽或銨鹽形式。
在式Ⅰ中的磷原子為手性中心的場合下，可觀測到雜化性質和抗核酸酶性質的差別以及與磷的立體化學有關的生物效率的差別。
本發明的低聚核苷酸類似物可用式V-L-(V-L)n-V表示，其中n為8-198中的一個數，每一V獨立為天然的或合成的核苷的殘基，每一n+2殘基V與相鄰殘基V是相同的或不同的，每一L為一核苷間鍵，每一n+1鍵合L與相鄰鍵合L是相同的或不同的，至少一個L為式Ⅰ。
本發明還提供一種製備有至少一個式Ⅰ的核苷間鍵的低聚核苷酸類似物的方法，例如低聚核苷酸有2-200個核苷單元，例如上述的低聚核苷酸類似物，該法包括(ⅰ)在(A)有5′羥基的天然的或合成的核苷或低聚核苷酸和(B)在3′位有能與所述的5′羥基反應的基團的天然或合成核苷或二核苷酸之間進行偶聯反應或順序偶聯反應，一直到製得有所需數目核苷的低聚核苷酸為止，在至少一所述的偶聯反應中，(B)為下式的核苷
式中，B1為核苷鹼基團，R4為羥基保護基團，R5為氫、羥基或2′位改性原子或基團，M+為金屬或未取代的或取代的銨離子或雜環鹼例如吡咯烷、哌啶、N-乙基哌啶、N,N′-二甲基哌嗪、嗎啉或1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的陽離子，X為氧或硫，它在位阻有機醯滷或酸酐存在下與(A)反應，生成有下式的亞膦酸酯核苷間鍵的低聚核苷酸類似物
式中，X為氧或硫，以及(ⅱ)(a)亞膦酸脂鍵合氧化或(b)亞膦酸酯鍵合硫化或(C)亞膦酸酯鍵合與式R1aY的化合物反應，其中R1a規定如上，Y為一離去原子或基團，或(d)亞膦酸酯鍵合與式R1aOH的醇或式R1bNH2或R1bR1cNH的胺氧化和反應，其中R1a、R1b和R1c規定如上，或(e)亞膦酸酯鍵合甲矽烷化和甲矽烷化的鍵合與硫代烷基化劑或硫代芳基化劑反應。得到式Ⅰ的亞膦酸酯鍵合。其中R1為-SR1a,R1a規定如上。
規定如上的方法可在溶液中或固體載體上進行，例如使用已知的低聚核苷酸合成步驟。用這一方法製得的低聚核苷酸類似物可進一步反應，用氫代替保護基R4，或者在R4在低聚核苷酸類似物中的末端核苷上的場合下，通過上述的5′位改性基團代替保護基R4。
本發明的低聚核苷酸類似物可用固相合成法來製備，例如使用H-膦酸鹽、磷酸三酯或亞胺膦酸酯或兩種或兩種以上的混合物，例如使用商購的自動化核酸合成器。固相合成法可包括與連接到固體載體上的核苷或低聚核苷酸(A)進行如上述的順序偶聯反應(ⅰ)，如上述步驟(ⅱ)，然後(ⅲ)從固體載體上除去低聚核苷酸並除去保護基團，得到有末端5′位游離羥基的低聚核苷酸以及(ⅳ)任選使5′位游離羥基反應，在末端5′位引入改性基團。
在式Ⅱ的核苷中，如上所述，B1可為嘌呤或嘧啶鹼或其類似物。其中B1為天然核苷鹼、更優選嘧啶鹼、特別是胸腺嘧啶的化合物是優選的。R4可為任何能保護5′位羥基不受不希望的反應的羥基保護基。這樣的基團是大家熟悉的，包括C1-C10脂族基團，例如烷基；C3-C8環脂族基團，例如環烷基；C6-C10芳族基團，例如芳基；C7-C40芳脂族基團，例如芳烷基或C1-C4烷氧基取代的芳烷基；或-COR6或-SO2R6的基團，其中R6為C1-C10脂族基團、C3-C8環脂族基團、C6-C10芳族基團或C7-C40芳脂族基團；以及三(C1-C15烴基)甲矽烷基。優選的是，R4為傳統用於低聚核苷酸合成的5′位保護基團，特別是甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基。R5作為2′位改性的原子或基團可為上述的原子或基團；優選的是R5為氫。M+例如可為鹼金屬離子或優選未取代的銨離子、一、二或三C1-C10烷基-或羥烷基-銨離子或雜環鹼例如吡咯烷、哌啶、N-乙基哌啶、N,N-二甲基哌嗪、嗎啉或DBU的陽離子。特別優選的M+為三乙基銨離子。
式Ⅱ核苷的優選立體異構體為下式的立體異構體
式中，B1、R4、R5、X和M+規定如上。
式Ⅱ的核苷可用以下步驟製備a)下式的化合物與(1,1-二乙氧基乙基)亞膦酸乙酯在鹼例如雙(三甲基甲矽烷基)氨化鉀存在下，在四氫呋喃(THF)中，在-80至40℃下反應，
式中，B1和R4規定如上，R5a為氫、氟或-OR2，其中R2規定如上，L為一離去原子或基團，優選碘原子，生成下式的化合物
式中，B1和R5a規定如上；b)式Ⅳ的化合物在含有1％乙醇的氯仿中，在氬氣下，在室溫下與三甲基甲矽烷基氯反應，以便用氫代替連接到磷上的保護縮酮基團；c)在異丙醇鈦(Ⅳ)存在下，在乾燥的THF中，在室溫下，b)得到的產物與丙酮反應，生成下式的化合物
d)式Ⅴ的化合物在THF中，在室溫下與四正丁基氟化銨和乙酸反應，以除去叔丁基二苯基甲矽烷基保護基；e)生成的含5′-羥基的化合物在有機鹼存在下與式R4Y化合物反應，其中R4規定如上，Y為滷素，生成下式的化合物
式中B1、R4和R5a規定如上；f)式Ⅵ的化合物在室溫下，在無水甲醇中與鹼金屬甲醇鹽，或在水中與DBU反應，以除去乙基和用氫代替-C(CH3)2OH基；g)如果需要，用氨或胺處理產物，生成相應的未取代的或取代的銨鹽；以及h)如果需要，使產物硫化，得到式Ⅱ的核苷，其中X為硫，例如採用有機化學雜誌，第60卷，第8241頁，1995年中描述的步驟，與新戊醯氯反應，隨後與(CH3)3Si-S-Si(CH3)3反應。
可使式Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ的化合物反應，在2′位引入不同的改性原子或基團R5，例如用傳統的步驟將這樣的2′位改性原子或基團引入核苷。
可通過下式的醛在無水乙醇中、在室溫下用NaBH4還原生成相應的醇，
式中，B1和R5a規定如上，該醛按照WO92/20823中公開的方法製備，然後生成的醇在2,6-二甲基吡啶存在下，在乾燥的二甲基甲醯胺中，在0-30℃下與甲基三苯氧基碘化磷鎓反應來製備式Ⅲ的化合物。
(1,1-二乙氧基乙基)亞膦酸乙酯可按EP0307362中公開的製備。
在使用固相合成的典型步驟中，有被保護的5′位羥基的天然的或合成的核苷使用連接劑例如琥珀酸酐，在3′位共價連接到惰性的氧化矽為基礎的載體上，例如含有長鏈烷氨基的受控孔的玻璃(CPG)，得到連接到固體載體上的3′-末端核苷。固體載體也可含有對於所需的低聚核苷酸起3′末端改性基團作用的基團。然後除在連接在末端核苷的5′羥基上的保護基團，例如二甲氧基三苯甲基，得到游離的5′羥基。末端核苷然後與這樣的天然和合成核苷或二核苷酸(B)偶聯，得到連接到固體載體上的二聚的低聚核苷酸(或其中(B)為二核苷酸、三聚低聚核苷酸)，(B)有被保護的，例如二甲氧基三苯甲基被保護的5′羥基以及在3′位有這樣一基團，它可與末端核苷上的5′位游離羥基反應的或活化反應的基團。除去連接低聚核苷酸上的5′位保護基後，重複與有3′位反應性基團的天然或合成5′位被保護核苷或二核苷酸(B)的反應循環，一直到合成出有所需核苷數目的低聚核苷酸為止。
為了生成不同於式Ⅰ的核苷間鍵，根據傳統的低聚核苷合成步驟選擇核苷或二核苷酸(B)的3′位的反應性基團或活化反應性基團，例如可為H-膦酸鹽基、亞氨膦酸酯基或磷酸二脂基。可用傳統的步驟進行偶聯反應，如果需要，隨後進行氧化、硫化或其他處理，生成這些核苷間鍵，例如磷酸三酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵合。
在本發明的低聚核苷酸類似物的製備中，至少一個偶聯反應使用式Ⅱ的核苷作為(B)來進行，它與核苷或核苷酸(A)反應，它在固相合成中連接到固體載體上，偶聯反應在位阻的有機醯滷或酸酐存在下進行，例如新戊醯氯、金剛醯氯、2,4,6-三異丙基苯磺醯氯、二苯基次膦醯氯、雙(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦醯氯、2-氯-2-氧代-5,5-二甲基-1,3,2-二氧雜膦或雙(五氟苯基)酐。優選的是，反應在雜環鹼(在環中有叔氮原子)或這樣的鹼的氧化物存在下，例如吡啶、喹啉、N-甲基咪唑或吡啶-N-氧化物以及特別是有機溶劑例如乙腈存在下進行。偶聯反應可在室溫或中等升溫下，例如在至多50℃下進行。
使用式Ⅱ的核苷作為(B)的偶聯反應製得的式ⅠA的亞膦酸酯核苷間鍵可在下一偶聯反應進行以前或者優選有所需數目核苷的低聚核苷酸類似物合成以後進行氧化或硫化，它可與用式Ⅱ的核苷通過其他偶聯反應生成的一種或多種其他亞膦酸酯核苷間鍵或用3′H-膦酸鹽取代的核苷通過偶聯反應製成的亞磷酸酯鍵合一起氧化或硫化。氧化(ⅱ)(a)可通過用碘和水處理或用叔丁基氫過氧化物處理來實現，例如使用用於亞磷酸酯核苷間鍵氧化的傳統步驟來實現。硫化(ⅱ)(b)可通過在叔胺存在下，在有機溶劑中，通常為二硫化碳，用碳處理來實現，例如用已知的步驟來實現。
式ⅠA的亞膦酸酯核苷間鍵與式R1aY的化合物的反應(ⅱ)(c)可使用已知的步驟來進行，R1aY中R1a和Y規定如上，Y優選為滷素原子或三氟甲烷磺酸基，R1a為烷基、環烷基或芳烷基，例如可通過式ⅠA的亞膦酸酯鍵合與R1aY(其中Y為滷素)在強鹼例如氫化鈉存在下反應來進行。在R1aY為鏈烯基或芳基滷化物或三氟甲磺酸酯的場合下，亞膦酸酯鍵合和R1aY之間的反應可用已知的步驟來進行，例如在鈀催化劑例如Pd(PPh3)4和叔胺存在下進行，例如在Y、Xu等，四面體通訊，30,949(1989)或K.S.Petrakis等，美國化學會雜誌，109,2831(1987)中描述的。
在下一偶聯反應以前或在合成出有所需數目核苷的低聚核苷酸以後，式ⅠA的亞膦酸酯核苷間鍵與式R1aOH的醇的氧化反應(ⅱ)(d)可通過在醇R1aOH和鹼例如吡啶存在下，例如在亞磷酸酯核苷間鍵氧化的傳統條件下與氧化劑例如碘、四氯化碳和-溴三氯甲烷反應來進行。
在下一偶聯反應以前或在合成出有所需數目核苷的低聚核苷酸以後，式ⅠA的亞膦酸酯核苷間鍵的氧化反應(ⅱ)(d)可用式R1bNH2或R1bR1cNH的胺(R1b和R1c規定如上)和四氯化碳或-溴三氯甲烷或碘來進行，得到本發明的低聚核苷酸類似物，其中R1分別為-NHR1b或-NR1bR1c。反應可用對於Atherton-Todd反應已知的條件和步驟來進行。
式ⅠA的亞膦酸酯鍵合的反應(ⅱ)(e)可用以下步驟來進行用已知的甲矽烷化步驟使鍵合甲矽烷化，例如用三烷基甲矽烷基滷和鹼例如三乙胺；甲矽烷化的鍵合與硫代烷基化劑或硫代芳基化劑例如式ArSO2SR1a的硫代磺酸酯反應，其中R1a規定如上，Ar為芳族基團，例如苯基或甲苯基。這一反應的適合步驟由W.K.D.Brill，四面體通訊，36,703(1995)描述。
對於熟悉本專業的技術人員來說，很顯然在式ⅠA的亞膦酸酯鍵合反應以便用含反應性基團例如氨基的R1基代替連接到磷上的氫原子中，在反應引入R1的過程中，如果在反應條件下取代基是反應性的，應保護取代基，隨後再去護。
當在固體載體上合成出有所需核苷數目的低聚核苷酸類似物時，它從固體載體上分離出來，例如用濃氨水處理的傳統的方法，這一處理也除去在低聚核苷酸合成中使用的一種或多種核苷中的環外氮原子上可能存在的保護基團，在處理除去羥基保護基團例如二甲氧基三苯甲基前後，上述保護基也可用傳統的方法來進行，例如用有機酸例如三氟乙酸的水溶液處理。
在低聚核苷酸從固體載體上分離的前後，在去護時產生的末端5′位羥基可反應，以便引入5′位末端改性基，例如磷酸酯基或如上述的其他5′位改性基團，例如用Beaucage和Lyer，四面體，49,192563(1993)描述的步驟。
在上述合成方法的改進中，式Ⅱ的核苷可用下式的二核苷酸代替
式中，B1、R1、R4和R5規定如上，B2為核苷鹼基團，它可為上述對B1的天然或合成核苷鹼的基團，R6為氫、羥基或2′位改性原子或基團，如對R5規定的，R7為能與核苷中5′位羥基有反應性的或活化反應性的基團。
在這一改進中，在式Ⅷ的核苷酸中的R7O可為H-膦酸鹽基；在這種情況下，式Ⅷ的二核苷酸可在位阻的有機醯滷存在下，例如使用3′位H-膦酸鹽製備低聚核苷酸合成的傳統步驟，與在固相合成中它連接到固體載體上的核苷或低聚核苷酸(A)反應製成亞磷酸酯核苷間鍵，然後它可氧化、硫化或與式R1aY的化合物反應，或進行另外的反應(ⅱ)(a)至(ⅱ)(e)，如上述由式Ⅱ的核苷與(A)反應製成的式ⅠA亞膦酸酯核苷間鍵那樣。
在這一改進中，在式Ⅷ的二核苷酸中的R7O基團另一方面可為亞氨膦酸酯基團，在這種情況下，式Ⅷ的二核苷酸可與核苷或低聚核苷酸(A)反應，例如使用3′位亞氨膦酸酯製備低聚核苷酸的傳統步驟。
在這一改進的另一實施方案中，式Ⅷ二核苷酸中的R7O基團可為磷酸二酯基；在這種情況下，式Ⅷ的二核苷酸可與核苷或低聚核苷酸(A)反應，例如使用3′位磷酸二酯製備低聚核苷酸的傳統步驟。
式Ⅷ的二核苷酸可用以下步驟來製備式Ⅱ的核苷在脫水偶聯劑例如碳化二亞胺或位阻的有機醯滷或酸酐的存在下，與下式的核苷反應
式中，B2和R6規定如上，R8為羥基保護基，製得下式的二核苷酸
，任選將式X中的核苷間鍵進行上述反應(ⅱ)(a)至(ⅱ)(e)中任一反應後，將R8O基團轉化成R7O-基團。
可從上述對R4所述的基團中選擇羥基保護基團R8。R8優選為傳統用於核苷化學的3′位保護基團，特別是叔丁基二苯基甲矽烷基。
式Ⅸ的核苷是3′位被保護的天然或合成核苷，它們可有氫、羥基或在2′位的2′位改性原子或基團。這樣的核苷是已知的或可用已知方法製備的。
式Ⅱ的核苷和式Ⅸ的核苷之間在位阻的有機醯滷存在下的反應如上所述式Ⅱ的核苷與核苷或低聚核苷酸(A)的反應那樣優選在雜環鹼或其氧化物和有機溶劑中進行。
基團R8O-轉化成基團R7O-(其中R8和R7規定如上)可用被保護的3′位羥基轉化成能與5′位羥基反應的或活化反應的基團，例如H-膦酸鹽、亞氨膦酸酯或磷酸二酯基的傳統方法來進行。例如，保護基R8可被除去，生成游離的3′位羥基，然後它可與脂族的雙(N,N-二烷基)亞氨膦酸酯例如雙(N,N-二異丙基)二亞氨膦酸2-氰乙基酯反應，生成3′位亞氨膦酸酯基。
其中R5和R6中的一個或每一個為規定如上的2′位改性原子或基團，特別是規定如上的式-OR2基團的式Ⅷ二核苷酸是新的化合物。式Ⅹ的二核苷酸是新的化合物。因此，本發明還提供下式的新型二核苷酸
式中，B1、B2、R1、R4規定如上，R5和R6規定如上，不同的是，在R1不為氫的場合下，R5和R6中至少一個為如上規定的2′位改性原子或基團，R9為如上規定的R7或R8，特別是R5為氫或羥基，R6為如上規定的2′位改性原子或基團，特別是如上規定的式-OR2基團。
其中R1為C1-C10烷氧基的式Ⅷ二核苷酸也可用以下步驟來製備下式的核苷與式Ⅸ的核苷在叔胺例如二甲基氨基吡啶和脫水劑例如二環己基碳化二亞胺(DCC)存在下反應，
式中，B1、R4和R5規定如上，生成式Ⅹ的二核苷酸，然後將它按如上所述處理，得到式Ⅷ的二核苷酸。式Ⅻ和Ⅸ的核苷之間的反應可在溶劑例如THF中，在室溫下進行。
式Ⅻ的核苷可通過使用傳統的步驟，用酸處理式Ⅱ的核苷(式Ⅻ酸的鹽形式)來製備。
至少有一個式Ⅰ核苷間鍵的低聚核苷酸，例如有2-200個核苷單元的低聚核苷酸，例如如上所述的低聚核苷酸類似物也可用以下步驟來製備將有被保護的5′位羥基和在3′位有下式基團的核苷與有游離5′位羥基的天然或合成核苷或低聚核苷酸進行核苷偶聯反應，
式中，R1a規定如上，R10和R11各自獨立為未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C4-C10環烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R10為所述的基團，而R11為氫，或R10和R11與連接在上面的氮原子一起構成5元至十三元雜環，生成下式的核苷間鍵的低聚核苷酸前體，
式中R1a規定如上；以及通過以下反應將前體轉化成有下式的核苷間鍵的低聚核苷酸，
式中，R1a規定如上，X為氧或硫將前體氧化生成有式ⅩⅤ核苷間鍵的低聚核苷酸(其中X為氧)或將前體硫化生成有式ⅩⅤ核苷間鍵的低聚核苷酸(其中X為硫)。
生成有式ⅩⅣ鍵合的前體的反應可在胺質子化偶聯催化劑(活化劑)例如四唑或5-(4-硝基苯基)四唑存在下進行。反應可在-20至50℃、優選室溫下進行。生成的前體的氧化或硫化可用亞磷酸酯核苷間鍵氧化或硫化使用的方法來進行。例如，可使用低聚核苷酸合成中亞磷酸酯鍵合氧化的已知條件和步驟，用碘和水，或用氫過氧化物例如叔丁基氫過氧化物處理來進行氧化。例如使用亞磷酸酯核苷間鍵硫化的已知步驟，在叔胺存在下，在有機溶劑中，通學在二硫化碳中，通過用[3H]1,2-苯並二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage試劑)或用四乙基秋蘭姆處理，用硫處理來進行硫化。
有被保護的5′位羥基和在3′位有式ⅩⅢ基團的核苷可用以下方法來製備有被保護的5′位羥基和在3′位有下式基團的核苷
式中R1a規定如上，Z為滷素，與下式的化合物反應，
式中，R10和R11規定如上。反應可在有機溶劑例如滷化的烴類例如氯仿中，在叔氮鹼例如吡啶存在下，在-78至50、優選-30至25℃下進行。
有被保護的5′位羥基和在3′位有式ⅩⅥ的基團的核苷可通過有被保護的5′位羥基和在3′位有下式的基團的核苷非氧化的滷化來製備。
非氧化的滷化可在鹼、優選叔氮鹼例如吡啶存在下，在有機溶劑(它可為吡啶，但優選為滷化烴例如氯仿)中，在-20至60、優選0至50℃下與非氧化的滷化劑例如滷代正膦如三苯基二氯正膦或二氯三(2,4,6-三溴苯氧基)正膦反應來進行。
有被保護的5′位羥基和在3′位有式ⅩⅧ基團的核苷可按WO96/08503中公開的來製備。
當有式ⅩⅤ的鍵合的低聚核苷酸在固體載體上生成時，它可經處理除去5′位保護基團，生成的5′位羥基端接的低聚核苷酸與有被保護的5′位羥基和在3′位有與連接到固體載體上的去護的低聚核苷酸上的游離5′位羥基是反應性的或活化反應性的基團的天然或合成核苷或低聚核苷酸進行順序偶聯循環，一直到製得有所需長度的低聚核苷酸為止。例如，有式ⅩⅤ的鍵合的低聚核苷酸可與有3′亞氨膦酸酯、H-膦酸鹽、磷酸二酯基或式ⅩⅢ的3′位基團以及被保護的5′位羥基的核苷或低聚核苷酸偶聯，得到鏈增長的低聚核苷酸，它反過來通過另外的供選擇的反應進一步鏈增長，一直到製得有所需長度的低聚核苷酸。在使用有3′位亞氨膦酸酯、H-膦酸鹽或磷酸二酯基的核苷或低聚核苷酸的場合下，偶聯反應可使用在低聚核苷酸合成中已知的步驟來進行。在使用有式ⅩⅢ的3′位基團的核苷場合下，偶聯反應可按如上所述的進行。例如，在使用3′位亞氨膦酸酯或式ⅩⅢ的3′位基團的場合下，偶聯循環包括氧化或硫化，而在使用3′位H-膦酸鹽的場合下，在鏈增長完成後進行氧化或硫化，而在使用3′位磷酸二酯的場合下，不需要氧化。
本發明的低聚核苷酸類似物可用於治療學，例如治療人體或其他動物通過蛋白質調製的疾病或治療病毒，例如流感，皰疹和蕁麻疹。因此，本發明還提供了一種含有本發明的低聚核苷酸類似物作為有效成分的藥物組合物。熟悉本專業的技術人員很容易確定最佳的劑量和治療方案。當給約70kg重的哺乳動物給藥時，例如劑量可為每天0.01-1000mg。本發明的治療劑體內給藥例如口服吸入、靜脈內或肌內通常是優選的。其他給藥方法，例如透皮、局部或病灶內給藥法以及栓劑也是適用的。對於某些治療來說，與藥理學上可接受的載體一起使用是優選的。
本發明的低聚核苷酸類似物對核酸酶的降解有很高的穩定性。還觀測到與互補的核酸鏈，特別是RNA型的有很好的配對性。所以，本發明的低聚核苷酸類似物特別適用反義技術，即由於鍵聯到核酸中適合的互補核苷酸序列，抑制不希望的蛋白質產物的表達(參見EP0266099、WO87/07300和WO89/08146)。它們可用於治療感染和疾病，例如在核酸階段阻斷生物活性蛋白質的表達(例如致腫瘤基團)。本發明的低聚核苷酸類似物還適合作診斷劑，以及可用作通過單鏈或雙鏈核酸階段的選擇性相互作用確定病毒感染以及與遺傳有關的疾病的基團探針。特別是，由於對核酸酶的穩定性提高，診斷應用不僅在體外是可能的，而且在體內也是可能的(例如組織樣、血漿和血清)。這類應用的可能性例如在WO91/06556中公開。
式Ⅺ的新型二核苷酸可用作藥物，例如用作抗病毒劑。
本發明的藥理學活性的低聚核苷酸類似物和二核苷酸可以腸胃外給藥的製劑形式或輸液形式使用。這類溶液優選為等滲性水溶液或懸浮液，在使用前製備它們是可能的，例如在凍幹製劑的情況下，凍幹製劑獨自含有活性物質，或含有活性物質和載體，例如甘露糖醇。藥物製劑可被消毒和/或含有賦形劑，例如防腐劑、穩定劑、潤溼劑和/或乳化劑、增溶劑、調節滲透壓的鹽和/或緩衝劑。如果需要，藥物製劑可含有另外的藥理學上活性的物質，例如抗菌素，藥物製劑可按本身已知的方法來製備，例如用傳統的溶解方法或凍幹方法，它們含有約0.1至90、特別是約0.5至約30、例如1至5％活性物質。
用以下實施例來說明本發明。
在實施例中使用的化合物及其前體製備如下。這些化合物所有的31P數據和實施例的數據都為1H去偶的。
化合物A
Ph=苯基T=1-胸腺嘧啶基在5分鐘內分批將NaBH4(865mg,23mmol)在室溫下加到按WO92/20823中公開製備的式ⅩⅢ的醛(11.2g,23mmol)於無水乙醇(120ml)的溶液中。1小時後，用水急冷反應混合物，用乙酸乙酯(500ml)稀釋，並用水(2×50ml)洗滌。水相反萃取後，將合併的有機相干燥(MgSO4)，並濃縮得到化合物A白色固體。1H nmr(CDCl3,400MHz)δ9.10(1H,s,NH)7.65(4H,d,Ar4×CH ortho),7.40(7H,m,Ar4×CH meta,2×CH para+H6)6.13(1H,t,H1′)4.00(1H,dd,H5′),3.93(1 H,m,H4′)3.82(1H,dd,H5′),3.62(2H,m,CH2OH)2.60(1H,m,H3′),2.32(1H,m,H2′),2.12(1H,m,H2′)1.62(3H,s,T-CH3)和1.10(9H,s,tBu)ppm.化合物B
Ph=苯基T=1-胸腺嘧啶基將2,6-二甲基吡啶(4.25ml,36.5mmol)在0-5℃下加到化合物A(9g,18.1mmol)於乾燥DMF(100ml)的溶液中，隨後加入甲基三苯氧基碘化磷鎓9.45g,20.9mmol)。將生成的混合物加熱到室溫。1小時後，將混合物稀釋(200ml乙酸乙酯)，並用0.1N Na2SO3(2×20ml)洗滌，0.5N鹽酸(2×20ml)洗滌和水(2×20ml)洗滌。乾燥，濃縮和用快速氧化矽柱色譜純化(梯度洗脫劑氯仿∶乙酸乙酯20∶1至7∶1)，得到化合物B白色固體。1H nmr(CDCl3,400MHz)δ10.2(1H,s,NH)7.66(4H,d,4×CH ortho),7.40(7H,M,4×CHmeta,2×CH para+H6)6.19(1H,t,H1′)4.02(1H,dd,H5′),3.82(1H,m,H4′)3.78(1H,dd,HS′),3.17(1H,dd,CH2l)3.10(1H,dd CH2l),2.68(1H,m,H3′),2.30(1H,m,H2′)2.23(1H,m,H2′)1.66(3H,s,CH3-T),1.10(9H,s,tBu)ppm.化合物C
在氫氣、-78℃下，在5分鐘內將雙(三甲基甲矽烷基)氨化鉀(34.6ml,0.75M甲苯溶液)溶液滴加到(1,1-二乙氧基乙基)亞膦酸乙酯(5.51g,26.2mmol)於乾燥THF(170ml)的溶液中。將生成的溶液在-78℃下攪拌1小時。然後將化合物B(5.0g,8.25mmol)於乾燥THF(20ml)的溶液在5分鐘內滴加入。在-78℃下攪拌1小時後，在2小時內加熱到室溫。然後加入氯化銨飽和水溶液(50ml)，並用乙酸乙酯(500ml)萃取整個混合物。用氯化銨飽和水溶液(2×50ml)和水(2×50ml)洗滌有機相。在硫酸鎂上乾燥，並濃縮。用快速氧化矽柱色譜(洗脫劑乙酸乙酯∶乙醇30∶1)純化，得到在磷處非對映異構體差向立體異構體的1∶1混合物的混合物C。
化合物D
(Ph=苯基，T=1-胸腺嘧啶基在室溫下將三甲基甲矽烷基氯(4.44ml,35mmol)滴加(2分鐘)到在氬氣下的化合物C(2.4g,3.5mmol)於含有乙醇(1％)的氯仿(25ml)的攪拌溶液中。在-20℃下靜置60小時後，將另一部分三甲基甲矽烷基氯(2.22ml,17.5mmol)和乙醇(200μl)一起加入，將生成的溶液在室溫下攪拌7小時。濃縮和用氯仿(50ml)蒸發，得到白色固體，它用快速氧化矽柱色譜純化(洗脫劑氯仿∶乙醇13∶1)，得到非對映異構體1∶1混合物白色固體。化合物E
將異丙醇鈦(Ⅳ)(738μl,2.48mmol)加到化合物D(1.2g,2.1mmol)於含丙酮(3.2ml)的乾燥THF(30ml)的溶液中。15分鐘後，濃縮並通過氧化矽短柱(洗脫劑乙酸乙酯∶乙醇4∶1)(500ml)，得到兩種非對映異構體的混合物的化合物E。
31Pnmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ55.0,54.7ppm測量值C57.7,H7.05,N4.05％C32H45N2O7PSi·2H2O要求C57.8,H7.4,N4.2％化合物F
將四正丁基氟化銨(1.63ml,1.0M)的溶液加到化合物E(1.02g,1.62mmol)和乙酸(92μl,16.1mmol)於THF(10ml)的溶液中。在室溫下攪拌1小時後，將混合物濃縮，並與氯仿(50ml)共蒸發。用快速氧化矽柱色譜(洗脫劑氯仿∶乙醇9∶1)純化，得到兩種非對映異構體混合物的化合物F。實測值C 45.55,H 6.85,N 6.4％C16H27N2O7P.1 2/3H2O要求C 45.7,H 7.25,N 6.6％31P nmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ56.7,56.5ppm.化合物G
將二甲氧基三苯甲基氯(958mg,2.83mmol)加到化合物F(550mg,1.41mmol)於吡啶(10ml)的溶液中。在室溫下攪拌20小時後，濃縮，並用快速氧化矽柱色譜(洗脫劑氯仿、甲醇、三乙胺100∶5∶1)純化，得到兩種非對映異構體混合物化合物G。
31P nmr1H去偶(CDCl3,162MHz)δ54.9,54.7ppm化合物H
將甲醇鈉(1.5ml4.4N甲醇溶液)加到化合物G(0.85g,1.22mmol)於無水甲醇(10ml)的溶液中。在室溫下攪拌16小時後，濃縮並用快速氧化矽色譜(梯度洗脫劑氯仿、甲醇、三乙胺100∶20∶1至100∶35∶1)純化，隨後將產物於0.5％三乙胺水溶液中的溶液通過Dowex 50W-X2離子交換柱(三乙胺型)進一步純化，濃縮後得到化合物H。
31P nmr1H去偶(CD3OD,162MHz)δ23.7ppm。
化合物J
化合物J按WO96/08503實施例98中描述的製備。
在化合物K至M的化學式中，T為胸腺嘧啶基，DMTr為二甲氧基三苯甲基。
化合物K
在室溫下將3-羥基丙腈(58μl,0.85mmol)加到在氬氣下的化合物H(500mg,0.71mmol)和二環己基碳化二亞胺(189mg,0.92mmol)於乾燥THF(5.4ml)的溶液中。將生成的溶液在55℃下加熱2小時。冷卻後，將混合物過濾，用乙酸乙酯(20ml)稀釋，用水和鹽水洗滌，在Na2SO4上乾燥，過濾和濃縮。將生成的產物吸收在二氯甲烷(5ml)中，過濾和濃縮，如果需要，重複這一過程，除去二環己基脲，得到在磷處非對映異構體混合物化合物K。
31P nmr(1H去偶)(CDCl3,162MHz)δ37.4,37.3ppm)。
化合物L和M
將二氯三苯基正膦(113mg,350μmol)加到仔細乾燥的化合物K(71mg,220μmol)於含吡啶(80ml,1mmol)的氘化氯仿(0.5ml)的溶液中。將生成的溶液搖動，使正膦溶解，然後在室溫下靜置。用31P nmr監測反應進程。產物為化合物L。16小時後，加入另外的二氯三苯基正膦(28mg,87μmol)。24小時後，31P nmr表明反應完成95％。在-30℃下將總計56μl(0.67mmol)吡咯烷分批加入到粗反應混合物中。將生成的混合物加熱到室溫，然後用二氯甲烷(20ml)稀釋，用去離子水(2×10ml)洗滌2次，乾燥(Na2SO4)和濃縮。用快速氧化矽柱色譜純化，得到化合物M。
實施例1-13在以下實施例中，化合物H和化合物J在低聚核苷酸類似物合成中用作單體。未改性的5′-二甲氧基三苯甲基取代的核苷H-膦酸鹽也用作商購的三乙基銨鹽，縮寫如下Tp=胸苷H-膦酸鹽Cp=N4-苯甲醯基-脫氧胞苷-H-膦酸鹽Ap=N6-苯甲醯基-脫氧腺苷-H-膦酸鹽Gp=N2-異丁醯基-脫氧鳥苷-H-膦酸鹽低聚核苷酸的合成在聚丙烯注射器中用商購的核苷(Tp、Cp或Ap)衍生的長鏈烷基胺受控孔玻璃手工進行。第一殘基在以下實施例的3′末端由這一商業材料得到。合成在0.2μmol規模上在3′至5′方向進行。
實施例1低聚核苷酸類似物15′TTT T*TC TCT CTC TCT3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵(其中X為氧和R1為羥基)，所有其他鍵合為磷酸二酯鍵合。
載體(6.8mg)用二氯甲烷洗滌，用二氯乙酸處理來除去5′位保護基，在偶聯製備中再次洗滌載體。在用未改性的核苷H-膦酸鹽偶聯的場合下，在新戊醯氯(182mM)存在下，也在吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)中，用5′位被保護的核苷H-膦酸鹽(30mM(對於胸苷)；20mM(對於胞苷))於吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl(對於胸苷)，300μl(對於胞苷))的溶液處理載體1分鐘。
為了得到所需的低聚核苷酸類似物，進行通常的H-膦酸鹽DNA合成，不同的是，單體化合物H對於未改性的核苷H-膦酸鹽來說是取代的，當在合成中達到T*位以及改變的偶聯和氧化條件按下述的使用時。
當單體為式Ⅱ的亞膦酸3′-亞甲基酯時，在新戊醯氯(121mM)存在下，在吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)中，載體用化合物H(60mM)於吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)的溶液處理2次，每次30分鐘，即所說的2×30分鐘。進行另外的洗滌步驟，重複該循環，除去5′位保護基和新單體偶聯(或化合物H或3′-H-膦酸鹽)到生長的低聚核苷酸鏈的游離5′位羥基上。
重複這些步驟，一直到全長15鏈節的前體製成低聚核苷酸類似物Ⅰ為止。
合成循環的各步驟可匯集表示如下步驟 試劑/溶劑 體積1-洗滌 二氯甲烷 4ml2-去保護2.5％(體積)二氯乙酸於二氯甲烷中4-5ml3-洗滌 二氯甲烷 4ml4-洗滌 吡啶-乙腈(1∶1體積比) 4ml5-偶聯ⅰ)化合物H(60mM)於吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)的溶液 400μl用新戊醯氯(121mM)在吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)處理，並反應2×30分鐘。
ⅱ)為未改性的核苷H-膦酸鹽的單體 400μl(T)用新戊醯氯(182mM)在吡啶-乙腈 500μl(C)(1∶1體積比，200μl)處理並反應1分鐘的在吡啶-乙腈中(1∶1體積比，200μl(對於Tp)，200μl+100μl吡啶(對於Cp)單體溶液(300mM(對Tp)，200mM(對Cp))。6-洗滌 吡啶-乙腈(1∶1體積比) 4ml7．用適合的單體重複步驟1-6，一直到得到低聚核苷酸類似物的低聚核苷酸前體為止。進行單體加入的最初一個循環以後，在室溫下，在吡啶-水(8∶2體積比)中，用碘(0.2M)處理載體上的低聚物1小時，任選隨後用碘(0.2M)、吡啶-三乙胺-水(6∶1∶1體積比)在室溫下再處理1小時。這樣使核苷間鍵氧化。然後用吡啶-乙腈(1∶1體積比)洗滌載體，除去微量碘，隨後用乙醚洗滌。然後將載體空氣乾燥，轉移到塑料管中，在55℃下用氨水(30％)處理過夜。這樣從載體上除去低聚核苷酸類似物，分裂鹼保護基，同時原封不動留下5′-O-二甲氧基三苯甲基。這一處理後，按照標準步驟，將低聚核苷酸類似物溶液在低聚核苷酸純化柱上除去5′-O-二甲氧基三苯甲基(評價和分離合成的低聚核苷酸，應用生物系統，1992)。然後用聚丙烯醯胺凝膠電泳法，按標準的步驟純化低聚核苷酸類似物。
低聚核苷酸類似物Ⅰ的MALDI-TOF質譜分析計算質量4424.3Da測量值4423.8Da實施例2低聚核苷酸類似物25′TTT T*TC TCT CTC TCT3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為硫，R1為羥基。所有其他核苷間鍵為硫代磷酸酯。上述低聚核苷酸的固體相合成使用上述實施例1的方法進行，一直到最後的單體加入循環。用硫化反應代替實施例1中使用的用碘處理低聚物。因此，在最後的偶聯步驟後，按照A.Audrus和G.Zon，核酸研究討論會文集No.20,1988,121的步驟，在室溫下用硫(5％(重量/體積))在二硫化碳-吡啶-三乙胺(10∶10∶1體積比，2ml)中的溶液處理載體上的前體1-18小時，生成低聚核苷酸類似物2。在完成培育期後，用吡啶-乙腈(1∶1體積比)和乙醚洗滌載體，然後空氣乾燥。如實施例1描述的，從載體上除去低聚核苷酸類似物和除去保護基。
低聚核苷酸2的MALDI-TOF(負方式)質譜分析計算質量4649.3Da
測量值4642.8Da實施例3低聚核苷酸35′TTT T*TMeC TCT CTC TCT3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的核苷間鍵為磷酸二酯。Tme為在2′位存在α-甲氧基而不是氫原子的胸苷殘基。按實施例1所述的進行上述低聚核苷酸的固相合成，直到核苷殘基11。在這裡，在新戊醯氯(182mM)於吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)中存在下，用5′-二甲氧基三苯甲基-2′-O-甲基胸苷H-膦酸鹽(30mM)於吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)的溶液處理載體上的前體1分鐘，生成低聚核苷酸類似物3。合成的其餘部分按實施例1所述的進行。
低聚核苷酸類似物3的MALDI-TOF(負方式)質譜分析計算的質量4454.4Da測量值4448.6Da實施例4低聚核苷酸類似物45′TTT T*TMeC TCT CTC TCT3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為硫，R1為羥基。所有其他的核苷鍵合為硫代磷酸酯。Tme為在2′位有α-甲氧基而不是氫的胸苷殘基。按實施例3所述進行固相合成，而硫代和隨後的吸收和去封按上述實施例2中所述的進行。
低聚核苷酸類似物4的MALDI-TOF(負方式)質譜分析計算質量4679.3Da測量值4664.1Da實施例5低聚核苷酸類似物55′TTT*TT3′
式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他核苷間鍵為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的步驟進行這一製備，不同的是化合物H和化合物Tp是僅使用的核苷單體。
MALDI-TOF質譜分析計算的質量1457.1Da測量值1457.7Da實施例6低聚核苷酸類似物65′TTT TT*C TCT CTC TCT 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的核苷間鍵都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的一般步驟進行這一製備。
實施例7低聚核苷酸類似物75′T*T*T*T*T*C TCT CTC TCT 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他核苷間鍵都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的一般步驟進行這一製備，但由化合物H引入5個核苷殘基。
實施例8低聚核苷酸類似物85′CGA CTA TGC AT*T T*TC 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的核苷間鍵都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的一般步驟進行這一製備，但由化合物H引入兩個核苷殘基。當序列要求使用A或G核苷時，那麼實施例1方法的偶聯步驟改變如下ⅰ)用新戊醯氯(182mM)在吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl)處理，在吡啶-乙腈(1∶1體積比，200μl(對於Ap或Gp))中的30mM Ap或30mM Gp，並反應1小時。
低聚核苷酸類似物8的MALDI-TOF質譜分析計算的質量4514.1Da測量值4517.3Da實施例9低聚核苷酸類似物95′GCG T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*GC G 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的鍵合都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1和8的一般步驟進行這一製備，但由化合物H引入10個核苷殘基。
實施例10低聚核苷酸類似物105′TT T TT*C*TCT CTC TCT 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的鍵合都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的一般步驟進行這一製備，不同的是，當C*殘基要引入時，單體化合物J用來直接代替化合物H。
實施例11低聚核苷酸類似物115′TTT TTT TTT TTT TTT T*T*T*T3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為氧，R1為羥基。所有其他的鍵合都為磷酸二酯鍵合。
用實施例1的一般步驟進行這一製備，但由化合物H引入3個核苷殘基。
實施例12低聚核苷酸類似物125′T*T*C*T*C*G CCC GCT CC*T*C*C*T*C*C 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為硫，R1為羥基。所有其他的鍵合都為硫代磷酸酯。
用實施例2的一般步驟進行這一製備。如實施例8中所述引入G殘基，而如實施例10所述引入C*殘基。
實施例13低聚核苷酸類似物135′T*T*C*T*C*G CTG GTG AGT*T*T*C*A 3′式中，*為式Ⅰ的核苷間鍵，其中X為硫，R1為羥基。所有其他鍵合都為硫代磷酸酯。
用實施例12的一般步驟進行這一製備。如實施例8中所述引入A殘基。
實施例14如在「低聚核苷酸和類似物，一種實施方法」，F.Eckstein編輯，IRL出版，1991中所述，用固相亞氨膦酸酯低聚核苷酸合成法製備有序列5′TTT tTC TCT CTC TCT 3′的低聚核苷酸類似物1，其中t為由化合物M得到的核苷單元，不同的是，在合成中的適宜點，用化合物M代替一般的3′-亞氨膦酸酯取代的核苷，以致生成有式ⅩⅣ核苷間鍵的低聚核苷酸前體，其中R1a為-OCH2CH2CN，然後在標準的氧化步驟中氧化成有式ⅩⅤ核苷間鍵的低聚核苷酸，其中R1a為-OCH2CH2CN和X為氧，這一低聚核苷酸進一步偶聯得到低聚核苷酸類似物1。
權利要求
1．一種有10-200個天然的和/或合成的核苷單元的低聚核苷酸類似物，核苷單元通過核苷間鍵連接，其中至少一個核苷間鍵為下式
式中，所示的亞甲基連接到核苷的3′位碳原子上，所示的氧原子連接到相鄰核苷的5′位碳原子上，R1為氫、羥基、O-、硫醇基、S-、-NH2或式R1a、-OR1a、-SR1a、-NHR1b或-NR1bR1c中的一個基團，其中R1a為未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，R1b和R1c各自獨立為未取代的或取代的C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基或C7-C13芳烷基，或R1b和R1c與連接在上面的氮原子一起構成5元或6元雜環，以及X為氧或硫。
2．根據權利要求1的低聚核苷酸類似物，其中它有15-40個核苷單元。
3．根據權利要求1的低聚核苷酸類似物，其中它有15-25個核苷單元。
4．根據權利要求1、2或3的低聚核苷酸類似物，其中所有的核苷間鍵都為式Ⅰ。
5．根據權利要求1、2或3的低聚核苷酸類似物，其中至多75％的核苷間鍵為式Ⅰ。
6．根據權利要求5的低聚核苷酸類似物，其中至多50％的核苷間鍵為式Ⅰ。
7．根據權利要求6的低聚核苷酸類似物，其中至多25％的核苷間鍵為式Ⅰ。
8．根據上述權利要求中任一項的低聚核苷酸類似物，其中至少兩個連續的核苷間鍵為式Ⅰ。
9．根據權利要求1-7中任一項的低聚核苷酸類似物，其中式Ⅰ的核苷間鍵用其他核苷間鍵交替。
10．根據權利要求1-3和5-9中任一項的低聚核苷酸類似物，其中其餘的核苷間鍵為磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵合或其兩個或兩個以上的混合物。
11．根據權利要求10的低聚核苷酸類似物，其中其餘的核苷間鍵為硫代磷酸酯鍵合。
12．根據權利要求10或11的低聚核苷酸類似物，其中在有式Ⅰ的核苷間鍵或有它與硫代磷酸酯或磷酸二酯鍵合混合物的兩個區域之間含有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯核苷間鍵的區域。
13．根據上述權利要求中任一項的低聚核苷酸類似物，其中至少一個核苷在其2′位被改性。
14．根據權利要求13的低聚核苷酸類似物，其中至少一個核苷在2′位有滷素原子或式-OR2的基團，其中R2為C1-C10脂族基團。
15．根據權利要求14的低聚核苷酸類似物，其中至少一個核苷在2′位有基團-OR2，其中R2為未取代的或取代的C1-C10烷基。
16．根據權利要求15的低聚核苷酸類似物，其中R2為C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的C1-C4烷基或式-(CH2CH2O)-nR3基團，其中R3為甲基或乙基，n為2-4。
17．根據權利要求16的低聚核苷酸類似物，其中R2為甲基、乙基、甲氧基乙基、乙氧基乙基或式-(CH2CH2O)-3CH3的基團。
18．根據權利要求13-17中任一項的低聚核苷酸類似物，其中至少兩個連續的核苷在2′位被改性，並通過磷酸二酯核苷間鍵連接和/或在2′位未改性的核苷和在2′位改性的核苷的5′位碳原子之間有式Ⅰ的鍵合。
19．根據上述權利要求中任一項的低聚核苷酸類似物，其中R1a、R1b或R1c作為烷基、鏈烯基、環烷基、芳基或芳烷基是未取代的或被羥基、C1-C4烷氧基、滷素、氰基、三(C1-C15烴基)甲矽烷基或伯、仲或叔氨基取代的。
20．根據上述權利要求中任一項的低聚核苷酸類似物，其中R1為氫、羥基、O-、SH、S-、未取代的或取代的C1-C4烷基或苯基、-OR1a的基團，其中R1a為未取代的或取代的的C1-C4烷基、C3-C5鏈烯基、C5-C8環烷基或C7-C9芳烷基或式-SR1a的基團，其中R1a為未取代的或取代的的C1-C4烷基或苯基。
21．根據權利要求20的低聚核苷酸類似物，其中R1為氫、羥基、O-、SH、S-、甲氧基、乙氧基或2-氰基乙基。
22．根據上述權利要求中任-項的低聚核苷酸類似物，其中它與人體C-raf激酶的mRNA區域是互補的。
23．根據權利要求22的低聚核苷酸類似物，其中核苷序列為
24．根據權利要求1-21中任一項的低聚核苷酸類似物，其中它與人體PKC-α的mRNA區域是互補的。
25．根據權利要求24的低聚核苷酸類似物，其中核苷序列為
26．一種製備有至少一種式Ⅰ的核苷間鍵的低聚核苷酸類似物的方法
式中，R1和X規定如上，該法包括(ⅰ)在(A)有5′位羥基的天然或合成核苷或低聚核苷酸和(B)在3′位有能與所述的5′位羥基反應的基團的天然或合成核苷或二聚核苷酸之間進行偶聯反應或順序偶聯反應，一直到得到有所需核苷數目的低聚核苷酸為止，其中至少一個所述的偶聯反應中為下式的核苷(B)在位阻的有機醯滷或酸酐存在下與(A)反應，
式中，B1為核苷鹼基團，R4為羥基保護基，R5為氫、羥基或2′位改性原子或基團，M+為金屬或未取代的或取代的銨離子或雜環鹼的陽離子，X為氧或硫，生成有下式亞膦酸酯核苷間鍵的低聚核苷酸類似物，
式中，X為氧或硫，以及(ⅱ)(a)亞膦酸酯鍵合氧化，或(b)亞膦酸酯鍵合硫化，或(c)亞膦酸酯鍵合與式R1aY的化合物反應，其中R1a如權利要求1規定的，Y為離去原子或基團，或(d)亞膦酸酯鍵合與式R1aOH的醇或式R1bNH2或R1bR1cNH的胺氧化和反應，其中R1a、R1b、和R1c如權利要求1規定的，或(e)亞膦酸酯鍵合甲矽烷化以及甲矽烷化的鍵合與硫代烷基化劑或硫代芳基化劑反應，生成式Ⅰ的亞膦酸酯鍵合，其中R1為SR1a，其中R1a如權利要求1規定的。
27．根據權利要求26的方法，其中低聚核苷酸類似物進一步反應，用氫代替保護基R4，或在R4為低聚核苷酸類似物中的末端核苷的場合下，用5′位改性基團代替保護基R4。
28．根據權利要求26或27的方法，其中包括按權利要求26中所述與連接到固體載體上的核苷或低聚核苷酸(A)進行順序偶聯反應(ⅰ)和步驟(ⅱ)，然後(ⅲ)從固體載體上分離低聚核苷酸，並除去保護基，得到有末端5′位游離羥基的低聚核苷酸，以及(ⅳ)任選使5′位游離羥基反應，在末端5′位引入改性基團。
29．根據權利要求26、27或28的方法，其中在式Ⅱ中，B1為嘧啶鹼，R4為甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基，R5為氫，M+為未取代的銨、一、二或三C1-C10烷基-或羥烷基-銨離子，或者雜環鹼的陽離子。
30．根據權利要求26-29中任一項的方法，其中式Ⅱ的核苷為下式的立體異構體
式中，B1、R4、R5、X和M+如權利要求26規定的。
31．根據權利要求26-30中任一項的方法，其中式Ⅱ核苷與A在位阻的有機醯滷存在下的偶聯反應在環中有叔氮原子的雜環鹼或其氧化物存在下進行。
32．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中氧化(ⅱ)(a)通過用碘和水或用叔丁基氫過氧化物處理來實現。
33．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中硫化(ⅱ)(b)通過在叔胺存在下，在有機溶劑中用硫處理來實現。
34．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中式1A的亞膦酸酯核苷間鍵與式R1aY化合物的反應(ⅱ)(c)在強鹼存在下進行，其中R1a為權利要求1中規定的烷基、環烷基或芳烷基，Y為滷素。
35．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中式1A的鍵合與式R1aY化合物的反應(ⅱ)(c)在鈀催化劑存在下進行，其中R1a為鏈烯基或芳基滷化物或三氟甲磺酸酯。
36．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中式1A的亞膦酸酯核苷間鍵與式R1aOH醇的氧化反應(ⅱ)(d)通過在醇R1aOH和鹼存在下與氧化劑的反應來進行。
37．根據權利要求36的方法，其中氧化劑為碘、四氯化碳或-溴三氯甲烷，而鹼為吡啶。
38．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中式1A的亞膦酸酯核苷間鍵與式R1bNH2或R1bR1cNH(其中R1b和R1c如權利要求1規定的)和四氯化碳或-溴三氯甲烷或碘進行氧化反應(ⅱ)(d)，得到本發明低聚核苷酸類似物，其中R1分別為-NHR1b或-NR1bR1c。
39．根據權利要求26-31中任一項的方法，其中式1A的亞膦酸酯鍵合的反應(ⅱ)(e)通過以下步驟進行鍵合用三烷基甲矽烷基滷和鹼甲矽烷基化，然後甲矽烷基化的鍵合與硫代烷基化劑或硫代芳基化劑反應。
40．根據權利要求39的方法，其中硫代烷基化劑或硫代芳基化劑為式ArSO2SR1a的硫代磺酸酯，其中R1a為權利要求1規定的，Ar為芳基。
41．根據權利要求26-40中任一項的方法，其中當在固體載體上合成出有所需數目核苷的低聚核苷酸類似物時，在處理除去羥基保護基團前後，用濃氨水處理，將它從固體載體上分離。
42．根據權利要求26-40中任一項的方法，其中羥基保護基團通過用有機酸水溶液處理來除去。
43．根據權利要求26-42中任一項的方法，其中式Ⅱ的核苷用下式的二核苷酸代替，
式中，B1、R1、R4和R5為權利要求26規定的，B2為核苷鹼基團，R6為氫、羥基或2′位改性原子或基團，R7為能與核苷中5′位羥基反應的或活化反應的基團。
44．根據權利要求43的方法，其中式Ⅷ中的R7O為H-膦酸鹽基、亞氨膦酸酯基或磷酸二酯基。
45．一種下式的二核苷酸
式中，B1、B2、R1、R4為權利要求43規定的，R5和R6為權利要求43規定的，不同的是，在R1不為氫的場合下，R5和R6中至少一個為2′位改性原子或基團，R9為權利要求43中規定的R7或羥基保護基團。
46．一種含有權利要求1-25中任一項的低聚核苷酸或權利要求45的二核苷酸作為有效成分的藥物組合物。
47．一種治療病毒或蛋白質調控的疾病的方法，該法包括給療需要的哺乳動物服用權利要求1-25中任一項的低聚核苷酸或權利要求45的二核苷酸。
全文摘要
一種有10—200個天然的和/或合成的核苷單元的低聚核苷酸類似物,核苷單元通過核苷間鍵連接,其中至少一個核苷間鍵為右式。式中,所示的亞甲基連接到核苷的3′位碳原子上,所示的氧原子連接到相鄰核苷的5′位碳原子上,R
文檔編號A61P35/00GK1212701SQ9719276
公開日1999年3月31日 申請日期1997年2月24日 優先權日1996年3月5日
發明者A·D·巴克斯特, S·P·科林伍德, M·E·道格拉斯, R·J·泰勒 申請人:諾瓦提斯公司