納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法及試劑盒的製作方法

2023-10-26 05:05:47 3

專利名稱：納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法及試劑盒。
背景技術：
魚蝦蟹貝和兩棲爬行動物的病毒性疫病是嚴重威脅水生動物養殖業健康發展和物種多樣性和環境生態安全的關鍵因素。如何能夠高效能的從水生動物生活水體中吸附富集染疫水生動物排放到生活水體中的病毒顆粒用於實驗室的疫病病原微生物檢測，是一項非常有意義的工作。目前，水生動物疫病檢測標準中規定的樣品採集方法一般都是針對活體動物或瀕死動物的組織臟器進行採樣，然後研磨組織樣品以後進行病毒的分離培養和病毒鑑定。如鯉春病，一般病魚的初步診斷是根據病魚外表特徵與臨床症狀作出初步判斷。 春季水溫低於20°C時，養殖鯉易出現典型的SVC症狀。有時魚類大規模死亡時並無明顯外表症狀，需通過解剖觀察內部器官典型症狀。病料宜採集肝、腎、脾和腦。血液、腦病毒滴度不高，但持續時間最長，而鰓、血液和腸病料存在幹擾物。OIE建議，幼魚宜採集腎和腦病料為佳，較大魚應採集肝腎、脾和腦組織為佳。實驗室確診可用EPC等敏感細胞培養分離病毒，然後採用病毒中和試驗、免疫螢光試驗、酶聯免疫吸附試驗或PCR等方法鑑定。上述方法可用於發病魚或無症狀染疫魚檢測。也可以採用免疫螢光試驗、酶聯免疫吸附試驗或PCR 等方法直接檢測病料中的病原，但確診須通過培養法分離病毒，以防假陽性。

發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法。該方法可以有效富集水生動物，例如魚類、兩棲類、爬行類動物生活水體中的水病毒(如魚類和蛙病毒屬病毒)，並能預擴增和保持富集的水病毒的活性，適用於漁場和野外水域中水病毒的監測和檢測採樣。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的試劑盒。為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案是
本發明提供一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法，該方法包括以下步驟
(1)將納米富集材料加入到20L 30L水生動物生活水體中富集水病毒；
(2)對步驟(I)的水生動物生活水體進行粗過濾，得到沉澱物；
(3)將沉澱物放入病毒釋放緩衝液中，混勻後靜置，得到上清液；
(4)將上清液與納米磁珠混勻，靜置，使病毒吸附在納米磁珠上；
(5)加入磁鐵，混勻後靜置，使納米磁珠吸在磁鐵上；(6)取出磁鐵，將磁鐵放入病毒活性保存液中，病毒釋放在保存液中，並在相應的敏感魚類細胞系內進行預擴增。其中，所述納米富集材料為用於富集水生動物淡水生活水體中水病毒的納米富集材料I，該納米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成；或用於富集水生動物海水生活水體中水病毒的納米富集材料II，該納米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成；
所述納米磁珠為粒徑10-12nm的Fe3O4納米磁珠；
所述病毒活性保存液為含2%小牛血清的細胞培養液，例如199細胞培養液、MEM細胞培養液、L15細胞培養液等；並且在細胞培養液中添加了相應的敏感魚類細胞，青黴素(100U/ ML)、鏈黴素(O. lmg/ML)和制黴菌素(25U/ML)，並且調最終細胞培養液的pH為7. 5^8. 5。所述魚類細胞為CO (Ovary of grass carp 草魚性腺細胞)，EPC (Epithelioma Papulosum Cyprini 鯉魚上皮瘤細胞)，FHM(fathead minnow 胖頭魚肌肉細胞)，CLC (Carp leucocytes cell 鯉魚白血球細胞)，CIK(kidney of grass carp 草魚腎臟細胞)，CHSE (chinook salmon embryo 大菱大馬哈魚胚胎細胞)，CCO (Channel catfish ovary It魚性腺細胞)，BF_2 (Bluegill fry 藍太陽魚觸細胞)，Rl (liver of rainbow trout 虹鱒魚肝細胞)，RTG-2 (rainbow trout gonad虹鱒魚性腺細胞)中的一種或幾種。根據目的要富集和預繁殖的病毒種類選擇相應的敏感細胞系。進一步地，步驟(I)中，富集水病毒的具體方法為將IOg 50g納米富集材料加入到 20L 30L水生動物生活水體中，攪拌3min使之混勻，然後靜置0. 5tT24h。進一步地，步驟(2)中，過濾時採用濾紙進行過濾。進一步地，步驟(3)中，所述病毒釋放緩衝液為含有3%牛肉膏的0.05mol/L甘氨酸的水溶液，PH值為9. 5，所述沉澱物與病毒釋放緩衝液的質量體積比為質量體積比為 Ig:I 5ml ο進一步地,步驟(4)中,所述納米磁珠與上清液的質量體積比為lg:l、0ml。本發明還提供了一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的試劑盒， 該試劑盒是由以下試劑組成
試劑A :納米富集材料I，所述納米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成；
試劑B :納米富集材料II，所述納米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成；
試劑C :濾紙；
試劑D :病毒釋放緩衝液；
試劑E :納米磁珠，所述納米磁珠為粒徑10-12nm的Fe3O4納米磁珠，分散性能良好，粉體飽和磁化強度為64-65emu/g,超順磁性能良好；
試劑F :磁鐵；
試劑G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液為含2%小牛血清的細胞培養液，並且在細胞培養液中添加了相應的敏感魚類細胞、100U/ML青黴素、0. lmg/ML鏈黴素和25U/ML制黴菌素，所述細胞培養液的PH為7. 5^8. 5。所述魚類細胞為草魚性腺細胞、鯉魚上皮瘤細胞、胖頭魚肌肉細胞、鯉魚白血球細胞、草魚腎臟細胞、大菱大馬哈魚胚胎細胞、鯰魚性腺細胞、藍太陽魚鰓細胞、虹鱒魚肝細胞、虹鱒魚性腺細胞中的一種或幾種。所述病毒釋放緩衝液為含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值為
9.5。本發明的有益效果
(I)本發明利用納米材料對病毒顆粒高吸附性能，以及磁性納米顆粒的磁性能有效地從水體中富集分離出一系列水病毒，例如鯉春病病毒、傳染性造血器官壞死病病毒、病毒性出血性敗血症病毒、錦鯉皰疹病毒、傳染性胰臟壞死病病毒、流行性造血器官壞死病毒、錦鯉皰疹病毒、蛙病毒屬病毒、鮭魚傳染性貧血症病毒、對蝦白斑症病毒、對蝦桃拉症候群病毒、黃頭病病毒、傳染性皮下和造血組織壞死病毒、對蝦杆狀病毒病等。所述方法及試劑盒的應用能夠替代採集活體水生動物送檢實驗室的工作，對水生動物個體沒有損傷，減少了樣品運輸費用和剖檢動物的工作量。降低了水生動物疫病在樣品運輸過程中造成的疫病流行的可能性。(2)本發明的水生動物病毒保存液可以達到將相應的病毒加入相應的敏感細胞系培養懸液中進行病毒預繁殖擴增的效果，以及保證水生動物病毒在長途運輸中的活性的保護，以及防範細菌和真菌汙染的措施，較高的pH值可以保證病毒從磁珠上的釋放效果和防範培養液PH值下降帶來的病毒降解的可能。具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。但這些實施例僅限於說明本發明而不用於限制本發明的保護範圍。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I納米富集材料的製備
所述納米富集材料為用於富集水生動物淡水生活水體中水病毒的納米富集材料I，該納米富集材料I是由滑石粉、硅藻土(型號TP950)和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成；或用於富集水生動物海水生活水體中水病毒的納米富集材料II，該納米富集材料II 是由滑石粉、硅藻土 (型號TP950)和商品化的固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成。通常在富集20L-30L生活水體中的病毒時，加入10g^50g的上述納米富集材料。實施例2納米磁珠的製備
本發明所述的Fe3O4納米磁珠可以通過現有技術公開的方法來製備，但為了獲得更好的富集效果，本發明在此提供一種優選的製備方法。I.準確稱取FeCl3 · 6H20 21. 6g，FeCl2 · 4H20 9. 95g，將二者混合，加去離子水溶於500 ml容量瓶中，配置成一定濃度的鐵鹽溶液。2.準確稱取NaOH 20g,加蒸餾水溶於500ml容量瓶中，配置成lmol/L的NaOH溶液。3.將上述兩種溶液水浴加熱至70°C，保溫。4.取IOOmlNaOH溶液置於1200ml燒杯中，水浴鍋中加熱，溫度保持在70°C，並且進行機械攪拌，攪拌速率為200 r/rnin,用pH計實時監測溶液pH。5.用兩支酸式滴定管分別滴加鐵鹽溶液和NaOH溶液，調整酸式滴定管開關，使鐵鹽溶液的滴加速度為O. lml/s.根據反應溶液的pH變化，調整NaOH溶液的滴加速度，使整個反應過程中溶液PH保持在11 士 O. 2。
6.待鐵鹽溶液或NaOH溶液任何一種滴加完畢，則立刻終止反應。7.停止攪拌和水浴，將反應所得懸濁液置於永磁體上，在磁場條件下進行洗滌和分離。8.洗滌6-8次(約)後，向殘液中滴加硝酸銀溶液，若無白色沉澱產生，則證明產物己經洗滌乾淨。9.將沉澱物置於表面皿中放入真空乾燥箱進行乾燥，乾燥溫度為70°C，乾燥時間為8 h.
10.待乾燥箱中溫度降至室溫後，取出乾燥粉體，研磨，既得Fe3O4納米磁珠，其分散性能良好，粉體飽和磁化強度為64-65emu/g,超順磁性能良好。實施例3納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的試劑盒的組成及使用
試劑A :納米富集材料I，所述納米富集材料I是50g由滑石粉、硅藻土 (型號TP950)和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成；共70g。試劑B :納米富集材料II，所述納米富集材料II是50g由滑石粉、硅藻土 (型號 TP950)和固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成；共7(^。試劑C :濾紙；直徑9cm的快速定性濾紙。試劑D :病毒釋放緩衝液，所述緩衝液為含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH 值為 9.5 ; 100ml。試劑E :納米磁珠，所述納米磁珠為粒徑10_12nm的Fe3O4納米磁珠，分散性能良好，粉體飽和磁化強度為64-65emu/g,超順磁性能良好；lg。試劑F :磁鐵，直徑lcm。試劑G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液為含2%小牛血清的199細胞培養液，並且在該細胞培養液中添加了鋪滿瓶底80%以上的魚類細胞，青黴素(100U/ML)、鏈黴素(O. lmg/ML)和制黴菌素(25U/ML)，調最終細胞培養液的pH為8. 5左右。根據目的要富集和預繁殖的病毒種類選擇相應的敏感魚類細胞系。例如C0(0vary of grass carp 草魚性腺細胞),EPC(Epithelioma Papulosum Cyprini鯉魚上皮瘤細胞)， FHM (fathead minnow 胖頭魚肌肉細胞)，CLC (Carp leucocytes cell 鯉魚白血球細胞)， CIK(kidney of grass carp 草魚腎臟細胞)，CHSE (chinook salmon embryo 大菱大馬哈魚胚胎細胞)，CCO (Channel catfish ovary It魚性腺細胞)，BF-2 (Bluegill fry 藍太陽魚觸細胞)，Rl (liver of rainbow trout 虹蹲魚肝細胞)，RTG-2 (rainbow trout gonad虹鱒魚性腺細胞)。利用本發明試劑盒富集水生動物生活水體中水病毒的具體方法
(1)先將50g納米富集材料I或II加入20L 30L水生動物生活水體中，攪拌3min使之混勻；然後常溫靜置0. 5tT24h;
(2)再輕輕攪勻上述經過吸附的生活水體，通過漏鬥用濾紙進行粗過濾，得到沉澱物；
(3)將沉澱物放入50ml病毒釋放緩衝液中，混勻後靜置10min，得到上清液；
(4)將上清液與Ig納米磁珠混勻，靜置lOmin，使病毒吸附在納米磁珠上；
(5)加入磁鐵，顛倒混勻後，靜置5min，使納米磁珠吸在磁鐵上；
(6)取出磁鐵，將磁鐵放入20ml的病毒活性保存液中即可。在4°C條件下保存液中的病毒活性可至少保持10天，冷凍條件下保存液中的病毒活性至少可以保存I年。實施例4大體積水生動物生活水體中水病毒的檢測及結果分析 I、淡水大體積生活水體中水病毒的檢測及結果分析
1.I模擬添加病毒檢測富集試劑盒的效果在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入 ImLSVCV細胞培養懸液(其TCID5tl為I. O X 10_6)中，充分均勻攪拌，然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行TCID5tl測試，結果為1.0X10'I. 2添加I尾注射感染SVCV鯉魚後病毒檢測富集試劑盒的效果在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入I尾注射感染SVCV的鯉魚，控制水溫在15°C左右，養殖10天，充分均勻攪拌水樣，然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行TCID5tl測試，結果為I. OX 10_3。I. 3添加I尾注射感染SVCV鯉魚，4尾正常鯉魚後檢測富集試劑盒的效果在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入I尾注射感染SVCV的鯉魚，4尾正常鯉魚，控制水溫在15°C 左右，養殖10天，循環水泵充分均勻攪拌水樣，然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行TCID5tl測試，結果為 I. 0X10'、海水大體積水生動物生活水體中水病毒的檢測及結果分析
2.I模擬添加病毒檢測富集試劑盒的效果在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入ImL 病毒性出血性敗血症病毒(VHSV)細胞培養懸液(其TCID5tl為I. OX 10_6)中，充分均勻攪拌， 然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行TCID5tl測試，結果為I. OX 10_2。I. 2添加I尾注射感染VHSV大菱鮃後病毒檢測富集試劑盒的效果在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入I尾注射感染VHSV的大菱鮃，控制水溫在15°C以下，養殖10天， 充分均勻攪拌水樣，然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3， 直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行TCID5tl測試，結果為I. OX 10_3。I. 3添加I尾注射感染VHSV的大菱鮃，4尾正常大菱鮃後檢測富集試劑盒的效果 在靜態觀賞魚養殖水族箱1000L水加入I尾注射感染VHSV的大菱鮃，4尾正常大菱鮃，控制水溫在15°C以下，養殖10天，循環水泵充分均勻攪拌水樣，然後取20L水樣，利用本試劑盒進行病毒的富集，富集方法同實施例3，直接取IOOul病毒活性保存液用EPC細胞進行 TCID5tl測試，結果為1.0X10'顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。
權利要求
1.一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)將納米富集材料加入到20L 30L水生動物生活水體中富集水病毒；(2)對步驟(I)的水生動物生活水體進行粗過濾，得到沉澱物；(3)將沉澱物放入病毒釋放緩衝液中，混勻後靜置，得到上清液；(4)將上清液與納米磁珠混勻，靜置，使病毒吸附在納米磁珠上；(5)加入磁鐵，混勻後靜置，使納米磁珠吸在磁鐵上；(6)取出磁鐵，將磁鐵放入病毒活性保存液中；其中，所述納米富集材料為用於富集水生動物淡水生活水體中水病毒的納米富集材料 I，該納米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成； 或用於富集水生動物海水生活水體中水病毒的納米富集材料II，該納米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成；所述納米磁珠為粒徑10-12nm的Fe3O4納米磁珠；所述病毒活性保存液為含2%小牛血清的細胞培養液，並且在細胞培養液中添加了魚類細胞、100U/ML青黴素、O. lmg/ML鏈黴素和25U/ML制黴菌素，所述細胞培養液的pH為7.5 8. 5o
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中，富集水病毒的具體方法為將 IOg 50g納米富集材料加入到20L 30L水生動物生活水體中，攪拌3min使之混勻，然後靜置O. 5h 24h。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中，過濾時採用濾紙進行過濾。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(3)中，所述病毒釋放緩衝液為含有 3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值為9. 5，所述沉澱物與病毒釋放緩衝液的質量體積比為Ig: I 5ml。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(4)中，所述納米磁珠與上清液的質量體積比為Ig: I 50mlO
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，步驟(6)中，所述魚類細胞為草魚性腺細胞、鯉魚上皮瘤細胞、胖頭魚肌肉細胞、鯉魚白血球細胞、草魚腎臟細胞、大菱大馬哈魚胚胎細胞、鯰魚性腺細胞、藍太陽魚鰓細胞、虹鱒魚肝細胞、虹鱒魚性腺細胞中的一種或幾種。
7.—種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒是由以下試劑組成試劑A :納米富集材料I，所述納米富集材料I是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:1混合製成；試劑B :納米富集材料II，所述納米富集材料II是由滑石粉、硅藻土和固體安全酸按照質量比為10:3:2混合製成；試劑C :濾紙；試劑D :病毒釋放緩衝液；試劑E :納米磁珠,所述納米磁珠為粒徑10-12nm的納米磁珠；試劑F :磁鐵；試劑G :病毒活性保存液，所述病毒活性保存液為含2%小牛血清的細胞培養液，並且在細胞培養液中添加了魚類細胞、100U/ML青黴素、O. lmg/ML鏈黴素和25U/ML制黴菌素，所述細胞培養液的PH為7. 5 8. 5。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述魚類細胞為草魚性腺細胞、鯉魚上皮瘤細胞、胖頭魚肌肉細胞、鯉魚白血球細胞、草魚腎臟細胞、大菱大馬哈魚胚胎細胞、鯰魚性腺細胞、藍太陽魚鰓細胞、虹鱒魚肝細胞、虹鱒魚性腺細胞中的一種或幾種。
9.根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述病毒釋放緩衝液為含有3%牛肉膏的O. 05mol/L甘氨酸的水溶液，pH值為9. 5。
全文摘要
本發明公開了一種納米吸附富集大體積水生動物生活水體中水病毒的方法及試劑盒。所述方法包括以下步驟(1)將納米富集材料加入到20L~30L水生動物生活水體中富集水病毒；(2)對步驟(1)的水生動物生活水體進行粗過濾，得到沉澱物；(3)將沉澱物放入病毒釋放緩衝液中，混勻後靜置，得到上清液；(4)將上清液與納米磁珠混勻，靜置，使病毒吸附在納米磁珠上；(5)加入磁鐵，混勻後靜置，將納米磁珠吸在磁鐵上；(6)取出磁鐵，將磁鐵放入病毒活性保存液中。本發明可以有效富集水體中的水病毒，並能預擴增和保持富集的水病毒的活性，適用於漁場和野外水域中水生動物生活水體中水病毒的監測和檢測採樣。
文檔編號C12N7/02GK102586197SQ201210059499
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者張利峰, 張旻, 張雷, 王姝, 高隆英 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局