肝活素製備方法

2023-05-12 12:25:01 1

專利名稱：肝活素製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物藥品的製備方法，尤指一種從江浙蝮蛇毒中提取精氨酸酯酶作為肝病治療藥的方法，利用這種方法可得高純度的精氨酸酯酶，使更加適合於應用在肝病治療藥中。
本發明的方法包括如下步驟步驟a取江浙蝮蛇毒凍乾粉溶於0.05M Tris-HCl，pH7.8緩衝液中，4℃下離心除去不溶物，取上清液；步驟b上清液先經DEAE纖維素DE-52柱層析，層析柱先用Tris-HCl緩衝液平衡後，用含NaCl的緩衝液從0至0.5M進行梯度洗脫，收集含精氨酸酯酶活性的組分，濃縮，去鹽後，進行下一步分離；步驟c用CM-Sepharose柱層析分離，平衡液是0.05M醋酸鈉pH5.0緩衝液，洗脫液含0至0.5M NaCl pH5.0的醋酸鈉緩衝液梯度洗脫，收集含精氨酸酯酶活性組分，濃縮，去鹽後再做下一步分離；步驟d用Sephadex-75柱層析凝膠過濾分離，洗脫液為0.05M NaHCO3含0.1M NaCl溶液，收集精氨酸酯酶組分，濃縮，去鹽，凍幹後得產品。
所說的去鹽是採用透析法，濃縮採用超濾濃縮法。
利用上述方法所得到的產品經動物試驗表明不含毒素及有害成分，純度在90％以上(HPLC法檢測)。
蝮蛇毒中含有二十多種酶類及毒蛋白，要高度純化其中一種成分的難度極大。本發明採用的三步層析分離法，能把精氨酸酯酶高度純化，除掉毒性成分，保證用藥的安全性。本發明的方法中首先經過初步除去不溶物後，即進行三步層析分離，第一步分離的目的在於初步純化，把精氨酸酯酶與蛇毒的其他成分分開，適於大規模加工，每次可用蛇毒原料20克。第二步分離是用陰離子交換劑，與第一步的陽離子交換劑不同，再次把鹼性蛋白質分離，使精氨酸酯酶的純度進一步提高。第三步分離是按分子量的差異把殘餘的毒素蛋白除盡。因蝮蛇神經毒素的分子量為15000，出血毒素約50000至60000，而精氨酸酯酶的分子量在30000左右，分子量間的差別大，容易用凝膠過濾(即分子篩)法把它們分開達到高度純化的目的，採用0.05M NaHCO3含NaCl的溶液作為洗脫液，可增加精氨酸酯酶的溶解度，從而獲取最大收率。用以上方法從蝮蛇毒1克可得到產品約3毫克，可裝針劑約30支，每支精氨酸酯酶為100單位。
權利要求
1.一種肝活素製備方法，其特徵是該方法包括如下步驟步驟a取江浙蝮蛇毒凍乾粉溶於0.05M Tris-HCl，pH7.8緩衝液中，4℃下離心除去不溶物，取上清液；步驟b上清液先經DEAE纖維素DE-52柱層析，層析柱先用Tris-HCl緩衝液平衡後，用含NaCl的緩衝液從0至0.5M進行梯度洗脫，收集含精氨酸酯酶活性的組分，濃縮，去鹽後，進行下一步分離；步驟c用CM-Sepharose柱層析分離，平衡液是0.05M醋酸鈉pH5.0緩衝液，洗脫液含0至0.5M NaCl pH5.0的醋酸鈉緩衝液梯度洗脫，收集含精氨酸酯酶活性組分，濃縮，去鹽後再做下一步分離；步驟d用Sephadex-75柱層析凝膠過濾分離，洗脫液為0.05M NaHCO3含0.1M NaCl溶液，收集精氨酸酯酶組分，濃縮，去鹽，凍幹後得產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所說的去鹽是採用透析法，濃縮採用超濾濃縮法。
全文摘要
本發明涉及從江浙蝮蛇毒中提取肝活素的方法,這種肝活素的主要成分為精氨酸酯酶,其藥理功能是降低血粘度,改善微循環,對肝炎病毒感染細胞的發展有抑制作用,能促進肝功能的恢復。由於江浙蝮蛇毒中含有神經毒素和出血毒素等有害成分,本發明的方法是利用經過三柱層板分離純化,能將這些毒性物質除掉,精氨酸酯酶的含量達90%以上。動物試驗表明毒性很小,試驗劑量為臨床用量的數十倍,因而可保證臨床用藥安全。
文檔編號C12N9/00GK1357623SQ0114431
公開日2002年7月10日 申請日期2001年12月14日 優先權日2001年12月14日
發明者周肖林, 陳遠聰 申請人:周肖林, 陳遠聰