用於肥胖症的小分子介入的製作方法

2023-08-10 10:09:36 2

專利名稱：：用於肥胖症的小分子介入的製作方法
技術領域：
：和產業適用性Prieurianin是革巴向脂肪生成的新型抗肥胖症藥物。Prieurianin抑制前脂肪細胞的增殖和分化，並降低分化的培養物中脂質陽性脂肪細胞的數量。另外，Prieurianin是用於探測脂肪生成的生物化學和生理學的重要藥理學工具。
背景技術：
：近年來，肥胖症發生率及其相關的健康問題的增加已經對全球醫療保健產生了明顯的影響。僅在美國，據估計大約三分之二的成年人過重，其中的三分之一認為是肥胖。肥胖症驚人的增長速率很大程度上源於久坐的生活方式習慣，伴隨過度消耗富含能量的食物，這些食物產生慢性的能量不平衡，而導致身體脂肪形式的體重增加。隨著肥胖的增加，患例如糖尿病、高血壓和心血管疾病的伴隨疾病(comorbidity)的風險也顯著提高了。也認識到不是所有的脂肪都生來等同，內臟脂肪組織而非皮下脂肪的積累增加了心血管疾病和代謝疾病的風險。事實上，肥胖症是觸發胰島素抵抗、血脂異常(特徵在於高三酸甘油酯血症)、低水平的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、小的密度HDL顆粒以及升高的磷脂轉移蛋白(PLTP)活性的發生。因此，在世界範圍內肥胖症流行的增加及其伴隨疾病的全部宿主保證了急需有效的治療性藥物和生活方式改變的發明，以對抗威脅全球數十億人的新出現的健康問題。十多年前，瘦素及其體重降低藥理學作用的發現產生了對脂肪組織功能的新理解。現在已知脂肪組織不僅儲存和釋放脂肪酸，也產生許多對體重調控和血糖內穩態有巨大影響的激素因子或脂肪因子。脂肪組織作為內分泌器官發揮作用，並且產生許多在食物攝取、能量消耗和一系列代謝過程中具有重要作用的物質。同時，脂肪細胞表達並釋放參與信號傳導通路並在能量儲存和新陳代謝中起到重要作用的蛋白質。這些進展還闡述了白色脂肪組織實際上在調控能量平衡中起到關鍵作用，並且作為介導許多生理學和病理學過程的分泌/內分泌器官發揮作用。白色脂肪組織量的調控異常引起肥胖症和脂肪萎縮。作為脂肪細胞大小和/或數量的改變而導致的白色脂肪組織量的改變，由前脂肪細胞的增殖和分化之間的複雜相互影響，以及脂肪細胞分泌的多種蛋白質和因子所調控。由脂肪組織釋放的主要激素因子之一是脂連蛋白(adiponectin)，其是最近發現的、僅由脂肪細胞產生的激素。脂連蛋白在血漿中大量存在，並且已經顯示其通過刺激脂肪酸氧化來升高胰島素敏感性，降低血漿三酸甘油酯以及改善糖代謝。脂連蛋白與肥胖負相關，並且其水平在肥胖受試者中顯著降低。在臨床上，血漿中降低的脂連蛋白水平也與肥胖症相關胰島素抵抗和動脈硬化相關聯。脂連蛋白的抗動脈粥樣化和抗炎症性質及其刺激胰島素敏感性的能力使得脂連蛋白成為以潛在治療性應用為目標的生理學研究和病理學研究的重要靶標。除了脂連蛋白，包括抵抗素(resistin)、內臟脂肪素(visfatin)、腫瘤壞死因子a和促醯化蛋白(acylation-stimulatingprotein)構成了多樣的脂肪細胞來源的激素和細胞因子，其編織成(orchestrate)脂肪組織對中心和外周代謝信號的應答。也確認這些蛋白中的一些作為候選藥物乾標用於開發療法以治療肥胖症，並且現在已經在藥物開發階段中。這些進展為可以在不久的將來使用藥物有效治療如今的肥胖症流行的提供了希望。肥胖症中的磷脂轉移蛋白(PLTP)-與肥胖症相關聯的血脂異常的標誌是高三酸甘油酯症、低HDLC和升高的血漿PLTP活性。在人類中，現在認為血漿PLTP活性在肥胖受試者中顯著升高，並且在與高血漿三酸甘油酯和肥胖症相關的胰島素抵抗和2型糖尿病受試者中也顯著升高。而且，胃束帶手術後的明顯體重損失導致PLTP活性的顯著降低。認為PLTP在調控HDL的大小和組成，並且因此控制血漿HDL水平中的反向膽固醇轉運中發揮功能。因此，肥胖個體中血漿PLTP活性的矛盾(paradoxical)升高產生了其在肥胖症中起何種作用的問題。PLTP的概要-人PLTP是一種主要的血清蛋白，其由在染色體20ql2-q13.1上的含16個外顯子、跨越大約13kb的基因編碼，cDNA為1750個鹼基對，476個胺基酸長。在SDS-PAGE上，純化的PLTP的分子量是大約81kDa，比從cDNA上預測的蛋白質質量大的多，其niRNA轉錄物在多種組織中可見，其中包括胰腺、肺、腎臟、心臟、肝臟、骨骼肌和大腦，並且在脂肪組織中的皮下脂肪組織和內臟脂肪組織之間顯示出貯藏相關差異。PLTP是脂多糖結合/脂轉移蛋白家族的成員，該家族包括膽固醇酯轉移蛋白、脂多糖結合蛋白和殺菌性/通透性增加蛋白。殺菌性/通透性增加蛋白的晶體結構說明該家族中的蛋白(包括PLTP)含有內在的脂結合位點，並且表現出作為在脂蛋白之間穿梭的載體蛋白發揮作用以再分配脂質。PLTP的預測模型結構由2個特徵為非極性殘基的脂結合凹陷(pocket)構成，其中N末端凹陷對PLTP轉移活性是關鍵的，而C末端凹陷涉及脂結合。PLTP的功能-促動脈粥樣硬化(proatherogenic)或抗動脈粥樣硬化(antiatherogenic)-在乳糜微粒和VLDL的血管內脂類分解作用期間，PLTP以反向的膽固醇轉運，運送多餘的表面磷脂和膽固醇從富含三酸甘油酯的脂蛋白至HDL。另外，體外研究顯示PLTP在脂蛋白和重構的嚢泡之間轉移不同的磷脂和游離膽固醇。PLTP也能夠修飾HDL顆粒尺寸的分布，被稱為HDL轉換或者重塑的過程產生前P-HDL的形成，其被認為是膽固醇的一種有效受體。另外，在通過同源重組敲除小鼠中的PLTP缺失提供了HDL水平的大約50%降低，從而說明其在從富含三酸甘油酯的脂蛋白至HDL轉移磷脂中的重要作用。有趣的是，過表達PLTP也降低血漿HDL水平。據信PLTP有抗動脈粥樣硬化的潛力，而其他人發現血漿PLTP水平和活性與冠狀動脈疾病正和對立相關，具有提高的懷疑患有動脈粥樣硬化風險的轉基因小鼠模型培育成PLTP敲除或者過表達小鼠，證明PLTP的促動脈粥樣硬化作用。另外，PLTPmRNA水平和活性始終與肥胖症相關，從而提示PLTP在調控身體脂肪中可能具有其他功能。還沒有完全理解PLTP和肥胖症之間的這種功能性意義，但推測PLTP合成的升高可能是脂肪組織的量增大的結果，因為在體重損失後PLTP活性下降。這些結果似乎與基因組範圍掃描研究相一致，該研究顯示與PLTP的染色體座內肥胖症相關表型聯繫的明顯證據。然而在幾個小鼠研究中，染色體2上的影響身體脂肪的基因與人染色體20q上的區域位於同一個染色體上。也顯示低水平PLTP與增加的腰圍直接相關。另外，矛盾的是，在秀麗隱杆線蟲中，通過RM幹擾失活PLTP基因引起脂肪儲存的增加，從而提示在哺乳動物PLTP同源物中的功能突變能導致肥胖症。本發明人在秦的美國專利號7，078，411中鑑定了用於升高反向膽固醇轉運的方法，其通過施用喜樹鹼或喜樹鹼衍生物來促進PLTP表達的增加。本發明人已經在本文中提供了用於以有效方式調控PLTP的進一步的進展。展。日、、，、、、<:另外，本文還提供了用於開發有效治療藥物以調控個體體重的進展。發明概述一方面，本發明涉及用於以轉錄方式激活磷脂轉移蛋白(PLTP)基因表達的方法，其通過施用有效量的檸檬苦素類化合物(limonoid)，例如prieurianin。另一方面，本發明涉及誘導顯著體重損失和/或食物攝取降低的方法，其通過施用有效量的prieurianin。另一方面，本發明還提供了以下各項減少內臟和皮下脂肪組織的方法，其包括施用有效量的prieurianin。降低血清非酯化脂肪酸水平的方法，其包括施用有效量的prieurianin。抑制前脂肪細胞的增殖和分化的方法，其包括施用有效量的prieurianin。引起在脂肪細胞中去分化或脂肪積累的損失的方法，其包括施用有效量的prieurianin。本發明另一方面涉及用於肥胖受試者的體重降低組合物，其包括檸檬苦素類化合物，例如prieurianin。在某些實施方式中，受試者包括哺乳動物。在另一方面中，本發明涉及用於探測脂肪生成的生物化學和生理學的藥學組合物，其包括檸檬苦素類化合物。本發明另一方面涉及用於刺激磷脂轉移蛋白(PLTP)反式激活(transactivation)的方法，其包括使用prieurianin來i秀導受試者體內體重和肥胖的減少。也提供了用於在受試者體內抑制前脂肪細胞增殖和用於阻止前脂肪細胞分化成成熟脂肪細胞的方法，該方法包括對受試者施用有效量的prieurianin。在某些實施方式中，受試者被認為是肥胖的。也提供了用於引起在分化的成熟脂肪細胞中的去分化或用於抑制在分化的成熟脂肪細胞中脂質的積累的方法。該方法包括對受試者施用有效量的prieurianin。在另一方面中，本發明涉及用於脂肪生成的一種或多種生物標誌物。在某些實施方式中，生物標誌物包括磷脂轉移蛋白(PLTP)。也提供了用於調控PLTP基因表達的方法，其包括施用有效量的prieurianin。也提供了用於阻止prieurianin對PLTP反式激活的方法，其包括施用有效量的星狀孢菌素(Staurosporine)。在閱讀附圖的指導下，從有限實施方式的以下詳細說明，本發明技術人員可以清楚本發明的多種目的和優點。圖1.通過DNA微陣列，顯示HepG2細胞對託泊替康的藥理學反應。用500nM託泊替康多次(A)或者多種濃度的託泊替康(B)處理HepG2！細胞24小時。樹狀示磷脂轉移蛋白(PLTP)的表達變化。(C)通過Northern印跡分析獨立地驗證了託泊替康對PLTP表達的i秀導。圖2.託泊替康對PLTP啟動子的反式激活。圖2A.託泊替康以劑量依賴方式反式激活融合至螢光素酶報告基因的1.5Kb的PLTP啟動子。圖2B.在含有融合至新黴素可選擇標記物盒的PLTP啟動子螢光素酶報告基因的HepG2轉基因細胞中，託泊替康激活PLTP啟動子，所述PLTP啟動子螢光素酶報告基因穩定轉染入HepG2細胞以產生轉基因系(上區)。託泊替康對PLTP啟動子的劑量依賴式誘導(下區)。結果是用海腎(^"i7/a)螢光素酶標準化後的三次實驗的平均S.E.。圖3.prieurianin對PLTP啟動子的反式激活。圖3A.在HepG2轉基因細胞中prieurianin對PLTP啟動子的劑量依賴反式激活。結果是用海腎(^/7//")螢光素酶標準化後的三次實驗的平均S.E.。圖3B.星狀孢菌素對PLTP啟動子的prieurianin反式激活的抑制。在存在或不存在星狀孢菌素下，用prieurianin處理轉基因HepG2/PLTPpLuc細胞。1，對照；2，DMSO;3,200nM星狀孢菌素；4、5和6分別是500、1000和2000nM的prieurianin;7、8和9分別是500、1000和2000nM大prieurianin+200nM的星狀孢菌素。結果是一式三份實驗的平均±S.E.。圖4.prieurianin對血液胰島素、糖和NEFA水平的作用。用5mg/kg的prieurianin處理正常和06/06小鼠，然後收集血清樣品用於(圖")胰島素；(圖4B)糖；和(圖4C)非酯化脂肪酸(NEFA)概要分析。結果是對每種處理的每組中3個動物的平均值。藍色柱，正常C57BL/6J;紅色柱，瘦素缺陷o6/o6小鼠。圖5.M/o6小鼠中prieurianin對脂肪生成的作用。用5mg/kg的prieurianin處理瘦素缺陷od/o6小鼠，切除皮下和內臟脂肪組織並稱重。結果是如指示(n)的每組3-5個動物的平均值。圖6.prieurianin抑制NIH-3T3/L1前脂肪細胞的增殖。用多種濃度(O.5、1和2pM)的prieurianin處理細胞，通過在7天裡每天計數來評估生長。結果是一式三份實驗的平均±S.E.。圖7.prieurianin抑制前脂肪細胞分化。誘導NIH-3T3/L1細胞進入分化，並同時用2pM的prieurianin處理。用油紅0染色分化的細胞-圖7A，未分化的對照。圖7B.分化的脂肪細胞。圖7C.存在2pM的prieurianin下，對分化的i秀導。圖7D.膜聯蛋白V結合磷脂醯絲氨酸的流式細胞學分析，凋亡細胞在右上象限。所有的實驗進行一式三份。圖8.prieurianin誘導分化的脂肪細胞的損失。將NIH-3T3/L1前脂肪細胞誘導進入分化。分化後5天，用多種濃度(O.5、1和2jiM)的prieurianin處理細月包以另外的5天，其後用油紅0染色。從一式三份實驗的代表中獲得顯微圖像。在510nm處，分光光度法定量陽性染色細胞的異丙醇提取物，顯示在右面的柱形圖中。結果是一式三份實驗的平均±S.E.。圖9.星狀孢菌素阻止prieurianin誘導的前脂肪細胞分化。在prieurianin(0.5、1和2jiM)中分化的前脂肪細胞一起用或不用200nM的星狀孢菌素處理。顯微圖像顯示了誘導後12天，油紅0染色的細胞。圖9A.未分化的；圖9B.分化的；圖9C.在2jiM的prieurianin中分化的；圖9D.在2pM的prieurianin和200nM的星狀孢菌素中分化的。柱狀圖顯示了來自細胞的油紅0染色異丙醇提取物對A510nm處的吸光度。結果是一式三份實驗的平均±S.E.。圖10.由前脂肪細胞和脂肪細胞，以及在正常小鼠血清中，脂連蛋白和PLTP的釋放。用2jtiM的prieurianin處理前脂肪細胞(B和D)，36小時後收集培養基用於前脂肪細胞(A和B)或者PLTP(C和D)的Western印跡分析。備選地，分化後5天，收集脂肪細胞的條件培養基(A和C)用於Western分析。E.給予prieurianin或託泊替康(0、2、5和10mg/kg)的正常C57BL/6J小鼠的血清通過Western印跡就PLTP進行分析。圖11.細胞毒性和非細胞毒性藥物反式激活PLTP啟動子。在HepG2轉基因細胞中，進行多種細胞毒性和非細胞毒性藥物反式激活PLTP啟動子的測量。結果是3次試驗的平均S.E.。圖12.制滴菌素A(TrichostatinA，TSA)對prieurianin反式激活PLTP啟動子的作用。在存在或不存在200nMTSA時，prieurianin劑量反應激活PLTP啟動子。結果是3次試驗的平均S.E.。圖13.在正常C45BL/6J或C57BL/6J瘦素缺失小鼠中，prieurianin處理對體重和食物才聶取的作用。圖l4.在正常C57BL/6J或C57BL/6J瘦素缺失小鼠中，prieurianin處理對血清脂蛋白、PLTP活性和痩素水平的作用。圖15.在c^/W和飲食誘導的肥胖Ceacs/z7+小鼠中，prieurianin的作用。圖15A.對10隻W/W和小鼠的組，每日i.p.給予3或5mg/kg的prieurianin以30天。圖15B.對遺傳糖尿病Cescayz/—^敲除小鼠飼餵高脂肪飲食以增肥4周，然後每日prieurianin處理(3或5mg/kg)21天。載體處理的M/W和Ceaca/z+小鼠給予等量的Captisol。結果是每組10隻動物的平均S.E.。圖16.在飲食誘導的肥胖C57B1/6J小鼠中，prieurianin的作用。對B6小鼠施以60%kcal的高脂肪飲食以大約15周，然後分成每組IO只，然後用1(綠色)或3(棕色)rag/kg的prieurianin每日腹腔內處理3周，並與未處理(藍色)或載體處理(紅色)的對照比較。圖16A.在3周的處理期間，用prieurianin處理的小鼠與對照比較的平均體重變化。圖16B.如在A中用prieurianin處理的B6小鼠的平均食物消耗。圖16C.如在文中描述的，用prieurianin以"開-關，，循環時間表處理4個循環的B6小鼠中的平均體重變化。結果是每組10隻動物，和3mg/kg組20隻小鼠的平均S.E.。圖17.用於克服藥物誘導的耐受性的"開-關"或"循環"處理時間表。該處理策略包括處理的特定劑量用於處理的特定持續時間並伴以間歇藥物休息期，能夠克服在代謝病症和其他病症的治療中藥物誘導的耐受性、脫敏或缺乏反應。圖18.在脂肪生成中，prieurianin對C/EBPa和p以及PPARY介導轉錄的作用。將對應於C/EBPa和p以及PPARy的反應元件克隆入pGL3鹼性螢光素報告基因質粒。在存在或不存在克隆入表達栽體的響應轉錄因子的情況下，用報告基因質粒共轉染Ll前脂肪細胞，其後用2nM的prieurianin處理。15-24小時後，收集細胞用於螢光素酶分析。結果是一式三份實驗的平均土S.E.。圖19.蟾蜍靈對前脂肪細胞分化以及脂肪細胞中的去分化/去脂的作用。誘導NIH-3T3/L1細胞進入分化並同時用1jiM的蟾蜍靈或2jiM的prieurianin處理。用尼羅紅對分化的細胞染色。備選地，誘導前脂肪細胞進入分化，並且在分化後5天用1的蟾蜍靈或2pM的prieurianin處理細胞以另外的5天，其後用尼羅紅染色。通過螢光顯微鏡檢查來評估染色的細胞。優選實施方式的詳細描述本系統提供了用於誘導PLTP基因表達的方法。本系統也提供了用於提高PLTP水平和調控反向膽固醇轉運的方法。在另一方面中，提供了提高PLTP水平和調控反向膽固醇轉運的的非毒性天然產物小分子。在秀麗隱杆線蟲中siRM誘導的PLTP損失升高了脂肪儲存。現在發現prieurianin反向激活PLTP基因表達，並且是拒食劑。在另一方面中，本文提供了使用prieurianin作為新型藥學組合物用於探測脂肪生成的生物化學和生理學的方法。prieurianin誘導PLTP基因表達並有效降低體重和脂肪量。prieurianin也抑制前脂肪細胞的增殖和分化，並且引起脂肪細胞去分化或者阻止脂肪細胞積累脂質。源於prieurianin對06/06小鼠的脂肪細胞的作用，以及其對培養的前脂肪細胞和脂肪細胞的抗脂肪生成作用，本發明人認為PLTP是prieurianin對體重和脂肪量降低的抗脂肪生成作用所需要的在另一方面中，提供了使用prieurianin作為有效抗肥胖症藥物的方法。在小鼠中測試其有效性，並且prieurianin顯著降低總體重、脂肪和食物攝取。該藥物也逆轉小鼠的高血糖狀態至與正常小鼠相當的水平。在另一個分子學研究中，認為prieurianin抑制前脂肪細胞的增殖，並且還阻止前脂肪細胞分化成脂肪細胞。Prieurianin能夠引起脂肪細胞的去分化或者阻止脂肪細胞積累脂質。Prieurianin抑制前脂肪細胞的脂連蛋白釋放，因此導致阻止前脂肪細胞分化成脂肪細胞。矛盾的是，儘管prieurianin誘導脂肪細胞中PLTP的分泌，但在前脂肪細胞中的PLTP釋放不被抑制。在細胞培養研究中，prieurianin與託泊替康相比是相對無毒的(數據未顯示)，並且在實驗的持續時間內在給予該藥物的動物中，沒有觀察到明顯的毒性。因此，prieurianin是具有靶向脂肪生成的抗肥胖症作用的天然產物小分子。在特定的實施方式中，本文顯示prieurianin在肥胖症小鼠才莫型中具有對產生體重損耗的作用，具有通過抑制食慾以及另外的通過其在抑制前脂肪細胞的增殖和分化、引起脂肪細胞的去分化和去脂中的特別的藥理學性質的多種潛在的致病機制。另外，本文顯示prieurianin的分子機制據信是其通過激活NFkB信號傳導通路和通過抑制C/EBPa和p以及PPARy介導的前脂肪細胞分化成脂肪細胞的轉錄激活，而抑制脂肪生成的轉錄調控的能力。現在通過如下非限制性的實施例示例說明上文描述的優點。實施例1-HepG2細胞對託泊替康的藥理學反應研究通過表達基因組對拓樸異構酶(Top)l抑制劑的抗性的機制，通過進行時間過程和劑量反應時間，用DNA微陣列來研究人肝細胞母細胞瘤HepG2細胞對託泊替康的藥理學反應，所述細胞用500nM的託泊替康(細胞毒性抗癌試劑)處理多種時間(0、1、3、5、10、15和24小時)或用多種劑量的託泊替康(0、10、50、100、300、500和1000nM)處理24小時。託泊替康誘導的整體基因表達變化是適度的，除了PLTP基因外，其他大多數基因表現出表達的低水平改變。圖1中的結果顯示了PLTP對託泊替康反應的時間過程(圖1A)和劑量反應(圖1B)表達的樹狀圖。託泊替康對PLTP表達的激活是是時間調控和劑量依賴的，具有晚期開始，在24小時達到峰值約20倍誘導。通過Northern印跡分析獨立地評估託泊替康誘導的PLTP表達，其顯示託泊替康以劑量依賴方式誘導PLTP(圖1C)，與在微陣列研究中觀察到的結果一致。PLTP基因表達的誘導是被託泊替康以轉錄方式調控，因為融合至螢光素酶報告基因的PLTP啟動子被託泊替康以劑量依賴方式反式激活(圖2A)，印跡分析。因此，Topl抑制劑誘導培養中的HepG2細胞中(參見圖1和2)以及小鼠體內的PLTP基因表達(數據未顯示)。另外，本發明人在本文中顯示PLTP用作肥胖症的生物標誌物，並且在肥胖症的脂肪生成中具有重要作用。實施例2.篩選PLTP基因表達的天然產物小分子誘導物PLTP涉及反向膽固醇轉運。而且，PLTP表達和活性與肥胖症相關。另外，通過RNA介導的幹擾失活PLTP基因表達之後的秀麗隱杆線蟲中脂肪儲存的增加表明靶向PLTP的小分子可用於開發治療肥胖症的藥物。為確定非細胞毒性小分子是否能誘導PLTP表達，本發明人將PLTP-啟動子螢光素酶報告基因亞克隆到含有新黴素(G418)抗性可選擇標誌物的栽體中，並通過穩定的基因轉染和用G418的選擇產生轉基因HepG2細胞系，該細胞系具有PLTP-啟動子螢光素酶報告基因。該轉基因細胞系HepG2/PLTPpLuc顯示出與用PLTP-啟動子報告基因瞬時轉染的HepG2細胞相似的託泊替康反應(圖2B)。隨後，用來自天然產物的小分子庫來篩選該轉基因細胞。Prieurianin顯示出最強的PLTP啟動子反向激活，並且顯示出劑量依賴方式的PLTP誘導(圖3A)。本發明人還發現星狀孢菌素抑制prieurianin對PLTP啟動子活性待反向激活，從而暗示prieurianin對PLTP表達轉錄調控被一種蛋白激酶所調控(圖3B)。實施例3.prieurianin的抗肥胖症作用關於prieurianin的已知很少。其是一種檸檬苦素類化合物，也是一種天然產物拒食劑(anti-feedant),其在培養中的果蠅細胞中表現出抗20-羥基蛻皮酮的拮抗作用。在細胞培養研究中，該藥物與託泊替康相比是相對地無細胞毒性。將prieurianin腹腔內施用至12-14周齡的正常C57BL/6J小鼠和遺傳瘦素缺陷小鼠，每周2次(2或5mg/kg)以2周。對照接受等量注射的藥物載體。每3天測量體重和食物攝取，並且在實驗結束時收集血液樣品。對於2或5mg/kg處理的瘦素缺陷oft/"小鼠在2周後，用prieurianin的處理產生多至10%總體重的劑量依賴式的下降(參見圖13其中包含的表1)。另外，相對與未處理和載體處理對照，在5mg/kg處理組中也觀察到多達50%的食物攝取的劑量依賴式下降。在正常C57BL/6J小鼠中也觀察到適度的體重損失以及減少的食物攝取。這些結果說明所得的體重損失和食物攝取下降歸因於prieurianin的拒食劑作用。實施例4.prieurianin的代謝作用肥胖症導致高血壓、高血清膽固醇、低HDL膽固醇和高血糖症，從而潛在地導致心血管疾病的高風險。腹部肥胖症特別與代謝風險因子相關。瘦素缺陷小鼠是高血脂和高血糖的。為測試prieurianin是否改變除了食慾以外的代i射和內分泌參數，測量了血清脂質情況、胰島素和糖水平。然而，在prieurianin處理和未處理正常對照以及。6/"小鼠中沒有觀察到三酸甘油酯的顯著變化(數據未顯示)。在正常未處理或載體處理小鼠中，用或不用prieurianin處理，膽固醇和HDL水平也保持相對不變(參見圖14，其中含有表2)。相反，儘管適度，但在prieurianin處理的ob/ob小鼠中，總膽固醇水平顯著降低。而且在prieurianin處理的ob/ob小鼠中的HDL水平，比未處理和載體處理動物中大約4氐2倍。用prieurianin處理也引起在正常C57BL/6J小鼠中血清PLTP活性的升高(圖14)。矛盾的是，給予prieurianin的ob/ob小鼠顯示出血清PLTP活性的降低，即使prieurianin激活了PLTP基因的表達(圖3)。然而，在prieurianin處理的ob/ob小鼠中PLTP活性的降低與在人肥胖受試者在體重損失後報導的情況一致。在正常小鼠中，用prieurianin的處理引起瘦素水平下降，但這在ob/ob小鼠中不能如預期的那樣檢測到(圖14)。ob/ob小鼠中的高血月旨症被逆轉至與prieurianin(5mg/kg)處理的ob/ob小鼠中正常對照相當的水平(參見圖4B)。在ob/ob小鼠中，prieurianin也引起胰島素水平降低大約3-4倍(參見圖4A)。然而，在正常C57BL/6J小鼠中，prieurianin處理不顯著改變胰島素和葡萄糖糖水平。脂解作用和脂肪酸調控通路中的紊亂在肥胖症病因學中是重要的。骨骼肌和脂肪組織攝取非酯化脂肪酸(NEFA)的改變是其在血漿總濃度的關鍵決定因素。如圖4C所示，與正常C57BL/6J小鼠相比，痩素缺陷ob/ob小鼠中的NEFA水平更高。在正常小鼠中用prieurianin處理導致NEFA水平的降低。然而，在ob/ob小鼠中，施用prieurianin後只觀察到NEFA水平的適度降低。實施例5.prieurianin對脂肪生成的作用為進一步檢查prieurianin對正常C57BL/6J小鼠和ob/ob小鼠的肥胖的作用，我們測量了它們的內臟和皮下體脂。與未處理和載體處理的對照相比，prieurianin處理的ob/ob小鼠中總體脂顯著下降大於50%(參見圖5)。任何劑量prieurianin的都沒有顯著改變正常C57BL/6J小鼠的百分比體脂(數據未顯示)。之前已經顯示TNFa、IL-1(3、IFNy或TGFpi完全抑制培養中的前脂肪細胞分化成成熟的脂肪細胞，這與脂連蛋白釋放的消失相伴。因為prieurianin顯著減少ob/ob小鼠中皮下和內臟脂肪組織(參見圖5)，本發明人在細胞培養研究中檢查了其對以下各項的作用(i)前脂肪細胞的增殖；(ii)前脂肪細胞分化成脂肪細胞；和(iii)對脂肪細胞的脂質積累的抑制或去分化的促進。如圖6所示，prieurianin以劑量依賴方式抑制NIH-3T3/L1前脂肪細胞的增殖。2jiM的prieurianin在第7天觀察到顯著的抑制(50%)。為確定prieurianin對前脂肪細胞分化成脂肪細^^的作用，在開始誘導分化的同一時間，用或不用所述藥物處理NIH-3T3/L1前脂肪細月包。我們發現prieurianin也以劑量依賴方式防止前脂肪細胞分化成脂質積累的脂肪細胞，在與未處理/未分化以及分化的對照相比，油紅O染色的脂質積累脂肪細胞的數量顯著減少是明顯(參見圖7A-C)。有趣的是，與前脂肪細胞相比，prieurianin處理的前脂肪細胞獲得了十分不同的形態(圖7C)，並且沒有如通過缺少膜聯蛋白V結合至磷酯醯絲氨酸所示的差異誘導前脂肪細胞的細胞調亡(參見圖7D)。在未處理或載體處理對照和藥物處理的分化細胞之間的細胞數量是相對地相當的(數據未顯示)。這些結果說明prieurianin抑制前脂肪細胞的增殖，也防止前脂肪細胞分化成成熟的脂肪細胞。為評估prieurianin是否對分化的脂肪細胞具有任何作用，使前脂肪細胞分化成脂肪細胞，然後進一步培養大約5天，之後用prieurianin處5裡月旨肪細月包以另夕卜的5—6天，其後通過油紅0染色用於脂質積累脂肪細胞的存在。在prieurianin處理的細胞(參見圖8，下區)中觀察到油紅0染色的細胞數量的很大程度的劑量依賴式降低，而載體處理的細胞顯示出與分化的對照相當數量的脂質陽性染色細胞。當用油紅0染色A510吸光度定量時，我們顯示在2nM的prieurianin,脂質陽性細胞幾乎沒有或者其數量降低到與未分化對照相當的水平(參見圖8,右邊的柱狀圖)。這些結果還暗示，除了抑制前脂肪細胞增殖和阻止其分化，prieurianin也作用於分化的成熟脂肪細胞，這是通過引起其去分化或抑制其脂質的積累。實施例6.星狀孢菌素部分地逆轉prieurianin對分化的抑制prieurianin對PLTP的反向激活可被星狀孢菌素所阻止(參見圖3B)，星狀孢菌素是"常規，，蛋白激酶C(PKC)異構酶的有效抑制劑。我們也顯示prieurianin對PLTP的轉錄方式激活抑制前月旨肪細胞分化(參見圖7)。為評估通過星狀孢菌素抑制prieurianin介導的PLTP反向激活是否逆轉對分化的阻止，在存在prieurianin(0、0.5、1和2nM)同時有或沒有200nM的星狀孢菌素情況下誘導前脂肪細胞的分化。與上述結果相一致(參見圖7),在沒有星狀孢菌素情況下，2fiM的prieurianin幾乎完全抑制前脂肪細胞分化(參見圖9C)。在分化豫導的同時加入星狀孢菌素部分地逆轉prieurianin產生的抑制(參見圖9D),而單獨的星狀孢菌素沒有顯示出可觀察到的對分化的作用(數據未顯示)。通過監視油紅0染色的前脂肪細胞的異丙醇提取物的AM。吸光度來驗證這些結果。Prieurianin以劑量依賴方式抑制前脂肪細胞分化，並且該抑制被星狀孢菌素部分地逆轉(參見圖9，柱狀圖)。因此，本發明人現在認為暗示prieurianin謙導的PLTP表達是抑制前脂肪細胞分化所需要的。實施例7.prieurianin對脂肪因子(adipokine)和PLTP分泌的作用脂肪組織含有多種類型的細胞，其中包括前脂肪細胞和脂肪細胞。而且，前脂肪細胞分泌涉及其自身分化的因子。一旦分化，成熟的脂肪細胞獲得通過分泌瘦素和脂連蛋白遠距離與其他器官(包括腦、肝和骨骼肌)，局部與其他細胞(例如前脂肪細胞、內皮細胞和單核細胞/巨噬細胞)通訊的能力。另外，抗脂肪生成細胞因子阻止前脂肪細胞的脂連蛋白釋放。因此，評估了前脂肪細胞和脂肪細胞的脂連蛋白和PLTP的生產。在用prieurianin處理後大約36小時，觀察對前脂肪細胞釋放脂連蛋白進入條件培養基的抑制(參見圖10B)。託泊替康誘導PLTP的表達(參見圖10)，其也顯著地抑制NIH-3T3/L1前脂肪細胞產生脂連蛋白(圖10B)。這些結果與之前的報導相一致，即對前脂肪細胞分化的阻止伴隨對脂連蛋白釋放的抑制。另外，prieurianin而不是託泊替康誘導在分化的脂肪細胞中脂連蛋白的高分子量形式的產生和釋放，以及總脂連蛋白分泌的適度增加(參見圖10A)。也評估了前脂肪細胞和脂肪細胞的PLTP的表達和分泌。因此，前脂肪細胞產生和分泌PLTP的低和高分子量形式，而脂肪細胞僅分泌低分子量形式進入條件培養基(參見圖10C和10D)。意外的是，在用託泊替康或prieurianin處理前脂肪細胞後，降低PLTP低分子形式的釋放，而沒有降低其高分子形式的釋放(參見圖10D)。相反，託泊替康或prieurianin僅誘導脂肪細胞中低分子量形式釋放的增加(參見圖10C)。前脂肪細胞和脂肪細胞之間PLTP釋放的這些不同概況暗示對prieurianin藥理學作用的複雜內源性生理學反應。實施例8.prieurianin和託泊替康處理後的血清PLTP蛋白水平在微陣列分析中對託泊替康的時間過程和劑量反應研究顯示PLTP是在所述藥物處理後大約12-15小時開始誘導的晚期基因(參見圖10A)。Prieurianin對PLTP反式激活的開始與託泊替康的作用相似。prieurianin或託泊替康(0、2、5和10mg/kg)對PLTP基因表達的誘導伴隨血清PLTP蛋白水平的升高(參見圖10E)。實施例9.-prieurianin對PLTP的反式激活在小鼠中對體重降低和肥胖的藥理學抑制檢查在正常和ob/ob小鼠中，在肥胖方面星狀孢菌素對prieurianin的藥理學抑制。PKC激活物，12-0_十四醯佛波-13-乙酯(TPA)誘導PLTP啟動子(參見圖11)，並且該激活被PKC抑制劑星狀孢菌素消除。本發明人認為PKC信號傳導通路參與PLTP表達的轉錄調控。這些結果也表明prieurianirH秀導的PLTP啟動子活性^皮星狀孢菌素所抑制(參見圖3B)。另外，prieurianin對前脂肪細胞分化的抑制被星狀孢菌素部分地逆轉(參見圖9)，進一步指出PKC在PLTP的反式激活和prieurianin對分化的抑制中的潛在作用。因為prieurianin對PLTP的反式激活被星狀孢菌素所阻止，這些結果表明prieurianin誘導的體重損失和脂肪生成的抑制可通過共施用星狀孢菌素來取消或逆轉。實施例10.-在脂肪生成方面，星狀孢菌素對prieurianin誘導的PLTP表達的藥理學抑制脂肪生成轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體-Y(PPARy)以及CCAAT/增強子結合蛋白a和p(C/EBPa和P)在脂肪生成過程中發生的複雜的轉錄級聯中起到重要作用。PPARy和RB之間的相互作用通過招募組蛋白脫醯基酶HDAC3降低PPARy的轉錄活性。抑制HDAC活性隨後造成PPARY的強激活。已經顯示丙戊酸在小鼠和NIH-3T3/L1前脂肪細胞中抑制脂連蛋白基因表達，並且降低C/EBPa蛋白水平及其與脂連蛋白啟動子的結合。因為prieurianin是PLTP的轉錄激活物，本發明人認為所述藥物的一些藥理學作用被這些轉錄因子所影響。如圖12所示，HDAC抑制劑制滴菌素A(TSA)儘管是適度地，增強prieurianin對PLTP啟動子活性的反式激活，從而表明PPAR在prieurianin的轉錄調控中具有作用。這些初步的結果也顯示星狀孢菌素(一種PKC抑制劑)強烈地抑制prieurianin對PLTP的反式激活(參見圖3B),並且也逆轉prieurianin對前脂肪細胞增殖和分化的抑制(參見圖6和7)。儘管prieurianin和內皮縮血管肽1對前脂肪細胞分化的抑制有某些相似性，但星狀孢菌素對prieurianin和內皮縮血管肽1的藥理學作用是不同的，從而說明prieurianin和內皮縮血管肽1可能通過不同的通路抑制前脂肪細胞分化。實施例11.-prieurianin的抗肥胖症作用在3個另外的肥胖症小鼠;f莫型中測試prieurianin的作用，3個模式包括遺傳高胰島素血型瘦素受體缺陷db/db、Ceacam-/-糖不耐性/糖尿病、以及々大食誘導肥胖小鼠。將prieurianin腹腔內(i.p.)施用至12-14周齡的db/db小鼠，每日3或5mg/kg，30天。對飲食誘導肥胖Ceacam-Z-糖尿病小鼠飼餵高脂肪飲食4周，從而增肥，其後prieurianin處理(3或5mg/kg)3周。栽體處理組接受等量注射的Captisol(CyDexInc.，Lenexa，KS)。每3天測量體重和食物揭^取，在實驗結束時收集血液樣品。在prieurianin處理的db/db小鼠中沒有觀察到體重損失，但我們發現與未處理或載體處理對照，在3周內體重獲得顯著減少50%(參加圖15A)。在飲食誘導的肥胖06&0&111-/-糖尿病小鼠中，與對照相比prieurianin處理的動物中觀察到大約20-26%的體重損失(參見圖15B)，伴隨>50%減少的食物攝取(數據未顯示)。在3rag/kg處理組中，體重恢復到增肥前水平。由於嚴重的體重損失和未知毒性，在處理後14天對給予5mg/kg的小鼠實施安樂死。在這些小鼠的屍體檢查中觀察到，相對於對照的極少皮下或內臟脂肪(數據未顯示)。密集的高卡路裡飲食，伴隨久坐生活方式在全世界的流行造成了肥胖症發生率的急劇升高。為了進一步測試prieurianin在肥胖症中的功效，還研究了其在飲食誘導的肥胖(DIO)C57BL/6J(B6)小鼠模型中的作用。對B6小鼠飼餵60%kcal的高脂肪飲食大約15周，從而增加體重，然後用1或3mg/kg的prieurianin腹腔內每日處理3周。在處理期間，小鼠自由採食60%kcal的飲食。這些結果顯示在7天的處理期間劑量依賴方式誘導了多至10%總體重的體重損失(參見圖16A)，並伴隨70-80%的食物消耗下降，在3周治療的結束時最終幾乎恢復到正常水平(參見圖16B)。然而，在2周後，達到的體重損失後是體重的逐漸增加。這些結果暗示prieurianin處理的小鼠可能產生了對所述藥物的耐受性。為防止藥物誘導的耐受性這一問題，開發了新的方法，其中對DIO小鼠停止prieurianin處理，該小鼠繼續維持在高脂肪60。/。kcal飲食。4周後，用以下方法再次處理該小鼠3mg/kg的prieurianin處理5天，然後是5天的藥物休息期(無處理)，重複該處理3個循環或更多；或者5mg/kg的prieurianin處理3天，然後是5天的藥物休息期，重複該處理3個循環或更多。觀察到這種"開-關"處理策略(參見圖17)似乎克服了藥物誘導的耐受性，並且導致更明顯的反應，3或5mg/kg的prieurianin處理導致多至20%的體重下降，並且在接近研究結束時沒有觀察到體重的升高(圖16C)。食物消耗下降了大約40%，並且在循環處理方法的持續時間內保持不變(圖16B)。這些結果說明每日藥物處理產生的藥物有效性的損失可以通過這種新型的循環或開關處理方法來克服，該方法產生了更大的反應以及體重損失的維持，從而防止了藥物誘導的耐受性。本發明人認為食慾抑制性抗肥胖症藥物(包括曲美(Meridia))和其他抗肥胖症藥物可能在經過延長的處理時程後損失其有效性，並且因為對破壞能力代謝的藥物治療反應的補償性生理激素變化而遭遇耐受性。該新型循環或開關處理方法是一種提高抗肥胖症藥物的功效的方式，並且可用於一般代謝病症和其他人類病症的處理。實施例12.-prieurianin的作用才幾制prieurianin抑制前脂肪細胞的增殖和分化，也引起脂肪細胞的去分化或去脂作用。為查明prieurianin的分子機制，評價了prieurianin對脂肪生成的轉錄調控作用。如圖18所示，prieurianin誘導來自NFkB反應元件介導的轉錄的反式激活，但抑制C/EBPa和(3以及PPARy的反式激活潛力(參見圖18)。這些報告基因分析從而用於進一步篩選可能是prieurianin的化學類似物或其靶向調控脂肪生成的這些轉錄過程的相關小分子的家族。因此，用於促進誘導NFkB介導的轉錄通路或者引起抑制通過C/EBPa和p以及PPARy的轉錄(重要地調控脂肪生成)的小分子的高通量篩選是用於鑑定有效的新型抗肥胖症藥物的創新方法。實施例13.-蟾蜍靈和prieurianin對脂肪生成的作用強心類類固醇，蟾蜍靈如prieurianin刺激PLTP啟動子，但不抑制前脂肪細胞分化，而且既不引起脂肪細胞去分化或去脂作用(參見圖19)也不調節NFkB、C/EBPa和卩以及PPARy的轉錄活性(數據未顯示)。這些結果表明prieurianin在脂肪生成中作用的特異性，並進一步表明prieurianin及其衍生物的藥效團在脂肪生成中的特定作用。實施例14.-用途和/或適應症的非限制性實施例在另一方面，本文提供了用於在受試者中預防或治療肥胖症的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的prieurianin。在某些實施方式中，所述受試者需要這種治療或預防。在另一方面，本文提供了用於在受試者皮下脂肪組織內下調PLTP表達的方法，起包括對所述受試者施用治療有效量的prieurianin。在另一方面，本文提供了用於在哺乳動物中改善或預防脂肪生成的方法，起包括對所述哺乳動物施用治療有效量的prieurianin及其衍生物。當脂肪生成於疾病相關時，也可使用本文所公開的方法。另外，可通過任何合適的方式實現上述方法，其中包括但不局限於通過注射、口服或皮下注射入脂肪組織來施用。在某些實施方式中，預防脂肪生成實質上減少脂肪組織量。實施例15.-體內刺激NFKB信號傳導通路在另一方面，本文提供了用於對有此需要的受試者在體內刺激NFKB信號傳導通路的方法，其包括對所述受試者施用prieurianin以誘導減少體重和/或肥胖。在另一方面，本文提供了用於篩選檸檬苦素類化合物或者其他小分子實體或模擬物的NFkB反應元件報告系統。在另一方面，本文提供了篩選一種或多種小分子實體或模擬物的方法，其包括使用NFKB反應元件報告系統。在某些實施方式中，所述分子實體或模擬物包括一種或多種檸檬苦素類化合物。另外在某些實施方式中，就在誘導減少體重和/或肥胖中的功效篩選所述檸檬苦素類化合物。實施例16.-通過天然啟動子的體內反應元件在另一方面，本文提供了用於抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導的轉錄激活的方法，其包括通過天然啟動子在體內使用一種或多種反應元件。在另一方面，本文提供了篩選用於誘導減少體重和/或肥胖的小分子實體的方法，其包括通過天然啟動子在體內使用一種或多種反應元件來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導的轉錄激活。實施例U.-轉錄因子的反應元件在另一方面，本文提供了用於抑制一種或多種C/EBPa和卩以及PPARY介導的轉錄激活的方法，其包括使用含有所述轉錄因子的反應元件的反應元件驅動的才艮告系統。在另一方面，本文提供了篩選用於誘導減少體重和/或肥胖的小分子實體的方法，其包括通過使用含有所述轉錄因子的反應元件的反應元件驅動的報告系統來抑制一種或多種C/EBPa和p以及PPARy介導的轉錄激活。實施例18.-在分化的成熟脂肪細胞中去分化和/或抑制脂質積累在另一方面，本文提供了用於在分化的成熟脂肪細胞中引起去分化或抑制脂質積累的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的prieurianin。實施例19.-克服藥物誘導的耐受性在另一方面，本文提供了通過以"開-關，，或"循環，，方案施用所述藥物用於克服藥物誘導的耐受性的方法，所述方法包括以特定的劑量對所述受試者施用所述藥物以第一特定持續時間，停止施用所述藥物以第二特定持續時間，然後，恢復施用所述藥物以一個或多個特定持續時間，以及如果需要，重複所述方案。在某些實施方式中，所述方法用於治療肥胖症。另外在某些實施方式中，所述藥物包括prieurianin。實施例20.-藥物治療的最大反應在另一方面，本文提供了用於治療其中延長藥物治療導致功效降低、缺少反應、脫敏或耐受性的人類中的任何疾病的方法，以從所述藥物治療中獲得最大反應。在某些實施方式中，本文所述的方法特別用於預防脂肪生成實質上減少脂肪組織量。另外，在具體的實施方式中，本文公開的方法用於脂肪生成是與疾病相關的主題。在某些實施方式中，本文公開的方法用於藥物遞送施用是通過注射。在某些實施方式中，本文公開的方法用於藥物遞送施用是通過口服。在某些實施方式中，本文公開的方法用於藥物遞送施用是通過皮下注射入脂肪組織。在某些實施方式中，本文公開的方法用於藥物遞送施用是通過皮膚方式應用在脂肪組織周圍。實施例21.-配置含有prieurianin的組合物在另一方面，本文提供了用於配置含有prieurianin或其衍生物的組合物的方法，其包括將所述組合物溶解在乳浮或Captisol中。在某些實施方式中，所述組合物包含prieurianin或其衍生物。另外，在某些實施方式中，配置所述組合物以用於對有此需要的受試者施用，並且其中所述組合物包括所述組合物的預攝取形式。在具體實施方式中，配置所述組合物以用於對有此需要的受試者施用，並且其中所述組合物在體內形成藥學活性代謝物。儘管通過參考多種以及優選實施方式描述本發明，但本領域技術人員應當理解可產生多種變化，並且等同物可以替換其元件而不脫離本發明的實質範圍。另外，可產生多種修改以適應具體的介導或材料從而教授本發明而不脫離其實質範圍。因此，本發明旨在不受限於本文公開的、用於實施本發明的具體實施方式，而是本發明包括落入其權利要求書中的所有實施方式。參考文獻1.Mercer，J.G.(2001)Dietaryandgeneticinfluencesonsusceptibilityorresistancetoweightgainonahighfatdiet.NutrMetabCardiovascDis，11,114-7.2.Muoio，D.M.andNewgard,C.B.(2006)Obesity-relatedderangementsinmetabolicregulation.AnnuRevBiochem,75,367-401.3.Blackburn,G.L.andWaltm叫B.A.(2005)Pharmacotherapytoreducevisceralfat.ClinCornerstone,7,52-60.4.Riches,F.M.,Watts,G.F.，Naoumova，R.P.，Kelly,J.M.,Croft,K.D.andThompson,G.R.(1998)Hepaticsecretionofvery-low-densitylipoproteinapolipoproteinB-100studiedwithastableisotopetechniqueinmenwithvisceralobesity.IntJObesRelatMetabDisord,22,414-23.5.Campfield,L.A.，Smith,F丄，Guisez，Y.，Devos，R.andBurn,P.(1995)RecombinantmouseOBprotein:evidenceforaperipheralsignallinkingadiposityandcentralneuralnetworks.Science,269,546-9.6.Halaas,J丄.，Gajiwala，K.S.,Maffei，M.,Cohen,S.L.,Chait,B.T.，Rabinowitz,D"Lallone，R丄"Burley,S,K.andFriedman,J.M.(1995)Weight-reducingeffectsoftheplasmaproteinencodedbytheobesegene.Science,269，543-6.7.PeJJeymounter,M.A.,Cullen,M丄，Baker,MB.，Hecht,R.,Winters,D.,Boone，T-andCollins,F.(1995)Effectsoftheobesegeneproductonbodyweightregulationinob/obmice.Science,269，540-3.8.Zhang,Y"Proenca,R"Maffei,M"Barone，M.，Leopold,L，andFriedman,J.M.(1994)Positionalcloningofthemouseobesegeneanditshumanhomologue.Nature,372，425-32.9.Kobayashi,K.(2005)Adipokines:therapeutictargetsformetabolicsyndrome.CurrDrugTargets,6,525-9.10.Rondinone,C.M,(2006)Adipocyte-derivedhormones,cytokines,andmediators.Endocrine,29，81-90.,11.Trayhurn,P.，Bing,C.andWood,I,S.(2006)Adiposetissueandadipokines—energyregulationfromthehumanperspective.JNutr,136，1935S-1939S.12.Nedvidkova,J.,Smitka,K-，Kopsky,V.andHainer，V.(2005)Adiponectin,anadipocyte-derived'protein.PhysiolRes,54，133-40.13.Havel,P丄(2000)Roleofadiposetissueinbody-weightregulation:mechanismsregulatingleptinproductionandenergybalance.ProcNutrSoc,59,359-71.14.Cancello，R.,Tounian,A.,Poitou，C.andClement,K.(2004)Adipositysignals,geneticandbodyweightregulationinhumans.DiabetesM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