對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株及其用途的製作方法

2023-05-12 22:48:56

專利名稱：對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株及其用途。
背景技術：
果樹細菌性根癌病菌(Agrobacterium tumefaciens)引起根癌病分布於世界各地。DeCleene和DeLey曾報導根癌農桿菌可侵染93個科331屬643中的雙子葉植物及少數裸子植物。1980年Kennedy報導美國由原核植物病原菌所造成的作物損失中，果樹和葡萄的根癌病排列為最重要。我國的葡萄根癌病在北方地區13個省均有不同程度發生，櫻桃根癌病在山東、大連、河北等地發生嚴重，桃樹根癌病在江蘇、浙江、福建及上海郊區普遍發生，嚴重的果園植株發病率為90％以上。
根癌病對果樹的危害極大是一種世界性病害，直接影響了果樹產品的生產，從而影響了農業經濟的發展。因此，對此病的防治引起了世界各國的關注，鑑於化學農藥對環境的汙染和生態平衡的破壞，植物根癌病的生物防治得到了重視，國際上主要應用細菌在其代謝過程中產生的細菌素來對根癌農桿菌的生長起到預防和抑制的作用，但其菌株主要是選取不致病的髮根土壤桿菌K84菌株，K84菌株在根癌病的防治中的作用是防非治，是作為一種預防措施使用，並且不能防治所有根癌病，只對含胭脂鹼Ti質粒的根癌農桿菌才有效果。雖然分離出的另外一些無致病性的土壤桿菌，如根癌土壤桿菌J73、根癌土壤桿菌D286等能彌補K84菌株之不足，但生防細菌不耐旱，壽命短，必須貯藏和隨制隨用。

發明內容
本發明的目的在於克服上述缺點而提供的一種對根癌農桿菌T-37有抑制作用的拮抗真菌黑麴黴菌株。
本發明的另一目的在於提供該對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株在抑制根癌農桿菌方面的用途。
對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)，其形態特徵xi菌株在查氏(Czapck)培養基上，26℃，培養10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個菌落都布滿了分生孢子結構，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲髮達，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
該菌種已於2006年3月7日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址中國武漢武漢大學)，保藏號CCTCC NOM 206021，名稱為黑麴黴xj(Aspergillus niger xj)對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xi)的分離步驟(1)拮抗菌的分離與純化準確稱取10.0g果樹根系土樣，藉助無菌操作技術，將土樣加入盛90ml無菌水並帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，使土樣均勻地分散為稀釋液，再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中，充分混勻，成為土壤懸液。採用混菌法接種，吸取1ml懸液於直徑為9cm的滅菌培養皿中，然後傾注已熔化並冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養基，充分混勻，待凝固後倒置，25℃保溫培養5天，挑取真培養基中長出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落，移入馬丁氏平板上，恆溫培養，直至純化得到單菌落，轉移至斜面試管保存；(2)拮抗菌瓊脂柱的製備在無菌培養皿中倒入PDA固體培養基(厚1cm)，用打孔器對已冷卻的PDA培養基進行打孔，將瓊脂柱放置於無菌空培養皿中，用接種環分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上，26℃靜置培養3天；(3)拮抗菌的篩選T-37平板製備取長滿根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一隻，加入滅過菌的蒸餾水10ml，用槍輕輕吹打並充分混勻，製成細菌菌懸液，取0.1ml接種於平板培養基表面，用L棒均勻塗布；拮抗菌篩選將已製備好的拮抗菌瓊脂柱分別置於T-37平板上，於4℃冰箱倒扣放置12h後，30℃繼續培養48h，室溫下觀察結果，在瓊脂柱周圍有一株真菌產生較明顯的抑菌圈，這一株真菌即為本發明的黑麴黴菌株xj(Aspergillus niger xj)。
通過對抑菌試驗來說明本發明的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)的抑制根癌農桿菌的用途(1)發酵液與菌體提取液的製備將上述的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)按10％的接種量接入PDA液體發酵培養基中(200ml培養瓶裝入40ml培養基)，26℃，140rpm，搖瓶培養9天，將發酵液與菌絲體一同轉入離心管中，2000轉/分，離心10min，進行菌液分離，再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍)，2000轉/分再離心10min，反覆4次，分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液，將上清液置於減壓真空乾燥箱中50℃濃縮10倍，濃縮後的上清液於紫外燈下照射30分鐘，置於4℃冰箱備用。
菌絲體於減壓真空乾燥箱中55℃烘至恆重，再將菌絲研磨成粉，過80目篩，加入20倍無菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，過濾，濃縮，紫外照射，4℃冰箱保存備用。
(2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm)，分別吸取發酵上清液與菌體提取液，在酒精燈前略微乾燥，輕輕放在T-37平板上，倒置於4℃冰箱12h後，30℃繼續培養48h，室溫下可分別產生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
本發明的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)來源可靠，對溫度、pH等自然環境條件的適應範圍廣，對不良環境的耐受力強，能維持生態平衡，能適應病害生態系，而且耐突變，容易培養和保存，抑制根癌農桿菌效果好，在農業方面有很大的應用前景。該技術路線合理，可為大規模工業化生產提供可靠的中試數據和設計依據，實現液體發酵工業化生產黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)，為開發相關生物製劑奠定基礎。
具體實施例方式
對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)的分離步驟(1)供試菌株根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)購於中國農業科學院土壤肥料研究所，保存於貴州大學真菌資源研究所；(2)拮抗菌的分離與純化準確稱取10.0g果樹根系土樣，藉助無菌操作技術，將土樣加入盛90ml無菌水並帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，使土樣均勻地分散為稀釋液，再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中，充分混勻，成為土壤懸液。採用混菌法接種，吸取1ml懸液於直徑為9cm的滅菌培養皿中，然後傾注已熔化並冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養基，充分混勻，待凝固後倒置，25℃保溫培養5天，挑取真培養基中長出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落，移入馬丁氏平板上，恆溫培養，直至純化得到單菌落，轉移至斜面試管保存；(3)拮抗菌瓊脂柱的製備在無菌培養皿中倒入PDA固體培養基(厚1cm)，用打孔器對已冷卻的PDA培養基進行打孔，將瓊脂柱放置於無菌空培養皿中，用接種環分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上，26℃靜置培養3天；(4)拮抗菌的篩選T-37平板製備取長滿根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一隻，加入滅過菌的蒸餾水10ml，用槍輕輕吹打並充分混勻，製成細菌菌懸液，取0.1ml接種於平板培養基表面，用L棒均勻塗布；拮抗菌篩選將已製備好的拮抗菌瓊脂柱分別置於T-37平板上，於4℃冰箱倒扣放置12h後，30℃繼續培養48h，室溫下觀察結果，在瓊脂柱周圍有一株真菌產生較明顯的抑菌圈，命名為xj。
拮抗菌的鑑定xi菌株在查氏(Czapck)培養基上，26℃，培養10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個菌落都布滿了分生孢子結構，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲髮達，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
根據Raper(1965)關於麴黴屬的分類標準，xi菌株的主要形態特徵與他所描述的黑麴黴(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的標準形態基本相同，因而認為xj菌株屬於麴黴屬黑麴黴群的一株黑麴黴，記為黑麴黴xj(Aspergillus niger xj)。
通過對抑菌試驗來說明本發明的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xi)的抑制根癌農桿菌的用途(1)發酵液與菌體提取液的製備將上述的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xi)按10％的接種量接入PDA液體發酵培養基中(200ml培養瓶裝入40ml培養基)，26℃，140rpm，搖瓶培養9天，將發酵液與菌絲體一同轉入離心管中，2000轉/分，離心10min，進行菌液分離，再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍)，2000轉/分再離心10min，反覆4次，分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液，將上清液置於減壓真空乾燥箱中50℃濃縮10倍，濃縮後的上清液於紫外燈下照射30分鐘，置於4℃冰箱備用。
菌絲體於減壓真空乾燥箱中55℃烘至恆重，再將菌絲研磨成粉，過80目篩，加入20倍無菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，過濾，濃縮，紫外照射，4℃冰箱保存備用。
(2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm)，分別吸取發酵上清液與菌體提取液，在酒精燈前略微乾燥，輕輕放在T-37平板上，倒置於4℃冰箱12h後，30℃繼續培養48h，室溫下可分別產生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
權利要求
1.一種對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)，保藏號CCTCC NOM 206021，其形態特徵xj菌株在查氏培養基上，26℃，培養10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個菌落都布滿了分生孢子結構，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲髮達，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子；分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
2.如權利要求1所述的對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)，保藏號為CCTCC NOM 206021在抑制根癌農桿菌方面的用途。
全文摘要
本發明公開了一種對根癌農桿菌有抑制作用的黑麴黴菌株(Aspergillus niger xj)，其形態特徵xj菌株在查氏培養基上，26℃，培養10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個菌落都布滿了分生孢子結構，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲髮達，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細胞長出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子；分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72－220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長600－2100μm，寬12－13μm；頂囊近球形，直徑40.8－42μm；次生小梗4.2－6μm×1.8－3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4－3μm。本發明對自然環境條件的適應範圍廣，對不良環境的耐受力強，容易培養和保存及工業化生產，抑制根癌農桿菌效果好。
文檔編號A01N63/04GK1847388SQ20061005102
公開日2006年10月18日 申請日期2006年4月21日 優先權日2006年4月21日
發明者李祝, 梁宗琦, 肖洋, 周禮紅, 李穎 申請人:貴州大學