一種灰兜巴粗多肽的製備方法及其應用的製作方法
2023-05-13 07:41:21 2
一種灰兜巴粗多肽的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種灰兜巴粗多肽的製備方法，包括灰兜巴粗蛋白的提取、酶解和純化等步驟。本發明利用酶來水解灰兜巴粗蛋白，不僅不避免化學試劑所帶來的毒副作用，而且可以提高灰兜巴多肽的得率。本發明同時提出了製備的灰兜巴多肽在製備用於降糖的藥物上的應用。通過優選合適的蛋白酶和酶解條件，本發明成本低、工藝簡單、周期短、可控性強、產率高，可實現大規模產業化生產。
【專利說明】一種灰兜巴粗多肽的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及一種灰兜巴粗多肽的製備及其應用。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是由於人的機體內胰島素絕對或相對分泌不足而引起的人體代謝紊亂一 類終身慢性全身性的代謝性疾病。現在糖尿病嚴重影響人類的身體健康，全世界每年的糖 尿病患者在不斷地增加並且患病的人群的年齡也在不斷的下降，呈現低齡化趨勢。市場上 有很多治療糖尿病的藥物比如雙胍類藥物、糖苷酶類藥物等，但是人體長期服用這些藥物 會有一定的毒副作用。最近幾年獲得高效、安全的降糖產品成為各國專家研究的熱點。其 中降血糖多肽是天然降糖藥物之一，是生物活性多肽的一種。
[0003] 藏藥灰兜巴是一種洞穴紅蜘蛛用自己的絲作為原材料而建成的巢穴，這種紅蜘蛛 生活在海拔1000米以上的老茶樹林裡，它建成的巢穴外形像一個灰色的布袋，穴處依附於 老茶樹的枝幹上，而底端則埋藏於洞穴中，並且整個巢穴混雜泥土和枯枝敗葉，因此表面有 較多紅色或黃色的泥土和枯枝敗葉。這種藥有消除、緩解糖尿病症狀、益氣健脾的功效；能 夠糾正代謝絮亂，防止糖尿病併發症，主要用於治療II型糖尿病，因此被大家認為是民間 治療糖尿病的最佳偏方。灰兜巴的主要物質是蜘蛛絲，而蜘蛛絲含有大量的絲蛋白。有人 對灰兜巴各種活性成分對II型糖尿病的治療作用進行了分析，得到灰兜巴治療II型糖尿 病的主要成分是蛋白質成分，但是對具體的起到治療II型糖尿病作用的物質沒有進行分 析和研究。目前常用的製備多肽的方法是化學法，此方法存在著反應時間長，水解過程不易 控制，且會有化學試劑的殘留，對人體會產生不良影響，同時可能破壞多肽的生物活性。
【發明內容】
[0004] 發明目的：為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種灰兜巴粗多肽的製備 及其應用，通過利用蛋白酶水解灰兜巴蛋白得到的灰兜巴多肽具有較好的降糖作用。
[0005] 技術方案：為實現上述技術目的，本發明提供一種灰兜巴粗多肽的製備方法，包括 如下步驟：
[0006] (1)灰兜巴粗蛋白的提取：將粉碎灰兜巴原料加入到磷酸緩衝液中浸泡，在超聲 波條件下提取，離心，取上清液並冷凍乾燥，得到灰兜巴粗蛋白粉；
[0007] (2)酶解：將步驟（1)得到的灰兜巴粗蛋白粉配製成水溶液，向其加入蛋白酶進行 酶解反應，得到灰兜巴粗蛋白的酶解液；
[0008] (3)純化：步驟（2)得到的酶解液經沸水浴滅酶、離心、微濾，得到的濾液用不同分 子量的超濾離心管進行離心處理，將得到的不同分子量的多肽液進行濃縮和冷凍乾燥，得 到灰兜巴粗多肽。
[0009] 具體地，步驟（1)中，在超聲功率700?900W、超聲時間45-60min、溫度50-60°C、 pH 6-8和液料比（45?60) :lmL/g的條件下提取灰兜巴蛋白，待反應結束後在3000? 5000r/min離心10?20min，上清液濃縮冷凍乾燥，冷凍乾燥的溫度為-50°C。
[0010] 步驟⑵中，所述的蛋白酶為鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復 合蛋白酶和風味蛋白酶中的任意一種。
[0011] 步驟⑵中，所述的蛋白酶的用量為4000?6000U/g，灰兜巴粗蛋白濃度為5? 7wt %，酶解的溫度為30?50°C，酶解的時間為2?4h，酶解的pH為6?8。
[0012] 步驟（3)中，沸水浴滅酶的條件為：將酶解液置於沸水浴中保持15?20min,然後 勻速冷卻至室溫，以8000?10000r/min的轉速離心15?20min，取上清。
[0013] 步驟（3)中，微濾的條件為過0? 22?0? 65iim的濾膜。
[0014] 步驟（3)中，將微濾液加至15mL裝的超濾膜30KD離心管中，置於離心機內 5000-7000rpm離心20-40min，打開超濾管蓋子，用移液槍將超濾膜濾過液與未濾過液各自 吸出，透過超濾膜的濾液再經超濾膜為10KD和3KD的離心管分離，得到各組分子量不同的 多肽液，並測定各組份對a-葡萄糖苷酶的抑制率。
[0015] 步驟（3)中，冷凍乾燥的溫度為-50°C。
[0016] 本發明進一步提出了利用上述製備方法製備出的灰兜巴粗多肽在製備用於降糖 的藥物上的應用。
[0017] 有益效果：與現有技術相比，本發明利用酶來水解灰兜巴粗蛋白，不僅不避免化學 試劑所帶來的毒副作用，而且可以提高灰兜巴多肽的得率。通過優選合適的蛋白酶和酶解 條件，本發明成本低、工藝簡單、周期短、可控性強、產率高，可實現大規模產業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1超濾膜分離各分子量的多肽含量及抑制率。
【具體實施方式】
[0019] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0020] 實施例1灰兜巴粗蛋白的提取。
[0021] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7. 5、超聲功率800W、時間50min、液料比 50 : l(mL/g)和溫度60°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應結束後在3500r/min離心 20min，重複實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為48. 15%。
[0022] 實施例2灰兜巴粗蛋白的提取。
[0023] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7、超聲功率700W、時間45min、液料比 55 : l(mL/g)和溫度50°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應結束後在4000r/min離心 15min，重複實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為49. 61 %。
[0024] 實施例3灰兜巴粗蛋白的提取。
[0025] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 8、超聲功率900W、時間55min、液料比 60 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應結束後在5000r/min離心 lOmin，重複實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為49. 75%。
[0026] 實施例4灰兜巴粗蛋白的提取。
[0027] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 6. 5、超聲功率750W、時間55min、液料比 45 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應結束後在4000r/min離心 15min，重複實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為51. 69%。
[0028] 實施例5灰兜巴粗蛋白的提取。
[0029] 精確稱取lg已粉碎的去土灰兜巴，在pH 7、超聲功率850W、時間60min、液料比 50 : l(mL/g)和溫度55°C的條件下提取灰兜巴粗蛋白，待反應結束後在4500r/min離心 15min，重複實驗3次，得到灰兜巴粗蛋白的平均含量為52. 42%。
[0030] 實施例6灰兜巴粗蛋白的提取。
[0031] 用響應面法對上述的灰兜巴蛋白提取條件進行優化處理，在功率800W、時間 531^11、溫度581：4117.5和液料比54:111117^的條件下，灰兜巴蛋白的提取率為52.66%。
[0032] 其中灰兜巴蛋白的提取率計算公式如下：
【權利要求】
1. 一種灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟： (1) 灰兜巴粗蛋白的提取：將粉碎後的灰兜巴原料加入到磷酸緩衝液中浸泡，在超聲 波條件下提取，離心，取上清液並冷凍乾燥，得到灰兜巴粗蛋白粉； (2) 酶解：將步驟（1)得到的灰兜巴粗蛋白粉配製成水溶液，向其加入蛋白酶進行酶解 反應，得到灰兜巴粗蛋白的酶解液； (3) 純化：步驟⑵得到的酶解液經沸水浴滅酶、離心、微濾，得到的濾液分別用不同分 子量的超濾離心管進行離心處理，將得到的不同分子量的多肽液進行濃縮和冷凍乾燥，得 到不同分子量的灰兜巴粗多肽。
2. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑴中，超聲波 提取的條件為：在超聲功率700-900W、超聲時間45?60min、溫度50-60°C、pH 6-8和液料 比（45?60) :lmL/g的條件下提取灰兜巴蛋白，待反應結束後在3000-5000r/min離心10? 20min，上清液濃縮冷凍乾燥，冷凍乾燥的溫度為-50°C。
3. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑵中，所述的 蛋白酶是為鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、複合蛋白酶和風味蛋白酶中 的任意一種。
4. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑵中，所述 的蛋白酶的用量為4000?6000U/g，灰兜巴粗蛋白濃度為5?7wt%，酶解的溫度為30? 50°C，酶解的時間為2?4h，酶解的pH為6?8。
5. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑶中，沸水浴 滅酶的條件為：將酶解液置於沸水浴中保持15?20min，然後勻速冷卻至室溫，以8000? 10000r/min的轉速離心15?20min，取上清。
6. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑶中，微濾的 條件為過0. 22-0. 65 ii m的濾膜。
7. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟（3)中，將微濾 液加至15mL裝的超濾膜30KD離心管中，置於離心機內5000-7000rpm離心20-40min，打開 超濾管蓋子，用移液槍將超濾膜濾過液與未濾過液各自吸出，透過超濾膜的濾液再經超濾 膜為101?和3KD的尚心管分尚，分別分子量不同的多肽液。
8. 根據權利要求1所述的灰兜巴粗多肽的製備方法，其特徵在於，步驟⑶中，冷凍幹 燥的溫度為-50°C。
9. 根據權利要求1所述的製備方法製備出的灰兜巴粗多肽在製備用於降糖的藥物上 的應用。
【文檔編號】C12P21/06GK104450847SQ201410782005
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月16日 優先權日:2014年12月16日
【發明者】許偉, 李錦 , 邵榮, 顏秀花, 陳立根 申請人:鹽城工學院