一種鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒的製作方法

2023-05-07 06:08:57 3

本發明提供了一種鼻咽癌循環腫瘤細胞的檢測試劑盒，屬於鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測領域。

背景技術：

循環腫瘤細胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)指進入到血液中的腫瘤細胞。這部分腫瘤細胞參與到血液循環當中，並且隨著血液循環的方向可以遷移至相關組織或器官，在合適的條件下發展成腫瘤病灶。CTCs主要來源分為兩方面：一為脫落，即由原發灶或轉移灶脫落下來穿透血管壁進入到血液中。二為較早的階段進入，即在尚未增殖形成影像學可見的腫瘤病灶組織時，以癌變細胞的形式提前進入到血液中，因此從理論上講，CTCs的出現要早於影像學對腫瘤實體的發現。

鼻咽癌常見的檢查方法有：磁共振成像檢查，CT檢查，鼻咽鏡檢查，X射線檢查，血清學診斷等。常見基於血清學診斷主要是依據鼻咽癌患者血清中EB病毒抗體水平與其它惡性腫瘤患者和健康人之間存在明顯差異。

鼻咽部解剖位置隱蔽，鼻咽癌早期症狀不典型，臨床上容易延誤診斷，應特別提高警惕。而鼻咽癌的治療方法主要是以放化療為主，檢測及監測鼻咽癌患者循環腫瘤細胞的數量可提示早期診斷，並進行放化療療效的評估。

採用人外周全血進行檢測，早中晚期鼻咽癌患者血液中，只要存在進入血液循環的鼻咽癌腫瘤細胞，均可被檢測到。由於CTC在外周血的數量極少，通常需在約1億個白細胞和500億個紅細胞中尋找僅有的數個腫瘤細胞，因此為了提高CTC的檢出率，通常須在檢測前進行CTC富集。目前CTC的富集方法按其原理主要分為基於抗原抗體反應原理的富集法和基於細胞形態的富集方法。並且CTC的檢測方法眾多，根據檢測原理可分為兩大類：細胞計數法和核酸檢測法，前者主要包括各種免疫細胞化學技術、流式細胞術、免疫螢光技術等；後者主要包括聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈反應及其各種改進的技術等。目前的檢測方法中普遍存在有以下缺陷：由於外周血中的白細胞去除率不高，白細胞作為有核細胞會對腫瘤細胞的富集造成幹擾。此外，血源性異常細胞也會對非血源性異常細胞(循環腫瘤細胞)的篩選造成幹擾。此外，目前大多採用正分選的方法捕獲循環腫瘤細胞，利用磁珠表面偶聯有特異性抗體(如Epcam、CK19等)捕獲腫瘤細胞，該方法得到的細胞表面帶有磁珠，導致細胞活性降低。並且由於標誌物的關係，導致腫瘤細胞富集回收率較低。

技術實現要素：

本發明解決了現有技術中的不足，提供了一種鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒，該試劑盒結合免疫磁富集分離技術、螢光原位雜交技術、免疫螢光細胞化學技術、鼻咽癌循環腫瘤細胞計數技術，能精確測定樣本中鼻咽癌循環腫瘤細胞個數。

實現本發明上述目的所採用的技術方案為：

一種鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒，由人外周血白細胞去除部分和免疫螢光原位雜交鑑定部分組成，其中人外周血白細胞去除部分包括稀釋緩衝液、紅細胞裂解液、密度梯度離心介質、細胞固定液A以及免疫磁珠，其中紅細胞裂解液由氯化銨、碳酸氫鈉以及EDTA二鈉溶液混合而成，所述免疫磁珠是共價偶聯了抗人白細胞共同抗原的抗體的磁珠，該抗體為CD45，所用免疫磁珠粒徑為0.2～1.5μm；細胞固定液A功效成分為醇類；

所述的免疫螢光原位雜交鑑定部分包括緩衝液，雜交固定液B，生物素標記的CEP8探針，紅色量子點標記的CD45抗體，綠色量子點標記的鏈黴親和素，封片劑以及牛血清白蛋白粉末；所述雜交固定液B功效成分為多聚甲醛，所述CEP8探針能夠通過螢光原位雜交的方法對腫瘤細胞進行探針標記，所述紅色量子點標記的CD45抗體對剩餘白細胞進行染色且其發射波長為585nm～625nm，綠色量子點標記的鏈黴親和素能夠與CEP8探針相結合從而對DNA片段進行標記，且其發射波長為525nm～545nm，所述封片劑含有能夠與DNA強力結合的螢光染料DAPI。

所述的紅細胞裂解液的pH值為7.0～8.0，其中氯化銨的濃度為0.5～2M，碳酸氫鈉濃度為10～200mM，EDTA二鈉的濃度為1～10mM。

所述的生物素標記的CEP8探針購自於美國雅培分子公司。

紅色量子點標記的CD45抗體的發射波長為605nm，綠色量子點標記的鏈黴親和素的發射波長為525nm，兩者均採用共價偶聯的方式將量子點與蛋白進行連接。

所述的密度梯度離心介質的密度為1.02～1.5g/cm3，其有效成分為蔗糖，且蔗糖的質量濃度為5％～60％。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：本發明採用負分選陰性富集的方法得到的腫瘤細胞活性高，腫瘤細胞富集回收率大於80％。試劑盒採用的螢光量子點作為非血源性基因異常型細胞的判定標記物，主要特點是螢光亮度高，性能穩定，不易漂白，易於觀察。

本發明採用陰性富集的方法，所得到的腫瘤細胞表面完整，活性高，更加方便進行後續培養及分子標誌物檢測。

本發明採用去血漿、紅細胞裂解技術、密度梯度離心技術，大大提高了循環腫瘤細胞的富集率，白細胞去除率大於99.99％。

本發明採用螢光原位雜交及免疫螢光細胞化學技術對所富集到的循環腫瘤細胞進行鑑定，8號染色體探針對腫瘤細胞DNA序列進行標記，結果會顯示三倍體、四倍體、多倍體信號。採用螢光原位雜交的方法不受限於上皮標誌物的表達，提高檢出的敏感性和特異性。紅色量子點標記的CD45抗體對白細胞表面進行染色，與腫瘤細胞進行區分。所計數得到的腫瘤細準確無誤。

本發明CTC富集技術採用基於免疫磁性原理的陰性富集法，通過使用特異性單克隆抗體(CD45)包被的免疫磁微粒可去除血液內99.99％以上的白細胞，最大程度地降低背景有核細胞的幹擾，從而達到富集腫瘤細胞的目的。因不依賴於腫瘤細胞表面抗原的表達，本發明CTC富集方法在各上皮來源實體瘤中具備一定的通用性，能達到較高的腫瘤細胞回收率。為排除血源性異常細胞的幹擾，本發明獨創技術：通過選用特異性探針將FISH與免疫細胞化學技術相結合，採用螢光量子點作為標記物，快速篩選出非血源性基因異常型細胞(腫瘤細胞)。

附圖說明

圖1為本發明提供的鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒的檢測流程圖；

圖2為本發明實施例中的臨床標本檢測數據分析圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護範圍並不局限於以下實施例。

本發明所提供的鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒由人外周血白細胞去除部分和免疫螢光原位雜交鑑定部分組成，其中人外周血白細胞去除部分包括稀釋緩衝液、紅細胞裂解液、密度梯度離心介質、細胞固定液A以及免疫磁珠，其中紅細胞裂解液由氯化銨、碳酸氫鈉以及EDTA二鈉溶液混合而成，所述免疫磁珠是共價偶聯了抗人白細胞共同抗原的抗體的磁珠，該抗體為CD45，所用免疫磁珠粒徑為0.2～1.5μm。所述的紅細胞裂解液的pH值為7.0～8.0，其中氯化銨的濃度為0.5～2M，碳酸氫鈉濃度為10～200mM，EDTA二鈉的濃度為1～10mM。所述的密度梯度離心介質的密度為1.02～1.5g/cm3，其有效成分為蔗糖，且蔗糖的質量濃度為5％～60％。所述細胞固定液A主要成分為醇類。

所述的免疫螢光原位雜交鑑定部分包括緩衝液，雜交固定液B，生物素標記的CEP8探針，紅色量子點標記的CD45抗體，綠色量子點標記的鏈黴親和素，封片劑以及以及牛血清白蛋白粉末，所述CEP8探針能夠通過螢光原位雜交的方法對腫瘤細胞進行探針標記，所述的生物素標記的CEP8探針購自於美國雅培分子公司。所述雜交固定液B是對老化脫水前的細胞進行固定，主要成分為多聚甲醛。所述紅色量子點標記的CD45抗體對剩餘白細胞進行染色且其發射波長為585nm～625nm，本實施例中紅色量子點標記的CD45抗體的發射波長為605nm，綠色量子點標記的鏈黴親和素能夠與CEP8探針相結合從而對DNA片段進行標記，且其發射波長為525nm～545nm，本實施例中綠色量子點標記的鏈黴親和素的發射波長為525nm。紅色量子點標記的CD45抗體與綠色量子點標記的鏈黴親和素均採用共價偶聯的方式將量子點與蛋白進行連接。所述封片劑含有能夠與DNA強力結合的螢光染料DAPI。

本發明所提供的鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒在使用時的檢測流程圖如圖1所示，具體的步驟如下：

1、血漿及紅細胞去除：血液樣本中加入緩衝液450g～1000g後離心5～10min去除血漿，然後加入450g～1000g紅細胞裂解液於搖床中旋轉8-12min，離心5～10min後得到白細胞和腫瘤細胞。

2、白細胞去除：將得到的白細胞及腫瘤細胞混合物中加入免疫磁微粒於水平搖床中反應，免疫磁微粒表面偶聯有抗人白細胞共同抗原的抗體，該磁微粒特異性與白細胞結合，可與標本中99.99％的白細胞結合，從而達到去除白細胞的目的。

3、密度梯度離心技術：將捕獲了白細胞的磁微粒與腫瘤細胞混合物輕輕疊加至離心介質中，通過密度梯度離心技術，結果可分為4層，底層為免疫磁微粒與白細胞複合物，依次往上為離心介質層、腫瘤細胞層、緩衝液層。根據目的吸取腫瘤細胞層，可能會殘留免疫磁微粒，通過靠磁力架的方式除去剩餘免疫磁微粒，得到的細胞離心後於管底部，取出底部細胞進行塗片。

4、細胞固定技術：塗片後細胞加入細胞固定液A，於25℃～30℃乾燥12～36小時。

5、原位雜交技術：待塗片後的細胞完全乾燥後，將細胞區域採用雜交固定液B進行固定，然後老化、脫水處理，進行原位雜交。所採用探針為生物素標記的CEP8，雜交儀設定變性溫度為76℃，時間為5min；雜交溫度為37℃，時間為1.5～3h。雜交完畢，取出玻片進行洗滌。

6、免疫螢光細胞化學技術：將已完成原位雜交的玻片洗滌後，配製紅色量子點標記的CD45與綠色量子點標記的鏈黴親和素作為免疫螢光染色液，將染色液加入至細胞標本區於37℃溫箱孵育1～3h，孵育完成後進行洗滌，加入DAPI封片劑進行封片。

7、腫瘤細胞計數技術：將已完成原位雜交及免疫螢光檢測的玻片置於螢光顯微鏡下，紫外激發觀察藍色DAPI信號，可確定細胞核形態；觀察綠色CEP8探針信號，可確定細胞核內雜交信號點個數；觀察紅色CD45信號，確定白細胞細胞膜染色情況；最終確定細胞核為單核，探針信號點三個及以上，無CD45染色信號的細胞為異常細胞(腫瘤細胞)並計數，整張玻片掃描完畢，統計腫瘤細胞個數，即為該樣本所含腫瘤細胞個數。

本實施例尋找了103為臨床標本進行檢測分析，103例標本中有27例健康志願者(Healthy Controls)、34例鼻咽部良性病變患者(Non-maniglant Disease)和42例鼻咽癌患者，以上臨床標本的循環腫瘤細胞檢測數據分布如圖2所示，由圖2可知，本發明所提供的鼻咽癌循環腫瘤細胞檢測試劑盒的檢測結果與實際狀況相符。