含地龍蛋白口含速溶製劑及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-07 16:10:21

專利名稱：含地龍蛋白口含速溶製劑及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物蛋白類藥物口含速溶製劑及製備方法，具體涉及地龍蛋白的口含 速溶製劑及製備方法。另外，本發明還涉及還製劑的應用。
背景技術：
蚯蚓藥名稱為地龍，藥用首載《詩經》，《神農本草經》列為下品。中藥地龍具有清熱 定驚、通絡、平喘、利尿之功效，是一種常用動物藥材。中國藥典2005年版收載的地龍為鉅 蟲引禾鬥雲力物參環毛蟲引Pheretima aspergillum(E. Perrier)、通俗環毛蟲引Pheretimavulagris Chen、威廉環毛蟲引 Pheretima guillelm(Michaelsen)或|節盲環毛蟲引 Pheretimapectinifera Michaelsen的乾燥體。除藥典收載品種外湖北環毛蚓P. hupeiensis、直隸環毛蚓 P. tschiliensis、異毛環毛蚓P. diffringens、白頸環毛蚓P. californica、背暗異唇蟲引 Allolobophora caliginosa trapezoides、赤子愛勝蟲引 Eisenia foetida 等品禾中也具有潛 在的藥用價值。根據臨床報導，地龍提取液經口含能通過抗組胺等途徑作用於肺或支氣管組織， 使痙攣、阻塞的支氣管舒張、粘液分泌減少，炎性損傷修復，從而改善哮喘患者的通氣功能， 尤其是呼氣性通氣功能，對急性哮喘患者肺功能有顯著改善作用和即刻平喘作用(傅潔等 地龍液即刻平喘的臨床和實驗研究.上海中醫藥雜誌，1991，(4) J4-26 ；王左等地龍液治 療支氣管哮喘急性發作臨床觀察.中國中醫急症，1996,5(1) :3-4)。課題組採用致敏豚鼠 抗原攻擊引起的哮喘模型，以表徵肺功能的肺順應性(Cdyn)和肺阻力(RL)為評價指標，從 新鮮地龍中篩選出了一組活性組分，經雙向凝膠電泳-生物質譜的初步分析，初步鑑定出 19個蛋白(豐度值佔總量81. 63%)(王茵蚯蚓平喘活性蛋白質的研究，上海中醫藥大學05 屆博士論文)。口服劑型是人們比較容易接受，也是使用比較方便的劑型。長期以來，一直認為蛋 白多肽類藥物在消化道中難吸收且易被破壞，難以製成口服劑型。地龍提取液在臨床應用 時以口含15分鐘咽下的給藥形式，已證明有良好的即刻平喘作用，因此，研究開發口含速 溶地龍蛋白製劑具有臨床應用基礎。目前口服蛋白類藥物製劑的製備方法多以冷凍乾燥為主，存在諸多問題如何保 證穩定，如何消除不良口感所導致患者依從性降低，從而製備一種不影響其活性且易被患 者接受的口服蛋白類製劑。目前尚無任何資料報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是提供一種無異味且穩定性良好的口含速溶地 龍蛋白藥物製劑。本發明所要解決的另一技術問題是提出該藥物製劑的製備方法，並提出其應用。為了解決上述技術問題，本發明提供的口含速溶地龍蛋白藥物製劑是經冷凍乾燥 工藝製得，由重量百分比為75%的地龍蛋白提取物和重量百分比為25%的複合矯味劑組成，其中地龍提取物中蛋白含量大於50％。
本發明上述口含速溶地龍蛋白藥物製劑由下述方法製得[oo10] 取新鮮地龍用水性緩沖液製成勻漿，經冷凍高速離心，取上清液，在。一lo℃低溫條件下加入沉澱劑，攪拌均勻，放置3小時；經冷凍高速離心，取沉澱物，用水性緩沖液溶解，透析除鹽，製得地龍蛋白液；經冷凍乾燥，製得地龍蛋白凍乾粉末，加入複合矯味劑，即製得口含速溶地龍蛋白藥物製劑。[oo11] 本發明上述製備方法中，水性緩沖液優選水或磷酸鹽緩沖液。[oo12] 本發明上述製備方法中，沉澱劑優選體積濃度為65一lOO％(V／V)乙醇溶液1丙酮或硫酸銨。[oo13] 本發明上述製備方法中，矯味劑優選阿斯巴甜1菠蘿香精或除腥除臭香精。[oo14] 本發明上述製備方法中，冷凍乾燥的優選工藝條件為[oo15] 步驟l升溫速率2．1℃／m[n，樣品溫度一30℃，凍幹時間o．5小時；[oo16] 步驟2升溫速率1．16℃／m[n，樣品溫度o℃，凍幹時間6．o小時；[oo17] 步驟3升溫速率1．ol℃／m[n，樣品溫度5℃，凍幹時間lo．o小時；[oo18] 步驟4升溫速率1．16℃／m[n，樣品溫度20℃，凍幹時間20．o小時。[oo19] 本發明還涉及上述口含速溶地龍蛋白藥物製劑在製備具有平喘作用的藥物中的應用。
本發明上述用途中，地龍蛋白以片劑1顆粒劑1乾粉劑或其他適合於口含速溶的形式存在於一個攝入單位中。
本發明上述用途中，每個攝入單位含有地龍蛋白1．o一3．og。
本發明上述用途中，每個攝入單位中地龍蛋白重量百分比為60％一80％，餘量為藥用輔料和矯味劑。
後續的實施例和試驗例將證明，本發明藥物製劑具有較顯著的抗哮喘作用，可有效抑制卵蛋白致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘反應，且通過離體氣管平滑肌初步分析其作用機制可能與抗白三烯作用有關。


圖l是卵白蛋白致敏模型哮喘潛伏期結果 圖卜l是高溫影響因素5d凝膠色譜 圖卜2是高溫影響因素lod凝膠色譜 圖卜3是高溫影響因素od凝膠色譜 圖卜4是高溫影響因素5d指紋圖譜；
圖卜5是高溫影響因素lod指紋圖譜；
圖卜6是高溫影響因素od指紋圖譜；
圖2一l是Rf]50％影響因素5d凝膠色譜 圖2—2是RH75％影響因素5d凝膠色譜 圖2—3是肚[90％影響因素5d凝膠色譜 圖2—4是肚[50％影響因素lod凝膠色譜 圖2—5是RH75％影響因素lod凝膠色譜圖2-6是RH90%影響因素IOd凝膠色譜圖；圖2-7是高溼影響因素Od凝膠色譜圖；圖2-8是RH50%影響因素5d指紋圖譜；圖2-9是RH75%影響因素5d指紋圖譜；圖2-10是RH90%影響因素5d指紋圖譜；圖2-11是RH50%影響因素IOd指紋圖譜；圖2-12是RH75%影響因素IOd指紋圖譜；圖2-13是RH90%影響因素IOd指紋圖譜；圖2-14是鮮地龍蛋白製劑溼度影響因素Od指紋圖譜；圖3-1是光照影響因素5d凝膠色譜圖；圖3-2是光照影響因素IOd凝膠色譜圖；圖3-3是光照影響因素Od凝膠色譜圖；圖3-4是光照影響因素5d指紋圖譜；圖3-5是光照影響因素IOd指紋圖譜；圖3-6是光照影響因素Od指紋圖譜；圖5-1-1是_20°C穩定性一個月凝膠色譜圖；圖5-1-2是_20°C穩定性兩個月凝膠色譜圖；圖5-1-3是_20°C穩定性三個月凝膠色譜圖；圖5-1-4是_20°C穩定性0個月凝膠色譜圖；圖5-1-5是_20°C穩定性一個月指紋圖譜；圖5-1-6是-20°C穩定性兩個月指紋圖譜；圖5-1-7是-20°C穩定性三個月指紋圖譜；圖5-1-8是_20°C穩定性0個月指紋圖譜；圖5-2-9是4°C穩定性一個月凝膠色譜圖；圖5-2-10是4°C穩定性兩個月凝膠色譜圖；圖5-2-11是4°C穩定性三個月凝膠色譜圖；圖5-2-12是4°C穩定性0個月凝膠色譜圖；圖5-2-13是4°C穩定性一個月指紋圖譜；圖5-2-14是4°C穩定性兩個月指紋圖譜；圖5-2-15是4°C穩定性三個月指紋圖譜；圖5-2-16是4°C穩定性0個月指紋圖譜；圖5-3-17是室溫一個月穩定性凝膠色譜圖；圖5-3-18是室溫兩個月穩定性凝膠色譜圖；圖5-3-19是室溫三個月穩定性凝膠色譜圖；圖5-3-20是室溫0個月穩定性凝膠色譜圖；圖5-3-21是室溫穩定性一個月指紋圖譜；圖5-3-22是室溫穩定性兩個月指紋圖譜；圖5-3-23是室溫穩定性三個月指紋圖譜；圖5-3-M是室溫穩定性0個月指紋圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用於說 明本發明而不用於限制本發明的保護範圍。在閱讀了本發明記載的內容之後，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限 定的範圍。實施例1 地龍活性蛋白的製備取新鮮蚯蚓放入水中反覆清洗，排盡其消化道汙物，洗淨，稱重，加入2倍量的 20mM、PH值為6. 8的磷酸鹽緩衝液，組織攪碎機中搗碎，製成勻漿，室溫抽提4_6小時，4°C 高速離心20分鐘，取上清液，在4°C下，緩慢加入研磨好的硫酸銨固體，邊加邊攪拌，使硫酸 銨的飽和度達到80%，4°C放置過夜，4°C高速離心10分鐘，取沉澱，將沉澱用20mM、PH值為 6. 8的磷酸鹽緩衝液懸浮，分子量3500透析袋中對20mM、PH值為6. 8的磷酸鹽緩衝液透析 48小時，中間換液4-5次，所得蛋白液4°C高速離心20分鐘，上清液為地龍活性蛋白。實施例2 地龍活性蛋白口含速溶製劑的製備在地龍活性蛋白中加入5%。阿斯巴甜、10%菠蘿香精、10%除腥除臭香精，攪拌均 勻後，按照下列步驟冷凍乾燥而成步驟1 升溫速率2. I0C /min，樣品溫度_30°C，凍幹時間0. 5小時；步驟2 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度0°C，凍幹時間6. 0小時；步驟3 升溫速率1. Ol0C /min，樣品溫度5°C，凍幹時間10. O小時；步驟4 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度20°C，凍幹時間20. O小時。實施例3 地龍活性蛋白的平喘作用研究1.造模方法將卵白蛋白(III grade)溶於生理鹽水，配成5%卵白蛋白生理鹽水溶液。每隻豚 鼠兩後腿部各肌內注射0. 5ml，腹腔注射lml，2周後將致敏豚鼠置於密閉的玻璃鐘罩內，用 0.1%卵白蛋白霧化激發。2.分組、給藥劑量豚鼠40隻，早$各半，隨機分為5組，每組8隻，五組分別為空白組，陽性藥(孟 魯司特鈉片)對照組，高、中、低三個給藥濃度組。濃度設置為鮮地龍平喘活性蛋白0. 12g/ kg為中間濃度，再分別升降為0. 06g/kg和0. Mg/kg。給藥量設為10ml/kg。三個給藥濃度 蛋白溶液的配製為分別將0. 48g，0. 24g,0. 12g鮮地龍平喘活性蛋白提取物溶於20ml的生 理鹽水中，即高、中、低三個濃度的蛋白溶液。孟魯司特鈉片給藥量設定為10mg/kg:將20mg 的孟魯司特鈉片溶解在生理鹽水中。豚鼠致敏2周後，均於抗原攻擊前1小時給藥1次。3.實驗結果使用SPSS13. O進行方差分析得結果如表1。表1卵白蛋白致敏模型哮喘潛伏期結果組別劑量(g/kg)哮喘潛伏期(S)空白組044. 25 ±11. 54低劑量組0. 0663. 25±22. 11中劑量組0. 2485. 50±21.06*高劑量組0. 4887. 25土25. 861*孟魯司特10mg/kg94. 50士17. 45*注*與空白組比ρ <0.05，有顯著性差異.4.結論與空白組相比，中濃度組、高濃度組，陽性藥組均有顯著性差異，表明鮮 地龍平喘活性蛋白0. 12g/kg，0. 24g/kg可有效地拮抗由卵白蛋白誘發的哮喘，且和陽性藥 孟魯斯特鈉10mg/kg對比無顯著性差異。實施例4 地龍活性蛋白口含速溶製劑的製備(製備2)地龍平喘蛋白在下列步驟下所得的凍乾粉，加入5%。阿斯巴甜、10%菠蘿香精、 10%除腥除臭香精，即得。凍幹步驟步驟1步驟2步驟3步驟4
升溫速率2. I0C /min，樣品溫度_30°C，凍幹時間0. 5小時； 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度0°C，凍幹時間6. O小時； 升溫速率1. Ol0C /min，樣品溫度5°C，凍幹時間10. O小時； 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度20°C，凍幹時間20. O小時。實施例5 地龍活性蛋白對白三烯收縮離體豚鼠氣管平滑肌的影響1.實驗方法先用氨甲醯膽鹼(CCH) IX 10-6M收縮氣道平滑肌以檢驗平滑肌製備的活性，洗3 遍，待回到基線後再次加入氨甲醯膽鹼(CCH) 1 X 10-6M收縮平滑肌，洗3遍，待回到基線後 加入消炎痛(indomethacin) 5 X 10-6M(避免孵育在克-亨氏液的氣管平滑肌產生環氧酶產 物)和L-半胱氨酸鹽酸鹽(L-Cysteine鹽酸鹽)3X 10_3M(避免LTD4快速降解)，5分鐘 後加入受試樣品lX10-7g/L或孟魯司特1X10-7M，最後加入LTD41X10-7M。計算公式 LTD41 X 10-7M 收縮％ (以 CCH IX 10-6M 收縮高度為 100% ) = LTD41 X 10-7M 收縮幅度 / CCHl X 10-6M收縮幅度X 100%，實驗結果見表2。表2活性蛋白質對LTD4收縮離體豚鼠氣管平滑肌的影響
7受試藥物反應(％)
權利要求
1.一種口含速溶地龍蛋白藥物製劑，其特徵是，該製劑由重量百分含量為75%的地龍 蛋白提取物和重量百分含量為25%的複合矯味劑組成，其中，地龍蛋白提取物中蛋白含量 大於50%。
2.權利要求1所述的口含速溶地龍蛋白藥物製劑的製備方法，包括如下步驟 取新鮮地龍用水性緩衝液製成勻漿，經冷凍高速離心，取上清液，在0-10°C低溫條件下加入沉澱劑，攪拌均勻，放置3小時；經冷凍高速離心，取沉澱物，用水性緩衝液溶解，透析 除鹽，製得地龍蛋白液；地龍蛋白液經冷凍乾燥，製得地龍蛋白凍乾粉末，加入複合矯味劑， 製得口含速溶地龍蛋白藥物製劑。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是，水性緩衝液為水或磷酸鹽緩衝液。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是，沉澱劑是體積濃度為65-100%的乙醇 溶液、丙酮或硫酸銨。
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是，矯味劑是阿斯巴甜、菠蘿香精或除腥除臭香精。
6.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵是，冷凍乾燥的工藝條件為 步驟1 升溫速率2. I0C /min，樣品溫度_30°C，凍幹時間0. 5小時； 步驟2 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度0°C，凍幹時間6. 0小時； 步驟3 升溫速率1. Ol0C /min，樣品溫度5°C，凍幹時間10. 0小時； 步驟4 升溫速率1. 160C /min，樣品溫度20°C，凍幹時間20. 0小時。
7.權利要求1所述的口含速溶地龍蛋白藥物製劑在製備具有平喘作用的藥物中的應用。
8.權利要求7的用途，其特徵是，地龍蛋白以片劑、顆粒劑、乾粉劑或其他適合於口含 速溶的形式存在於一個攝入單位中。
9.權利要求8的用途，其特徵是，每個攝入單位含有地龍蛋白1.0-3.0g。
10.權利要求7或8的用途，其特徵是，每個攝入單位中地龍蛋白重量百分比為 60% -80%，餘量為藥用輔料和矯味劑。
全文摘要
本發明涉及一種動物蛋白類藥物口含速溶製劑，具體公開了一種地龍蛋白的口含速溶製劑。該製劑由重量百分含量為75％的地龍蛋白提取物和重量百分含量為25％的複合矯味劑組成，其中，地龍蛋白提取物中蛋白含量大於50％。及製備方法。另外，本發明還公開了該製劑的製備方法和應用。本發明製劑具有較顯著的抗哮喘作用，可有效抑制卵蛋白致敏豚鼠抗原攻擊引起的哮喘反應，且通過離體氣管平滑肌初步分析其作用機制可能與抗白三烯作用有關。
文檔編號A61K38/17GK102068460SQ20091020185
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年11月24日
發明者馮怡, 徐德生, 阮克鋒 申請人:上海中醫藥大學