一種控制水稻株型，器官大小，根系及結實率性狀的xiao基因的克隆與應用的製作方法

2023-05-07 07:11:21

專利名稱：一種控制水稻株型，器官大小，根系及結實率性狀的xiao基因的克隆與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術和基因工程技術領域。具體涉及一個位於水稻第四染色體長臂上參與油菜素內酯信號傳導途徑，控制水稻株型、器官大小、根系和結實率多效性基因XIAO的克隆及應用。
背景技術：
多種因素會影響水稻的產量。其中分櫱、每穗穎花數、穀粒的大小、株型、結實率以及根系的發達程度都會對產量造成極大的影響。隨著水稻功能基因組平臺的建立和發展， 分離克隆這些水稻重要農藝性狀基因的速度明顯加快。利用T-DNA插入突變體克隆基因顯得尤為突出。株高是影響產量的一個重要因子。矮化水稻，可提高水稻的耐肥性，從而大幅提高產量。上世紀60年代在亞洲大面積推廣的矮化品種，大幅提高了產量，並稱為水稻的「第一次綠色革命」。2002年，水稻綠色革命基因SDl被克隆，發現它是一個赤黴素合成途徑的基因(Sasaki et al.，2002)。陳了赤黴素，油菜素內酯、生長素、細胞分裂素都發現參與株高的控制。產量的構成因子還有每穗穎花數(穗大小)，粒重(粒大小)。綜合來看，株高、穗大小、粒大小都是植物器官變化的單個表現形式，本質上是細胞分裂，分化的結果。另外，株型、葉傾角其實是由葉枕細胞分裂，伸長所致。因此，從細胞分裂入手，直接尋找控制細胞分裂的基因，是一種快速，高效克隆產量基因的方法。細胞如何分裂是最基本的生物學問題之一。過去對細胞分裂，細胞周期的研究成果大部分是基於單細胞的水平。研究植物器官大小，不僅能在植物整體發育水平上研究細胞分裂問題，更能夠提高產量。植物器官大小是由組成器官的細胞數目和細胞大小決定的(Li et al. ,2008； Mizukami and Fischer, 2000 ；Szecsi et al.，2006)，並且，從目前克隆的基因來看，細胞數目的變化是器官變化的主要細胞學基礎。從發育的角度來看，器官原基的大小，細胞分裂持續的時間以及分裂的速度三者決定了最終器官的大小(Anastasiou et al.，2007 ；Barroco et al.，2006)。細胞數目的變化是由細胞周期決定的。AINTEGUMENATA(ANT)調控擬南芥器官大小的發育生物學基礎是使細胞持續分裂的時間延長，它的分子機制則是ANT使細胞周期蛋白CycD3的表達時間延長，在9星期發育成熟的老葉中，超表達的植株葉片中CycD3的表達量顯著高於對照，而在細胞分裂旺盛的花芽中CycD3的表達差異不顯著(Mizukami and Fischer, 2000) 0因此，通過調控細胞周期基因就有可能達到控制植物器官大小的目的。依賴細胞周期蛋白的激酶抑制因子(CDKI)通過與細胞周期蛋白(cyclin)和依賴細胞周期蛋白激酶(CDK)複合體結合，達到抑制CDK的活性，從而抑制細胞周期的進行。Barroco發現在超表達CDKI的水稻的第6片葉比對照要短14%，葉片變小的機制是CDKI降低了的細胞分裂速率(Barroco et al. 2006)。植物激素在植物的形態建成中發揮了重要的作用。其中一種機制就是植物激素通過調控細胞周期相關基因的表達來實現的(del Pozo et al.，2005)。受生長素響應的 ARGOS是一個控制擬南芥器官大小的基因，它通過延長它的下遊基因ANT和CycD3的表達時間，使得細胞持續分裂的時間延長，最終決定了器官的大小(Hu et al.，2006)。並且，ARGOS 在水稻中的同源基因OsARGOS也能使擬南芥器官變大，OSARGOS同時受生長素和細胞分裂素誘導。生長素控制器官大小的另一個例子就是生長素響應因子(AUXINRESPONSE FACTOR 2，ARF2)。在arf2突變體中，ARGOS, ANT和CycD3的表達時間都延長了，最終導致arf2的種子變大(Schruffet al. ,2006) 本發明從細胞分裂的角度，克隆參與水稻株型、產量相關基因，並挖掘植物激素在其中發揮的重要作用，為水稻理想株型的分子設計育種挖掘基因資源。

發明內容
針對上述研究背景，本發明的目的在於分離克隆水稻產量相關基因ΧΙΑ0(大寫斜體表示，下同)，並為利用植物激素應答而調節水稻產量提供一種新的途徑。XIAO基因具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，也包括與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一個或多個鹼基而產生的突變體等位基因或衍生物。本發明也包括SEQ ID NO :2所示的XIAO(大寫正體表示，下同)蛋白的胺基酸序列，及與SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列具有90%同源性以上的胺基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一個或多個胺基酸而產生的功能類似物。本發明克隆的水稻XIAO基因的T-DNA插入失活突變體xiao (小寫斜體表示，下同)在形態上總體表現出器官變小、株型直立，根系捲曲及結實率下降(見實施例2，圖1， 圖5)，並且突變表型也與在XIAO基因內的T-DNA插入共分離(見實施例1)。正常功能的 XIAO基因轉化該突變體後植株恢復為野生型的表型(見實施例1，表1)。實現本發明的具體技術步驟如下1.篩選華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室創建的水稻T-DNA插入突變體庫(Wu et al.，2003)，篩選得到一個產量相關的突變體材料05Z11EJ51，我們將其命名為 xiao，突變體的篩選鑑定方法見實施例1第1部分中詳細描述。2.本發明比較了野生型(WT，下同)和突變體xiao對外援施加植物激素油菜素內酯(BR，下同)的反應，結果表明產生突變體的表型的原因是由於突變體對BR超敏感(見實施例3)。3.通過對突變體xiao的T-DNA插入與突變性狀的共分離驗證及功能互補實驗 (見實施例1)，成功克隆產量相關基因XIAO。詳細的技術發明細節在《具體實施方式
》中列出。本發明的優點是1.本發明克隆了一個同時控制多種產量構成因子的基因。2.本發明發現調控植物激素如油菜素內酯能夠調節水稻產量。


序列表SEQ ID NO 1 是本發明分離克隆來源於水稻品種「日本晴」的XIAO基因的核苷酸序列，序列全長6474bp，包括編碼區(3001-6474bp)。
序列表SEQ ID NO :2是本發明分離克隆的來源日本晴的XIAO蛋白的胺基酸序列。圖1 野生型和突變體xiao的表型比較。圖IA 成熟期水稻野生型植株與不育植株形態比較左為野生型WT，右為突變體
xiaoo圖IB 成熟期水稻野生型植株與不育植株株高比較左為野生型WT，右為突變體
xiaoo圖IC 成熟期水稻野生型植株與不育植株花葯比較左為野生型WT，右為突變體
xiaoo圖ID 成熟期水稻野生型植株與不育植株種子比較左為野生型WT，右為突變體
xiaoo圖IE 成熟期水稻野生型植株與不育植株劍葉葉傾角比較左為野生型WT，右為突變體xiao。圖2. XIAO基因型鑑定。圖2A :ΧΙΑ0基因的結構和T-DNA插入位點分析。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA) 已經標出，實心黑方框表示XIAO基因的唯一一個外顯子，空心黑方框表示UTR ；三角形表示 xiao T-DNA插入的位置。Pl，P2，表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位於xiao突變體中T-DNA上的邊界引物。圖2B 是一個xiao T-DNA插入雜合植株後代的基因型檢測。植株基因型的確定當 Pl和P3配對時才可以擴增出目標產物，由於T-DNA插入片段太大，Pl與P2配對擴增的產物無法得到；野生型植株由於沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對擴增沒有產物，但可以利用引物Pl與P2配對擴增得到目標產物；而XIAO雜合T-DNA插入轉基因植株則Pl和P2 配對以及Pl和P3配對時都可以擴增得到產物。植株表型20個Tl代單株中第4、7、8、10、 16和18株為突變表型(以M表示)。由圖可知突變體的基因型均為純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生(以W表示)或雜合型(以H表示)，這一結果表明表型與XIAO基因內的T-DNA插入共分離。圖3. XIAO基因功能互補實驗。圖3A 互補載體PC2301-XIA0結構示意圖，該載體的構建說明見實施例1中的第 3部分，即將含有基因XIAO的完整的編碼區和其啟動子區域用EcoR I和)(bal I從BAC克隆(0SJNBa0020J04)酶切後克隆到載體pCAMBIA2301 (由澳大利亞CAMBIA實驗室贈送，http://www. cambia. org/daisy/cambia/materials/overview, html)上形成的新質粒。以pCAMBIA2301空載體轉化植株作為陰性對照。圖;3B =XIAO基因功能互補實驗所用的載體pCAMBIA2301結構示意圖。圖4 野生型和突變體花葯縱切比較細胞數目。圖4A、圖4C表示野生型成熟花葯花葯縱切片。圖4B、圖4D表示突變體成熟花葯花葯縱切片。英文字母分別表示花葯的結構。E 表皮細胞，P 花粉粒。Bars = 50 μ m圖5.用表油菜素內酯(BL)處理野生型和突變體的結果。圖5A 在對照(不添加BL)培養基中生長的根，左為野生型WT，右為突變體xiao。圖5B 在處理(添加0.01 μ M BL)培養基中生長的根，左為野生型WT，右為突變體
5xiaOo圖5C:將WT和xiao種子在培養基(依次添加0，0·01，0· 1，1μΜ BL)中黑暗發芽，
測量胚芽鞘長度，作圖。圖6.構建本室突變體庫所用到的載體pFX-EM. 2-15R圖7.用Realtime PCR方法檢測野生型和突變體中細胞周期基因的表達量
具體實施例方式實施例1 :ΧΙΑ0基因的分離克隆1. xiao突變體的獲得所用的水稻T-DNA插入突變體庫由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室利用載體PFX-EM.2-15R構建而成(Wu et al.，200 。突變體的篩選鑑定方法是從上述水稻T-DNA插入突變體庫(RMD ;http://rmd. ncpgr. cn/)中將Ttl代轉基因水稻種子(轉化受體是中花11號，為中國農業科學院培育的常用水稻品種)，經浸種、催芽後播於秧田，20 天后移栽至大田。種植密度為5寸X8寸，種植地點為中國湖北省武漢市洪山區華中農業大學的試驗田，按常規的水稻種植方法進行田間管理。經過大田篩選得到一個器官變小，不育，株型直立的家系(圖1)。原始編號為05Z11EJ51。申請人將這個突變體命名為xiao。 該突變體已經收集到水稻突變體庫中(RMD :http://rmd. ncpgr. cn/),該突變體庫的所有資源均可被研究人員索取(Zhang et al.，2006)。2. T-DNA插入側翼序列與突變表型的共分離檢測為了證實xiao的突變表型是由於XIAO基因內的T-DNA插入引起，本發明對20個 T1代轉基因植株(其中，第4、7、8、10、16和18株為突變單株)進行了 T-DNA插入位點側翼序列與突變表型的共分離檢測。共分離檢測的具體步驟為(1)在XIAO基因T-DNA插入位點兩側設計一對基因組引物Pl(5 『 -TTGACGGTGCTCGACCTTTC-3『)和 P2 (5『 -TACGCACTGCATTCGTTCTC-3『)，在 T-DNA上設計一條載體引物P3 (5』 -ATCCAGATCCCCCGAATTA-3』)，如圖2A。在T1代植株中， XIAO純合T-DNA插入植株只有當Pl和P3配對時才可以擴增出目標產物；而由於T-DNA插入使Pl與P2配對擴增的產物> 101Λ，在申請人設定的PCR反應程序無法得到相應PCR產物(這樣鑑定植株基因型的方法是領域內的通用方法)。野生型植株由於沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對擴增沒有產物，但可以利用引物Pl與P2配對擴增得到目標產物。而 XIAO雜合T-DNA插入轉基因植株則Pl和P2配對以及Pl和P3配對時都可以擴增得到產物。(2)應用CTAB法(Liu et al.，1997)。從20株T1代單株中分別抽提總DNA作為模板， 用(1)中引物組合P1+P3和P1+P2進行PCR擴增。反應體系為20 μ L，具體包含DNA模板 IyL5IO 倍體積的 Taq 酶反應緩衝液 1. 5 μ 1 ； 2mM dNTPO. 9 μ L ； 25mM 鎂離子 1. 2 μ L ;10 μ M 引物各0. 2yL;l個單位Taq酶，加雙蒸水至15yL。反應參數設置如下94°C 4min -MV 30sec，58°C 30sec，72°C 1. 5min,35 cycles ；72°C 5min，25°C lmin。(3)將反應產物經瓊脂糖凝膠電泳，根據凝膠上的帶型判定各個單株的基因型。實驗結果顯示，20株T1代單株中，6株突變體表型植株的基因型均為XIAO純合T-DNA插入，而其他14株表型正常的植株基因型為野生或雜合型(如圖2B)。這表明xiao突變體的突變表型是由於XIAO基因內的 T-DNA插入造成，且該突變體表現為隱性純和突變體。
3.互補載體的構建互補載體pC2301-XIA0的構建方法如下以pCAMBIA2301載體為骨架載體，用EcoR I和)(bal I酶切水稻「日本晴「BAC克隆0SJNBa0020J04，得到一系列將酶切片段，其中包括目的片段含整個XIAO基因編碼區及ATG前約3. Ikb和終止密碼後約3. 6kb (圖3A)。將酶切片段與用EcoR I和)(bal I雙酶切的載體質粒PCAMBIA2301連接(圖;3B)(所使用的內切酶、鹼性磷酸酶均購自Takara公司，連接酶購自!Iomega公司，具體用法與用量參考該產品的說明書)。連接產物通過電轉化的方法(電轉化儀為印pendorf公司產品，本發明所用電壓為1800V，具體操作參考該儀器的使用說明書)導入大腸桿菌DHlOB (購自!Iomega公司) 中，加800ul LB復甦30分鐘，取80ul塗於含卡那黴素、5-溴-4-氯-3- 口引哚- β -D-半乳糖(Χ-β-gal)及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37°C溫箱培養14-16小時(LA與LB配方參考薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)。 挑白色單克隆，擴大培養並抽提質粒，酶切驗證及測序驗證後得到目的克隆。把構建好的載體電轉入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (由澳大利亞CAMBIA實驗室贈送) 中。轉化後的菌株命名為EHA105-p2301-XIA0。4.遺傳轉化採用農桿菌介導的遺傳轉化方法將菌株EHA105-pC2301-XIA0導入xiao突變體的愈傷組織，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有G418 (用於篩選陽性的轉基因愈傷的一種抗生素，購自北京原平皓生物技術有限公司)抗性的愈傷組織、分化、生根及煉苗移栽大田得到轉基因植株(農桿菌介導的遺傳轉化試劑及配方主要應用Hiei等人報導的方法基礎上進行優化(Hiei et al. ,1994 ；Lin and Zhang, 2005) 參見申請人先前的專利文獻，專利號ZL 200710053552. 9，發明的名稱水稻廣親和基因S5的分離克隆及應用專利申請日2007年10月15日；專利
公開日2008年6月18日；
發明者張啟發, 江雲鶴 申請人:華中農業大學