超氧化物歧化酶的製備方法
2023-05-15 06:54:26 1
專利名稱：超氧化物歧化酶的製備方法
技術領域：
本發明屬於酶學，具體涉及超氧化物歧化酶的製備方法。
背景技術：
SOD是「超氧化物歧化酶」，簡寫「Superoxde dismutase，是國際上公認的唯一無爭議的抗老、抗病物質。氧化物歧化酶是一類金屬酶，廣泛存在於生物體內，它是一種氧自由基清除劑，具有保護機體免受損傷的作用，對人、畜均無毒副作用。
SOD超氧化物歧化酶是清除人體過剩氧自由基的專一清除劑。氧自由基是加速衰老，產生各種疾病的根源。20世紀，科學家們提出了人體疾病衰老的八大學說，自由基學說是當中唯一被證實且最為可靠的一種學說，其比較清楚的闡述了機體疾病衰老的過程。人分分秒秒都要呼吸，組織器官時時刻刻都在進行氧代謝，在正常生理情況下，自由基的生成與清除處於動態平衡，當某種因素使氧自由基生成過多或超出清除能力或清除能力減弱時，過多的氧自由基損傷生命大分子，破壞細胞的結構與功能，導致疾病的發生與發展，從而加速機體老化。現代醫學已經證實氧自由基引起的疾病，已超過一百多種，嚴重的威脅著我們的健康與長壽。
SOD是機體內氧自由基的頭號殺手，是科學界證明、國內外公認的氧自由基的專一清除劑。在SOD高效催化作用下，自由基被歧化為雙氧水和氧，在聯合清除劑SOD---CCP的協調作用下，使之成為水和新生氧，從而徹底清除體內的過剩氧自由基。目前，廣泛應用於醫藥、保健、食品、化妝品等領域。市場上已上市的商品有老來福SOD口服液、丁氏抗衰老酒、大寶SOD蜜等。
SOD應用的市場主要集中在三個方面，即藥品、食品和日化產品。作為藥物應用方面SOD的適應症很多，如關節炎、再灌流損傷綜合症、放療引起的組織纖維化、燒燙傷等。但作為藥用目前只進行了防治關節炎和抗放射損傷作用方面的開發。一旦作為新藥批准，其他劑型和用藥目的的SOD製劑將會很快得到開發。因此，SOD有作為藥用的巨大潛力。在作為食品添加劑方面，已經應用於牛奶、啤酒、飲料、含片等，並製成了膠囊直接口服。目前，含SOD保健食品的普及率還很低，一旦大眾認識了其功能，必將產生更大的市場。在作為化妝品添加劑應用方面，近幾年用量呈急劇增加的態勢，因為，將SOD用於各種形式的化妝品中，其肯定的增白和祛斑作用深受廣大消費者的歡迎。SOD在日化工業的應用仍將繼續增長。SOD在其他方面如農業的應用也在研究之中，每一項突破都能導致其巨大的潛在市場。根據在市場各行業需求及出口量預測，每年可消耗SOD約10萬億單位。
目前，由於分離提取的方法不適宜大規模生產，生產成本高，操作困難，SOD產量遠遠不能滿足市場需求。
發明內容
本發明的目的在於提供超氧化物歧化酶的製備方法，該製備方法簡便，成本低廉，適宜大規模生產SOD。
本發明的技術解決方案是該製備方法採用新鮮豬血塊提取SOD，首先由新鮮豬血製得粗品SOD，然後純化粗品製得精品SOD。
粗品SOD的製備過程包括有冷藏、清洗、提取、熱變、萃取、沉澱、除菌、透析除鹽、冷凍乾燥。
1、冷藏將新鮮血液傾入容器中，置於冷庫中冷藏使其自然結塊。
2、清洗將血塊攪碎，置於濾網中用水衝洗，洗淨濾幹，得無血清血塊。
3、提取將無血清血塊放入容器中，加入無血清血塊0.2倍量20％的曲拉通X-100溶液，攪拌20-40分鐘，抽濾收集血漿。其中，20％曲拉通X-100溶液由800ml純水加200毫升曲拉通X-100配製而成，曲拉通X-100別名乳化劑0P，辛基苯聚氧乙烯醚。
4、熱變將血漿傾入反應罐中，加熱到65℃，在攪拌的條件下恆溫反應20-40分鐘，冷卻至室溫，離心收集上清液；對上清液進行二次熱變，加熱到65℃，恆溫20分鐘，在恆溫期按1kg原血量加4g氯化銅，冷卻至10-15℃，離心收集上清液。
5、萃取將上清液傾入容器中，加入上清液體積2/5的乙醇一氯仿混合液，其中乙醇與氯仿體積比為5∶3，攪拌幾分鐘，離心收集濾液於另一容器中，調整PH值為7.6，在攪拌的條件下，按濾液體積的43％比例加入K2HP4，再次調整PH值為7.6，再加入濾液體積1/5的乙醇一氯仿混合液，攪拌均勻後，傾入分液漏鬥中分層，收集上層清液。
6、沉澱將上述清液傾入容器中，加入清液1倍量的冷丙酮，攪拌均勻，在4-10℃的條件下靜置5-6小時，離心收集沉澱。
7、除菌用沉澱物2倍量的三氯甲烷多次衝洗沉澱物；8、透析除鹽以500ml蒸餾水加2g丙酮配製清洗液，用清洗液對沉澱物衝冼多次；9、冷凍乾燥將透析除鹽後的沉澱物冷凍乾燥得即粗品SOD。
精品SOD的製備包括有溶解、柱層折、洗脫、透析、乾燥1、溶解將所得的SOD粗品溶於PH7.6、2.5μmmol/l、K2HP4-KH2PO4緩衝劑中，經超濾得澄清液。
2、柱層折將澄清液上DEAEsepnadexA-50層析，上樣流速控制在100-200毫升/小時。
3、洗脫上樣至飽和後，用同一緩衝劑進行梯度洗脫，控制流速為100-200毫升/小時，取樣監測具有SOD活性的蛋白峰。
4、透析將上述所收集的SOD洗脫液裝入透析袋中，在蒸餾水中透析除鹽，收集透析液。
5、乾燥將透析液超濾濃縮，然後冷凍乾燥，即可得外觀微帶淺藍綠色的Cu·Zn-SOD產品。
本發明就地取材，變廢為寶，工藝簡單，成本低廉，產品得率高，適宜大規模工業化生產。
圖1為本發明粗品SOD製備流程簡2為本發明精品SOD製備流程簡圖具體實施方式
採用新鮮豬血首先製得粗品SOD，然後純化粗品製得精品SOD。
粗品SOD製備過程如下1、冷藏取新鮮血液100kg傾入不鏽鋼桶中，置於10℃冷庫中冷藏3-4小時，使其自然結塊。
2、清洗將血塊攪碎，置於雙層尼龍布中，先用自來水衝洗3遍，再用蒸餾水洗淨濾幹，得無血清血塊。
3、提取將無血清血塊放入不鏽鋼桶中，加入無血清血塊0.2倍量的20％的曲拉通X-100溶液，並在3000轉/分鐘的條件下劇烈攪拌30分鐘，抽濾收集血漿。其中，以800ml純水加200毫升曲拉通X-100製得濃度為20％曲拉通X-100溶液，曲拉X-100通別名乳化劑OP，辛基苯基聚氧乙烯醚。
4、熱變將血漿傾入不鏽鋼夾層反應罐中，加熱到65℃，在攪拌的條件下恆溫反應30分鐘，然後冷卻至室溫25℃，離心收集上清液；對上清液進行二次熱變，溫度65℃恆溫20分鐘，恆溫期加400g氯化銅，冷卻至10℃，離心收集上清液。
5、萃取將上清液傾入不鏽鋼桶中，加入濾液體積2/5的乙醇一氯仿混合液，其中乙醇∶氯仿(V∶V)＝5∶3，攪拌5分鐘，離心收集濾液於另一不鏽鋼桶中，調整PH值為7.6，在攪拌的條件下，按濾液體積的43％比例加入K2HP4，再次調整PH值為7.6，再加入濾液體積1/5的乙醇一氯仿混合液，攪拌均勻後，傾入分液漏鬥中分層，收集上層清液。
6、沉澱將上述清液傾入搪瓷缸中，加入清液1倍量的冷丙酮，攪拌均勻，在4-10℃的條件下靜置5-6小時，離心收集沉澱。
7、除菌用上述沉澱物2倍量的三氯甲烷兩次衝洗沉澱物；8、透析除鹽以500ml蒸餾水加2g丙酮配製清洗液，用清洗液對沉澱物衝冼三次；9、冷凍乾燥用乾燥器在冷庫中0-4℃冷凍乾燥上述沉澱物得50g粗品SOD，比活力3000u/mg，蛋白質濃度40％。
精品SOD的製備1、溶解將上述所得的SOD粗品溶於PH7.6、2.5μmmol/lK2HP4-KH2PO4緩衝劑中，經超濾得澄清液。其中，緩衝劑由K2HP4、PKH2PO4等體積配製。
2、柱層折將澄清液上DEAEsepnadexA-50層析，柱Ф7.5-40cm，該柱先用緩衝劑平穩，上樣流速控制在100-200毫升/小時。
3、洗脫上樣至飽和後，用同一緩衝劑進行梯度洗脫，控制流速為100-200毫升/小時，仔細取樣監測具有SOD活性的蛋白峰，不同血源的Cu·Zn-SOD其具有SOD活性的最大蛋白峰紫外光吸收的「光密度最大值」存在差異牛血為258nm處，豬血為265nm處。
4、透析將上述所收集的SOD洗脫液，裝入透析袋中，在蒸餾水中透析除鹽，收集透析液。
5、乾燥將透析液超濾濃縮，然後冷凍乾燥，即可得外觀微帶淺藍綠色的Cu·Zn-SOD產品30g，其酶的比活力可達3600-10000u/mg，蛋白質濃度36％。
儲存入庫溫度0-5℃，保質期可達3年以上。
檢測方法一、紫外線檢測取少量SOD精品放在一張白紙上，在日光燈的照射下，顏色不改變則質量差，顏色慢慢變成白色則說明質量好。
二、化學檢測1、取少量精品SOD，放在燒杯中，倒入一定量鄰苯三酚，冒汽泡，開始氧化2分鐘以後，SOD改變顏色，由淡藍色變黑色。2、倒在平板玻璃上，流動向一個方向走，不亂流，形狀粘糊狀，說明質量過關。
權利要求
1.超氧化物歧化酶的製備方法，其特徵在於該製備方法採用新鮮豬血塊提取SOD，首先由新鮮豬血製得粗品SOD，然後純化粗品製得精品SOD。
2.根據權利要求1所述的超氧化物歧化酶的製備方法，其特徵在於粗品SOD的製備過程包括有冷藏、清洗、提取、熱變、萃取、沉澱、除菌、透析除鹽、冷凍乾燥(1)、冷藏將新鮮血液傾入容器中，置於冷庫中冷藏使其自然結塊。(2)、清洗將血塊攪碎，置於濾網中用水衝洗，洗淨濾幹，得無血清血塊。(3)、提取將無血清血塊放入容器中，加入無血清血塊0.2倍量的濃度20％的曲拉通X-100溶液，攪拌20-40分鐘，抽濾收集血漿。(4)、熱變將血漿傾入反應罐中，加熱到65℃，在攪拌的條件下恆溫反應20-40分鐘，冷卻至室溫，離心收集上清液；對上清液進行二次熱變，溫度65℃恆溫20分鐘，恆溫期按1kg原血量加4g氯化銅，冷卻至10-15℃，離心收集上清液。。(5)、萃取將上清液傾入容器中，加入上清液體積2/5的乙醇一氯仿混合液，其中乙醇∶氯仿(V∶V)＝5∶3，攪拌幾分鐘，離心收集濾液於另一容器中，調整PH值為7.6，在攪拌的條件下，按濾液體積的43％比例加入K2HP4，再次調整PH值為7.6，再加入濾液體積1/5的乙醇一氯仿混合液，攪拌均勻後，傾入分液漏鬥中分層，收集上層清液。(6)、沉澱將上述清液傾入容器中，加入清液1倍量的冷丙酮，攪拌均勻，在4-10℃的條件下靜置5-6小時，離心收集沉澱。(7)、除菌用上述沉澱物2倍量的三氯甲烷衝洗沉澱物；(8)、透析除鹽以500ml蒸餾水加2g丙酮配製清洗液，用清洗液對沉澱物衝冼；(9)、冷凍乾燥用乾燥器在冷庫中0-4℃冷凍乾燥上述沉澱物得粗品SOD50g，比活力3000u/mg，蛋白質濃度40％。
3.根據權利要求2所述的超氧化物歧化酶的製備方法，其特徵在於以800ml純水中加200ml曲拉通X-100製得濃度為20％的曲拉通X-100溶液。
4.根據權利要求1所述的超氧化物歧化酶的製備方法，其特徵在於精品SOD的製備包括有溶解、柱層折、洗脫、透析、乾燥(1)、溶解將所得的SOD粗品溶於PH7.6、2.5μmmol/l、K2HP4-KH2PO4緩衝劑中，經超濾得澄清液。(2)、柱層折將澄清液上DEAEsepnadexA-50層析，上樣流速控制在100-200毫升/小時。(3)、洗脫上樣至飽和後，用同一緩衝劑進行梯度洗脫，控制流速為100-200毫升/小時，取樣監測具有SOD活性的蛋白峰。(4)、透析將上述所收集的SOD洗脫液，裝入透析袋中，在蒸餾水中透析除鹽，收集透析液。(5)、乾燥將透析液超濾濃縮，然後冷凍乾燥，可得外觀微帶淺藍綠色的Cu·Zn-SOD產品。
5.根據權利要求4所述的超氧化物歧化酶的製備方法，其特徵在於以等體積的K2HPO4、KH2PO4配製緩衝劑。
全文摘要
本發明公開了超氧化物歧化酶的製備方法，該製備方法採用新鮮豬血塊提取SOD，首先製備粗品SOD，然後純化粗品製備精品SOD，粗品SOD的製備過程包括有冷藏、清洗、提取、熱變、萃取、沉澱、除菌、透析除鹽、冷凍乾燥，精品SOD的製備過程包括有溶解、柱層折、洗脫、透析和乾燥，最終獲得外觀微帶淺藍綠色的CU.Zn.SOD，其酶的比活力可達3600－10000u/mg。
文檔編號C12N9/02GK1616655SQ20041004172
公開日2005年5月18日 申請日期2004年8月14日 優先權日2004年8月14日
發明者李維標 申請人:李維標