抗o型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗及其製備方法

2023-05-15 23:56:56 1

專利名稱：抗o型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和免疫學領域，尤其是涉及一種MS2介導的抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的表達和製備，構成該類病毒顆粒的蛋白分子胺基酸序列和對應的基因序列，及該類病毒顆粒的製備方法和用途。
背景技術：
口蹄疫是危害偶蹄目動物的一種急性、高度接觸性、熱性傳染病，以傳播迅速、感染性高而著稱([1]Bachrach, H. L. , Moore, D. Μ. , McKercher, P. D. &Polatnick, J. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus.The Journal of Immunologyl15,1636(1975) ； [2]Brooksby, J.Portraits of viruses foot-and-mouth disease virus.Intervirologyl8,1-23(1982) ； [3]Pereira, H.G.Foot-and-mouth disease. 333-363(1981) ； [4]Sobrino, F. et al. Foot-and-mouth disease virus -.a long known virus, but a current threat. Vet Res 32,1-30 (2001)； [5]Chen, W et al. Adenovirus-mediated RNA interference against foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in vivo.Journal of virology 80, 3551K2006)。)，國際獸疫局和世界糧農組織及我國政府都將其列為A類傳染病([1] Bachrach, H. L，Moore, D. Μ.，McKercher, P. D. & Polatnick, J. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus. The Journal of Immunology 115，1636 (1975) ；[3]Pereira，H. G. Foot-and-mouth disease. 333-363 (1981) ；[6]Wang, C. Y. et al. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine.Vaccine 20，2603—2610， doi 10. 1016/s0264-410x (02) 00148-2 (2002))。該病的每年的爆發和流行都給畜牧業帶來巨大白勺經濟損失([2]Brooksby, J. Portraits of viruses foot-and-mouth disease virus. Intervirology 18，1-23 (1982) ； [3]Pereira，H. G. Foot-and-mouth disease. 333-363 (1981) ； [4]Sobrino, F. et al. Foot-and-mouth disease virus :a long known virus, but a current threat. Vet Res 32，1-30 (2001))。疫苗免疫是控制此病， 保護家畜免受侵害的有效措施([7]Chen，W et al. RNA interference targeting VPl inhibits foot-and-mouth disease virus replication in BHK-21 cells and suckling mice. Journal of virology 78，690(^2004))。傳統的疫苗包括滅活苗和減毒苗，它們雖然具有較好的免疫原性([3]Pereira， H. G. Foot-and-mouth disease. 333-363(1981) ； [6]Wang,C. Y. et al. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine. Vaccine 20，2603—2610， doi :10. 1016/s0264-410x(02)00148-2 (2002) ； [8]Barteling, S.J.& Vreeswijk， J. Developments in foot-and-mouth disease vaccines. Vaccine 9,75-88, doi :10. 1 016/0264-410x(91)90261-4 (1991) ； [9]Shao, J. J. et al. Promising multiple—epitope recombinant vaccine against foot-and-mouth disease virus type 0 in swine. ClinVaccine Immunol 18，143-149，doi :CVI. 00236-10 [pii] 1U8/CVI. 00236-1(^2011))，也確實在口蹄疫的預防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下幾個缺點1.生產過程中操作要求嚴格，存在安全隱患。生產的安全性較差，需要對實驗室以及參加實驗的工作人員採取保護措施，保證不被致病物質汙染，保證病毒不洩漏。同時，生產過程中，病毒有可能沒有完全殺死或充分減毒，會導致疫苗中含有高毒性致病物質，進而導致被免疫動物發病而使疾病大規模流行([10]King, A. , Underwood, B. , McCahon, D. , Newman, J. & Brown, F. Biochemical identification of viruses causing the 1981 outbreaks of foot and mouth disease in the UK. Nature293，479-480 (1981))。2.有效期都很短，而且常常需要冷凍保存，這增大了疫苗在農村推廣使用的難度。3.滅活苗免疫與感染FMD的動物區分不開，限制了動物出口。4.生產依賴於FMDV，故而不能徹底地消滅FMDV。基因工程疫苗相比來說安全穩定性比較好，同時能給被免疫的動物提供有效的保護效果。但是僅僅是用抗原決定簇的表達蛋白來做疫苗，由於其分子小，結構簡單，往往並不能起到很好的免疫效果；只有將抗原決定簇與大分子物質(如脂質體或者蛋白等)一起免疫才能誘導機體產生有效的免疫反應。類病毒顆粒(VLPs)是一種在體外或(和)體內表達時能夠自主包裝成病毒外殼結構的類病毒粒子，它們是具有病毒的相似外殼結構但不具有病毒複製能力的假病毒 ([ll]Chackerian, B.，Caldeira, J. d. C.，Peabody, J. & Peabody, D. S. Peptide Epitope Identification by Affinity Selection on Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles. Journal of Molecular Biology 409，225-237，doi : 10. 1016/j. jmb. 2011. 03. 072(2011)； [12]Bundy, B. C.，Franciszkowicz, Μ. J. & Swartz, J. R. Escherichia coli based cell free synthesis of virus like particles.Biotechnology and bioengineering 100， ^-37(2008))。VLPs疫苗能有效地激發機體產生抗感染，抗腫瘤免疫，基於類病毒顆粒設計的疫苗是一種較為理想的疫苗形式([IllChackerian, B.，Caldeira, J. d. C.， Peabody, J. & Peabody, D.S.Peptide Epitope Identification by Affinity Selection on Bacteriophage MS2 Virus-Like Particles. Journal of MolecularBiology 409， 225-237，doi :10. 1016/j. jmb. 2011. 03. 072(2011) ； [13]Mastico，R. A.，Talbot，S. J. & Stockley, P.G.Multiple presentation of foreign peptides on the surface of an RNA-free spherical bacteriophage capsid. The Journal of general virology 74, Ml (1993))。前人研究發現將噬菌體MS2成熟酶蛋白及其外殼蛋白基因連接到表達載體， 在合適的條件能誘導表達出 VLPs產物([14]Peabody，D. S. et al. Immunogenic Display of Diverse Peptides on Virus-like Particles of RNA Phage MS2. Journal of Molecular Biology380，252-263，doi :10. 1016/j. jmb. 2008. 04. 049(2008)) 如果將外源基因合適的長度插入到MS2外殼蛋白基因的特定位點，將表達出外源蛋白展示在MS2類病毒顆粒表面的VLPs。將口蹄疫病毒的VPl上的抗原決定簇展示在MS2的類病毒顆粒表面以形成口蹄疫疫苗的研究未見報導。

發明內容
本發明的第一個目的在於提供一種能有效地預防口蹄疫病毒的、且安全可靠的抗 0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗及其製備方法。
5
本發明的第二個目的在於提供抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列和 DNA序列。本發明的第三個目的在於提供一種安全穩定的原核表達載體^a-CP-VPl。本發明的第四個目的在於提供抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的應用。所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗具有SEQ ID NO. 1所示的構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列，可以利用大腸桿菌表達，且能夠在大腸桿菌細胞內自主包裝為類病毒顆粒結構，以類病毒顆粒形成存在。 所述胺基酸序列包含有MS2外殼蛋白及0型口蹄疫病毒的VPl上優勢抗原決定簇序列。所述構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列是由SEQ ID NO. 2所示的 DNA序列編碼，所述DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列。所述構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列是將0型口蹄疫病毒VPl 的第141 160位優勢抗原決定簇胺基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位胺基酸後所述SEQ ID NO. 2DNA序列的第12M 1316位核苷酸為0型口蹄疫病毒的VPl 的第141 160位抗原決定簇胺基酸對應的核苷酸。一種原核表達載體^a-CP-VPl，含有包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列，或含有與包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的 DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出所述SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的DNA序列。一種能夠用於蛋白表達的宿主細胞，所述能夠用於蛋白表達的宿主細胞是所述表達載體轉化的宿主細胞，所述表達載體是含有包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列，或含有與包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的 DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出所述SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的DNA序列。所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的製備方法包括以下步驟1)將MS2的成熟酶蛋白和插入了 0型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141-160位胺基酸基因片段的外殼蛋白基因片段一起連接到pET28a表達載體中，核心序列見SEQ ID N0. 2 所示的DNA序列；2)將步驟1)的DNA序列連接於表達載體的可表達區，形成類病毒顆粒疫苗的表達載體；3)將步驟2)獲得的表達載體轉入表達宿主細胞，形成能表達類病毒顆粒疫苗的重組細胞；4)利用LB液體培養基培養重組工程菌，通過添加ITPG誘導重組細胞表達並自主包裝成類病毒顆粒結構；5)通過離心，收集經過誘導表達的重組工程菌，反覆凍融菌體，超聲波破碎菌體， 離心，上清即為含類病毒顆粒疫苗的產物。6)將步驟5)所得的含類病毒顆粒疫苗的產物上清中加入固體NaCl，冰浴，離心，所得的上清中再加入PEG8000，冰浴，離心得到類病毒顆粒沉澱，沉澱經氯仿洗滌後再經過蔗糖梯度離心得到類病毒顆粒的純化產物，即為抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗。在步驟4)中，所述培養重組工程菌，可在37 °C搖床中，以200r/min的轉速培養重組工程菌；所述ITPG可採用ImM的ITPG。在步驟5)中，所述反覆凍融菌體可反覆凍融菌體3次；所述離心的條件可為 15000r/min 離心 15min。在步驟6)中，所述加入NaCl至終濃度lmol/L ；所述冰浴的時間可為lh，所述 PEG8000的終濃度可為10%。所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗可用於與弗氏佐劑或其它免疫佐劑混合後通過肌肉注射途徑對動物進行免疫。本發明所述疫苗的結構是以類病毒顆粒形式存在，口蹄疫病毒VPl表位被有效呈遞在類病毒顆粒的表面，本發明提供了構成類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列和編碼該胺基酸序列的DNA序列。本發明所述的DNA序列含有能夠在表達中自我組裝成類病毒顆粒的外殼蛋白及成熟酶基因，且0型口蹄疫病毒的VPl的第141 160位胺基酸基因片段插入在MS2的外殼蛋白的第15位胺基酸編碼基因的後面。本發明具有以下突出優點1)本發明提供的抗0型口蹄的類病毒顆粒疫苗，免疫後可誘導動物同時產生抗0 型口蹄疫的抗體。2)該疫苗製備安全，無減毒疫苗、滅活疫苗可能引起的致病作用。3)該疫苗為類病毒顆粒結構，0型口蹄疫病毒的抗原表位被有效呈遞在類病毒顆粒的表面。因為其結構表面規則且有序，可以很好地刺激B、T細胞，引起免疫應答。4)類病毒顆粒疫苗的結構在體內血清中的半衰期長，穩定性好，有效期長，疫苗運輸儲存方便、有利於推廣使用。5)展示口蹄疫抗原決定簇的類病毒顆粒大小合適，會很好地被淋巴系統識別，產生免疫抗體。


圖1為CP-VPl基因構建示意圖。其中^a-CP模板中包括MS2的成熟酶蛋白基因、 外殼蛋白基因。引物中FMDV-I-R與FMDV-2-F都含有部分0型FMDV抗原決定簇，且相互間還有19個互補鹼基。以U-CP與FMDV-I-R為引物可以擴增出目的CP-VPl的上遊片段，以 FMDV-2-F及D-CP為引物可以擴增出目的CP-VPl的下遊片段。以擴增得到的上下遊片段等量混合物為模板，以U-CP及D-CP為引物就可以搭橋獲得目的CP-VPl基因片段。圖2為^a-CP-VPl蛋白SDS-PAGE圖。其中M為蛋白MarkerBM523，泳道1為陰性對照^a-CP的蛋白樣品，泳道2為^a-CP-VPl類病毒顆粒蛋白表達產物。與陰性對照相比較，28a-CP-VPl表達出約47KD大小的蛋白產物。圖3為電鏡下^a-CP-VPl類病毒顆粒圖片。用JEM2100透射電子顯微鏡觀察，可以發現視野中是均勻分布的白色的直徑大約為65nm類病毒顆粒顆粒。圖 4 為 ^a-CP-VPl Westernblot 結果。其中 M 為蛋白 Marker BM523,泳道 1 為陰性對照^a-CP的蛋白樣品，泳道2為^a-CP-VPl類病毒顆粒蛋白表達產物。結果顯示 28a-CP-VPl與豚鼠抗0型FMD陽性血清有特異反應。圖5為間接ELISA反應結果。在圖5中，橫坐標為蛋白質量(yg)，縱坐標為吸光度值(OD)；標記 為^a-CP-VPl ； ■為陽性對照Virus antigen ；▲為陰性對照^a-CP ；結果證實^a-CP-VPl表達產物與豚鼠抗0型FMD陽性血清有特異反應。圖6為小鼠抗血清效價ELISA檢測圖。在圖6中，橫坐標為免疫血清稀釋度，縱坐標為吸光度值(OD)；標記 為陰性對照^a-CP蛋白免疫組小鼠抗血清效價；■為陽性對照 Inactivated vaccine免疫組小鼠抗血清效價；▲為^a-CP-VPl類病毒顆粒免疫組小鼠抗血清效價；與^a-CP的蛋白樣品免疫陰性對照組相比，28a-CP-VPl類病毒顆粒蛋白能誘導小鼠產生特異性的抗體；與滅活苗免疫陽性對照組相比，28a-CP-VPl類病毒顆粒蛋白同樣能誘導小鼠產生高效價低特異性抗血清。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。1)設計兩對引物，利用OE-PCR(overlap extension PCR)技術(參見圖1)，將口蹄疫病毒的VPl上的抗原決定簇基因片段拼接於MS2外殼蛋白編碼基因的特定位點，得到如SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。2)將SEQ ID NO. 2所述的DNA序列，通過酶切連接的方法，插入到原核表達載體 pET28a的多克隆位點區，通過測序確認連接成功，讀碼框正確，得到疫苗的表達載體質粒 ^a-CP-VP 1，該載體質粒含有上述SEQ ID NO. 2所述DNA序列。3)上述重組質粒轉化到大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌。本專利所述的SEQ ID N0. 2能插入到多種類型的表達載體並在相應的宿主細胞中表達，可以構建原核表達載體在原核生物如大腸桿菌中表達，也可以構建酵母表達載體在酵母中表達，還可以構建真核表達載體在哺乳動物細胞中表達。4)將重組工程菌接種於加有卡那抗性的pET28a載體專用培養基中，振蕩培養至 OD600約0. 6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導目的基因表達(參見圖2)。離心收集誘導後的菌體細胞，反覆凍融3次，加入約1/10菌液體積的PBS緩衝液重懸菌體，超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，取上清液，經過NaCl和PEG8000沉澱後，氯仿洗脫，最後再經過蔗糖梯度離心，純化得到類病毒顆粒抗0型口蹄疫病毒疫苗。5)類病毒顆粒的電鏡觀察。取IOyL純化的類病毒顆粒疫苗樣品，加在銅網的碳膜上，經2%的磷鎢酸染色5min，自然乾燥2h。用JEM2100透射電子顯微鏡觀察類病毒顆粒疫苗顆粒。磷鎢酸染色是負染，背景為黑色，類病毒顆粒為白色(參見圖3)。6)純化後的^a-CP-VPl類病毒顆粒蛋白，經過SDS-PAGE後進行 Western-blotting及體外的ELISA實驗均發現此類病毒顆粒可以與豚鼠的抗0型FMD陽性血清發生特異反應，證明此類病毒顆粒蛋白有很好的免疫原性(參見圖4和圖5)。7)本發明所述該疫苗的應用，是指該疫苗可以單獨以每小鼠50μ g劑量與弗氏佐劑或其它免疫佐劑混合免疫小鼠，能夠誘導小鼠產生0型口蹄疫病毒的特異性抗體(參見圖6)。以下給出具體實施例
實施例1 :MS2片段與0型口蹄疫病毒抗原決定簇融合基因的獲得採用OE-PCR(overlap extensionPCR)方法進行融合基因的構建，合成以下引物U-CP 5' -CTAGCTAGCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'D-CP 5' -AAACGGATCCCAACCATCTACCATTCCCTGCC-3'FMDV-I-R 5 『 -GAGCCAACACCTGCAAATC GCCACGCAAGTTTGGCACAGC GGTACCGCCA TTGTCGACGAGAAC-3『FMDV-2-F 5' -GATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTGGCTCGTACTTTGCCAGGT ACCGGC GACGTGACT GTCGCCCC'引物中FMDV-I-R與FMDV-2-F有19鹼基互補(下劃線部分)。引物U-CP及引物 D-CP分別引入酶切位點NheI和BamHI，以便酶切片段連接入原核表達載體pET28a中。MS2可以自我組裝成類病毒顆粒的片段的獲取以U-CP及D-CP為引物，以實驗室保存的PM^為模板，擴增出MS2的外殼蛋白及成熟酶基因的核苷酸序列，命名為M-CP，預計其片段長度為1778bp，將其連接到pET28a上，命名為^a-CP ；以U-CP與FMDV-I-R為引物，以^a-CP為模板，擴增出目的序列的上半部分片段，同時以D-CP和FMDV-2-F為引物， 以^a-CP為模板擴增出目的序列的下半部分片段。擴增出的特異性片段，通過1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，分別回收；以回收片段為模板，D-CP和U-CP為引物進行第二輪擴增，預計擴增出的長度約為1850bp的片段，即是將 0型口蹄疫病毒VPl的重要抗原決定簇第141-160位胺基酸的核苷酸的序列插入到MS2的 CP蛋白基因的特定位點了，命名為CP-VP1。以上的PCR擴增均採用高保真酶進行，構建過程見圖1。實施例2 =CP-VPl融合基因的原核表達載體構建CP-VPl融合基因片段，經過雙酶切，與同樣酶切純化的原核表達載體pET28a連接，連接產物轉化DH5 α，從抗性平板上挑取的白色克隆經過酶切、測序鑑定後，正確的克隆分別命名為^a-CP-VPl。實施例3 =CP-VPl融合蛋白表達、鑑定及純化將測序正確的原核表達載體^a-CP-VPl轉化表達菌株BL21 (DE3)，鑑定為陽性的克隆接種於加有卡那抗性的LB液體培養基中，振蕩培養至0D_ = 0.6左右，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導融合基因表達。誘導條件為溫度37°C，轉速為160r/min，誘導4h。 誘導結束後離心收集菌體細胞，SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。將經過IPTG誘導表達菌體蛋白和陰性對照進行SDS-PAGE電泳(參見圖幻，電泳結束後將蛋白電轉移至尼龍膜， 分別以豚鼠抗0型口蹄疫的血清為第一抗體，以辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的羊抗豚鼠IgG 為第二抗體，進行Western blotting分析，確認表達蛋白具有0型口蹄疫病毒的抗原性(參見圖4)。有正確蛋白表達的工程菌株，大量培養，IPTG誘導蛋白表達，條件如上所述，誘導結束後離心收集菌體細胞，反覆凍融3次，加入約1/10菌液體積的PBS緩衝液重懸菌體， 超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，取上清液，然後加入NaCl至終濃度lmol/L， 冰浴lh，離心所得的上清中再加入終濃度為10%的PEG8000，冰浴，離心得到類病毒顆粒沉澱。沉澱經氯仿洗滌後再經過蔗糖梯度離心得到類病毒顆粒的純化產物。實施例4 電鏡觀察原核表達的融合蛋白分別取10 μ L純化的類病毒顆粒疫苗樣品加在銅網的碳膜上，經2%的磷鎢酸染色5min，自然乾燥池。用JEM2100透射電子顯微鏡觀察原核表達重組蛋白自主包裝成的 VLPs顆粒(圖3)。實施例5 動物免疫及抗體效價測定肌肉注射免疫首次免疫將純化的類病毒顆粒蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合 (設置商業化的口蹄疫滅活疫苗做陽性對照JSa-CP蛋白做陰性對照)，採用皮下多點注射法免疫5-6周齡雌性Balb/c，15隻小鼠隨機分為3組，每隻免疫純化蛋白量為50 μ g。每隔 2周加強一次，連續加強3次，加強免疫時純化的類病毒顆粒蛋白50 μ g與不完全弗氏佐劑混合均勻。所有免疫組均在末次免疫後1周眼眶採血處死小鼠，分離血清。免疫小鼠中採集的全血經室溫靜置池，血液完全凝固後，5000r/min離心5min，取血清分裝後置於-80°C保存備用。用ELISA檢測血清抗體的特異性，抗體效價定為能發生陽性顏色反應的血清最大稀釋倍數。ELISA板每孔包被約10 μ g的0型口蹄疫滅活病毒，4°C過夜，洗滌液洗滌5次， 用封閉液37°C封閉1 池，然後加入梯度稀釋過的待測血清，加陰性、陽性血清作為對照， 37°C溫育lh，再次洗滌後加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠的二抗，加200 μ L/孔TMB顯色底物，室溫避光30min，加入終止液終止反應，酶標儀波長450nm處測OD值，將空白孔的OD 值設為0，如OD值大於陰性對照OD值的2. 1倍，認為是陽性。測純化蛋白免疫後血清的效價為6000。SEQ ID NO. 1 胺基酸序列MASNTWDNGGTAVNRGDVAKVARTGTCDVTVASNANGVAWISSNSRSAYKVTCSVRSSANRKYTIKW KVATTVGGWAAWRSY 匪 TIIATNSDCIVKAMGKDGNISAIAANSGIYSEQ ID NO. 2 :DNA 序列GTGCGAGCTTTTAGTACCCTTGATAGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGAC GGTGAGACTGAAGATAACTCATTCTCTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGC CAAAACGAAACAGTGGCACTACCCCTCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCT ACAAGCGAAGTGGGTCATCGTGGGGTCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCC TGCTACAGCCTCTTCCCTGTAAGCCAAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGAC CGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAGGGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCAC AACTCGCGACGCAAACCATTGCGCTCGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGC TACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAAAGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTG GTTACCACTAATGAGTGATATCCAGGGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGA GAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAACATCAAGTTAGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACG TGCAACATATCGCGACGTATCGTGATATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTAT CTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGGGAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGTAACA TGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGTGGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCC ATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACGGGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAATCTCAGCCATGCA TCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCAACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATG CGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCTCTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAACTTTACTC AGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGTACCGCTGTGCCAAACTTGCGTGGCGATTTGCAGGTGTTGGCTCAGAAAGTG
10GCTCGTACTTTGCCAGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAA CATGAGGATTACCCATGTCGAAGACAACAAAGAAGTTCAACTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTC GGGATCCCATT
權利要求
1.抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗，其特徵在於具有SEQID NO. 1所示的構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列，可以利用大腸桿菌表達，且能夠在大腸桿菌細胞內自主包裝為類病毒顆粒結構，以類病毒顆粒形成存在。
2.如權利要求1所述的抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述胺基酸序列包含有MS2外殼蛋白及0型口蹄疫病毒的VPl上優勢抗原決定簇序列。
3.如權利要求1所述的抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列是由SEQ ID NO. 2所示的DNA序列編碼，所述DNA 序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列。
4.如權利要求1所述的抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述構成抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列是將0型口蹄疫病毒VPl的第141 160位優勢抗原決定簇胺基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位胺基酸後面。
5.如權利要求3所述的抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗，其特徵在於所述SEQID NO. 2DNA序列的第12M 1316位核苷酸為0型口蹄疫病毒的VPl的第141 160位抗原決定簇胺基酸對應的核苷酸。
6.一種原核表達載體^a-CP-VPl，其特徵在於含有包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列，或含有與包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出所述SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的DNA 序列。
7.—種能夠用於蛋白表達的宿主細胞，其特徵在於所述能夠用於蛋白表達的宿主細胞是所述表達載體轉化的宿主細胞，所述表達載體是含有包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列，或含有與包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和0型口蹄疫病毒的VPl上的優勢抗原決定簇基因序列的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出所述SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列的DNA 序列。
8.如權利要求1所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)將MS2的成熟酶蛋白和插入了0型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141-160位胺基酸基因片段的外殼蛋白基因片段一起連接到pET28a表達載體中，核心序列見SEQ ID NO. 2所示的DNA序列；2)將步驟1)的DNA序列連接於表達載體的可表達區，形成類病毒顆粒疫苗的表達載體；3)將步驟幻獲得的表達載體轉入表達宿主細胞，形成能表達類病毒顆粒疫苗的重組細胞；4)利用LB液體培養基培養重組工程菌，通過添加ITPG誘導重組細胞表達並自主包裝成類病毒顆粒結構；5)通過離心，收集經過誘導表達的重組工程菌，反覆凍融菌體，超聲波破碎菌體，離心， 上清即為含類病毒顆粒疫苗的產物；6)將步驟幻所得的含類病毒顆粒疫苗的產物上清中加入固體NaCl，冰浴，離心，所得的上清中再加入PEG8000，冰浴，離心得到類病毒顆粒沉澱，沉澱經氯仿洗滌後再經過蔗糖梯度離心得到類病毒顆粒的純化產物，即為抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗。
9.如權利要求8所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的製備方法，其特徵在於在步驟 4)中，所述培養重組工程菌，是在37°C搖床中，以200r/min的轉速培養重組工程菌；所述 ITPG可採用ImM的ITPG ；在步驟5)中，所述反覆凍融菌體可反覆凍融菌體3次；所述離心的條件可為15000r/min離心15min ；在步驟6)中，所述加入NaCl至終濃度lmol/L ；所述冰浴的時間可為lh，所述PEG8000的終濃度可為10%。
10.如權利要求1所述抗0型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗用於與弗氏佐劑或其它免疫佐劑混合後通過肌肉注射途徑對動物進行免疫。
全文摘要
抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗及其製備方法，涉及基因工程和免疫學領域。提供一種能有效地預防口蹄疫病毒的、且安全可靠的抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗及其製備方法，抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列和DNA序列，一種安全穩定的原核表達載體28a-CP-VP1；抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的應用。所述抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗具有SEQ ID NO.1所示的構成抗O型口蹄疫的類病毒顆粒疫苗的胺基酸序列，可以利用大腸桿菌表達，且能夠在大腸桿菌細胞內自主包裝為類病毒顆粒結構，以類病毒顆粒形成存在。所述疫苗免疫後可誘導動物同時產生抗O型口蹄疫的抗體，製備安全，無減毒疫苗、滅活疫苗可能引起的致病作用。
文檔編號A61K39/135GK102512671SQ201110424728
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者張國廣, 汪衛, 董豔美, 郭小玲, 郭遲鳴, 陳亮 申請人:廈門大學