天然來源的蛋白質及由其製備的材料的製作方法

2023-05-23 12:40:51 1

專利名稱：天然來源的蛋白質及由其製備的材料的製作方法
天然來源的蛋白質及由其製備的材料本發明涉及天然來源的蛋白質及由其製備的材料，特別是來自其的 線、纖維、泡沫和凝膠。本發明還提供這些蛋白質/線和材料用在生物技術 和/或藥物領域中，特別是用在製備傷口閉合或覆蓋系統，縫線材料和在制 備替代材料，優選地人工軟骨或腱材料，以及在其它商業應用中的應用。蜘蛛拖絲(Spider dragline)的絲具有由其作為半晶體聚合物(2)的組成 引起的特別的性質(l)，所述聚合物包含被包埋在無定形基質中的晶體區 域。X射線衍射和NMR顯示晶體區域由賦予了線以強度的聚丙氨酸序列 的e摺疊片組成(3，4)，同時無定形基質的主要二級結構是提供彈性的富含 甘氨酸的3,螺旋(5)。新鮮分泌的絲蛋白作為液體晶體粘稠物(7， 8)以高濃 度貯存(6)，其在它通過吐絲導管的過程中，通過離子組成，pH(從pH6.9 至'J6.3)的改變(9，10)和水提取(IO，U)而變化從而最終通過外延流動(12) 轉化為固體的線。至今研究的所有的拖絲的絲由至少兩種不同的蛋白質組成，所述蛋白 質具有多到數百kDa的分子量(13)。十字園蛛(」ra^w力'^fewa&力的兩種 主要的拖絲的絲蛋白，ADF-3和ADF-4對拖絲線裝配和結構的分別的作 用迄今尚未得到確定。分析一級結構揭示ADF-3和ADF-4(14,15)具有類似 的脯氨酸含量和聚丙氨酸基序，但是它們在穀氨醯胺和絲氨酸含量上以及 在富含甘氨酸的區域的長度上有所不同。重要的是，絲線的性質不能從基 礎的蛋白質序列推導出來。儘管絲線的質量基於涉及的蛋白質的一級結 構，其還取決於絲裝配的過程(8)，這使對結構和裝配性質的實驗分析成為 必要。科學和商業利益促進了蜘蛛絲的工業規模生產的研究。由於蜘蛛的同 種相殘，天然的蜘蛛絲生產是不切實際的，而人工生產在獲得足夠的蛋白 質產量和出眾的線-裝配中遇到問題。細菌的表達產生低蛋白水平(16)，這 可能是由於細菌和蜘蛛的不同的密碼子選擇導致的。具有適應於表達宿主 的密碼子選擇的合成基因導致更高的產量(13，17)，但是其合成的蛋白質顯示與天然蜘蛛絲不同的性質。部分拖絲的絲cDNAs在哺乳動物細胞系中 的表達確實產生了絲蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式紡(spin)為"絲 樣"的線，儘管在品質上仍舊很差(18)。WO03060099涉及將生物絲蛋白旋轉為纖維的方法和裝置。本發明特 別用於從水溶液中旋轉重組的絲蛋白，並增加纖維的強度和製品的實用性 從而使這些纖維的商業生產和應用是可實踐的。其中，公開了在哺乳動物 細胞，例如轉基因的山羊乳腺細胞中表達蜘蛛絲蛋白。因此，本發明的目標是提供改善的原材料，即蛋白質，用於以高產率 和優越的品質製備蜘蛛絲線，纖維和其它材料。另外的目標是提供新的蛋 白質/線和基於蜘蛛絲蛋白的另外的材料和/或其它天然衍生的材料用於生 物技術，藥物和其它的商業目的。這些目的通過獨立權利要求的主題而得以解決。優選的實施方案在從 屬權利要求中提出。關於涉及蜘蛛絲蛋白和由其衍生的線的生產的現有技術方法的缺陷， 可以使用合成真正的蜘蛛絲蛋白的不同的更有效的路徑。顯示特別的強度和韌性的蜘蛛拖絲的絲主要有兩種相關蛋白組成，其 在線裝配中的作用和對於拖絲的線的機械性質的作用大部分還是未知的。為了闡明該作用，本發明人使用杆狀病毒表達系統來在宿主昆蟲細胞 中產生重組的ADF-3和ADF-4，花園蜘蛛十字園蛛的兩種主要的拖絲的 絲蛋白。據顯示ADF-4，而不是ADF-3容易地在細胞的胞質中自我裝配 為絲。這些ADF-4的絲顯示特別的化學穩定性，其對於真正的蜘蛛拖絲的 絲線是典型的。結果，ADF-4的性質顯示其在拖絲的絲中作為結構關鍵參 與者的作用。迄今，關於蜘蛛拖絲絲線的兩種主要的蛋白質組分之間的結構，功能 和可能的相互影響知道的很少。本發明人觀察到儘管它們在一級結構上的 相似性，ADF-3和ADF-4顯示令人驚訝的不同的性質。同時ADF-3在其 本質上是可溶的蛋白，ADF-4在所用的實驗條件下實際上是不可溶的，並 在s/9細胞的細胞質中形成絲狀團聚體，其具有可與天然拖絲的線比較的 化學穩定性。在ADF-4絲和天然拖絲的絲線之間的相似性顯示ADF-4是
在拖絲的線中提供其化學和物理強度的結構"關鍵參與者"。由於線形成必須快到l-10cm/s的自然巻繞速度(19)，容易裝配的化合物，諸如ADF-4 對於絲形成是必需的。然而，ADF-4聚合的傾向顯示可能在旋轉粘稠物中 需要其它因素來避免腺體中的過早聚合。這些因素可能是翻譯後修飾諸如 磷酸化作用和糖基化作用。另外，ADF-4的溶解性可以被共分泌並且也儲 存在粘稠物的蛋白質所影響。儘管ADF-3在昆蟲細胞的胞質中不影響 ADF-4的溶解性，其仍舊可以在蜘蛛腺體分泌的過程或其後在調節ADF-4 的溶解性中起重要作用。在蜘蛛腺體細胞以及在腺體內腔中的分泌途徑中 存在的特定條件可導致在ADF-3和ADF-4之間的相互作用，其調節絲線 裝配。蜘蛛絲可以被視為未來聚合物設計的基準點，這不僅是由於它們優越 的品質，還因為它們可以以經濟的並且以與環境相容的方式在環境溫度和 環境壓力下從水性溶劑中產生而被優選。然而，主要的障礙存在於我們與 天然絲纖維生產過程匹配的能力。本文提供的結果構成闡明蜘蛛絲拖絲蛋白例如園蛛拖絲的絲的兩種主要的成分，ADF-3和ADF-4的功能和相互 作用的必要基礎。這些知識對於從重組蛋白質中旋轉絲線和生產新一代的 纖維材料是必要的。在本發明的背景中，可以使用產生來自主要的壺腹狀腺體的蜘蛛絲拖 絲蛋白的方法，這包括下列步驟a) 提供編碼一種或多種蜘蛛拖絲蛋白的核酸序列，b) 將在a)中提供的核酸序列引入昆蟲細胞中，c) 表達所述拖絲蛋白；和d) 回收所述拖絲蛋白。因此，如上提及，由該方法提供的一個主要的優勢存在於提供用於蜘 蛛絲拖絲蛋白的表達系統，即在昆蟲細胞中的表達。如上所釋，令人驚奇 地證實，那些蛋白在昆蟲細胞中的表達比在其它細胞，如，例如細菌細胞 和哺乳動物細胞中的表達優越。這種改善等價地影響品質，即機械性質等， 以及蜘蛛絲拖絲蛋白的產率。作為實例，按照參考文獻16的方法，獲得4mg/l的細胞，其不能旋 轉成線，，在參考文獻18中，獲得25 mg/l的細胞(獲得線，但是具有非常 差的品質)。通過本發明的方法，可以獲得〉30mg/l的細胞(自我裝配，穩定 的線)。優選地，由在上述方法的步驟a)中提供的核酸序列編碼的拖絲蛋白優 選地選自球-網蜘蛛(園蛛科(Araneidae))的拖絲蛋白。這樣的拖絲蛋白可以來自下列蜘蛛的一種或多種希氏尾園蛛 (Arachnura higginsi)， Araneus circulissparsus，十字園蛛，Argiope picta，條 帶園蛛(Banded Garden Spider)(三帶蜘蛛(Argiope trifasciata))，(BatikSpider) (Batik Golden Web Spider )(Nephila antipodiana)， Beccari's Tent Spider (Cyrtophora beccarii), 鳥類蛛 (Bird-dropping Spider)(Celaenia excavata),黑白棘蛛(Black-and-White Spiny Spider)(庫氏 棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑白園蛛(Black-and-yellow Garden Spider )(Argiope aurantia),流星錘蛛(Bolas Spider) (Ordgarius ftircatus)，流 星錘蛛-巨蜘蛛(Bolas Spider -Magnificent Spider) (Ordgarius magnificus),棕 色水手蛛(Brown Sailor Spider )(嗜水新園蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛 (Brown-Legged Spider )(Neoscona rufofemorata); Capped Black-Headed Spider (帆楚蛛(Zygiella calyptrata)),普通園蛛(Common Garden Spider) (Parawixia dehaani)， 普通園蛛(Common Orb Weaver ) (Neoscona oxancensis), 蟹樣棘園蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver) (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), Curved Spiny Spider (Gasteracantha arcuata),皿雲 斑蛛(Cyrtophora moluccensis)， Cyrtophora pamasia， Dolophones conifera, Dolophones turrigera， Doria's Spiny Spider (Gasteracantha doriae),雙點棘蛛 (Double-Spotted Spiny Spider) (Gasteracantha mammosa), Double-Tailed Tent Spider (方格雲斑蛛(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蛛 (Aculeperia ceropegia) ， Eriophom pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), Four-spined Jewel Spider (Gasteracantha quadrispinosa)， 園網 蛛(Garden Orb Web Spider )(Eriophora transmarina)， Giant Lichen Orbweaver (Araneus bicentenarius),金色網蛛(Golden Web Spider )(Nephila maculata)， Hasselt's棘蛛(Hasselt's Spiny Spider) (Gasteracantha hasseltii)， Tegenaria atrica， Heurodes turrita, Island Cyclosa Spider (島艾蛛(Cyclosa insulana)), Jewel or Spiny Spider (Astracantha minax)， 腎形園妹(Kidney
Garden Spider)(卵園蛛(Araneus mitificus))， Laglaise's 園蛛(Laglaise's Garden Spider) (Eriovixia laglaisei), Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa bifida), Malabar Spider (Nephilengys malabarensis)， Multi-Coloured St Andrew's Cross Spider (多色金蛛(Argiope versicolor)),觀賞性樹幹蛛 (Ornamental Tree-Trunk Spider )(裂腹蟲朱(Herennia omatissima))， Oval St. Andrew's Cross Spider (好勝金蛛(Argiope aemula))， Red Tent Spider (單色雲 斑蛛(Cyrtophora unicolor))， Russian Tent Spicier (Cyrtophora hirta)， Saint' Andrew's Cross Spider (凱氏金蛛(Argiope keyserlingi))，猩紅阿秋蛛(猩紅 阿秋蛛(Acusilas coccineus)), 銀色金蛛 (Argiope argentata)， Spinybacked Orbweaver (Gasteracantha cancriformis),斑點園蛛(Spotted Orbweaver) (Neoscona domiciliorum)， St. Andrews Cross (Argiope aetheria), St. Andrew's Cross Spider (Argiope Keyserlingi)， Tree-Stump Spider (無鱗波蛛(Poltys illepidus))， Triangular Spider (Arkys clavatus)， Triangular Spider (Arkys lancearius) ， Two-spined Spider (Poecilopachys australasia),絡新婦蛛屬(Nephila)物種，例如Nephila clavipes, Nephila senegalensis， Nephila madagascariensis和更多(對於另夕卜的蜘蛛物禾中，還見 下)。十字園蛛是最優選的。優選地，通過該方法生產的拖絲蛋白質是拖絲蛋白質野生型ADF-3, ADF-4, MaSp I，禾口/或MaSp II。術語ADF-3/-4用在由十字園蛛產生的 MaSp蛋白質的背景下(十字園蛛絲心蛋白-3/-4)。兩種蛋白質ADF-3和~4 屬於MaSp II蛋白質類(主要的壺腹狀spidroin 11)。可以通過此(即，單獨的或組合以其它蛋白質)生產的另外的蜘蛛絲 蛋白和它們的資料庫登記號是spidroin 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272主要的壺腹狀腺體拖絲絲蛋白質-1 [大腹園蛛(Araneus ventricosus)] gi|27228957主要的壺腹狀腺體拖絲絲蛋白質-2 [大腹園蛛]gi |27228959 壺腹狀spidroin 1 [Nephila madagascariensis]gi 113562006 主要的壺腹狀spidroin 1 [Nephila senegalensis]gi卩3562010
主要的壺腹狀spidroin 1 [Latrodectus geometricus]gi| 13561998 主要的壺腹狀spidroin 1 [三帶金蛛]gil13561984 主要的壺腹狀spidroin 1 [Argiope aurantia〗gi| 13561976 拖絲絲蛋白spidroin 2 [棒絡新婦蛛(Nephila clavata)]gij 16974791 主要的壺腹狀spidroin 2 [Nephila senegalensis]gi| 13562012 主要的壺腹狀spidroin 2 [Nephila madagascariensis]gi| 13562008 主要的壺腹狀spidroin 2 [Latrodectus geometricus]gi| 13562002本發明特別涉及下面的方面和實施方案按照第一個方面，本發明涉及蜘蛛拖絲蛋白質，其由SEQ ID NO: 1 或2的核酸序列，或那些核酸序列的變體編碼，所述變體每個被限定為與 SEQ ID NO: 1或2的序列比較，具有一個或多個取代，插入和/或缺失， 在所述變體在適度嚴格條件下與包含SEQ ID NO: 1或2的序列的核酸雜 交的條件下，或在所述變體包含由於遺傳密碼子的簡併性所造成的核酸變 化的條件下，其編碼與SEQ ID NO: 1或2的核酸序列相同或功能上等價 的胺基酸。
術語"核酸序列"指這些核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列。術語 "核酸"和"多核苷酸"在本文交互地使用來指核苷酸的雜聚物。
雜交的嚴格性，用於本文時，指這樣的條件下，在所述條件下，所述 多核苷酸雙鏈體是穩定的。如本領域那些技術人員已知的，雙鏈體的穩定 性是鈉離子濃度和溫度的函數(見，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory,(1989))。用於雜 交的嚴格性水平可以容易地由本領域那些技術人員來改變。
用於本文時，短語"適度嚴格條件"指這樣的條件，其容許DNA結 合於互補核酸，所述互補核酸與所述DNA具有約60%的同一性，優選地 約75%的同一性，更優選地約85%的同一性；其中與所述DNA大於約90% 的同一性是尤其優選的。優選地，適度嚴格條件是這樣的條件，其等價於 在50%甲醯胺，5 xDenhart's溶液，5 x SSPE， 0.2% SDS中於42。C進行 雜交，隨後在0.2 x SSPE, 0.2% SDS，於65'C進行洗滌。
注意到，本發明意欲兩種不同種類的ADF-3和ADF-4編碼序列:第一，ADF-3和ADF-4已經公開的序列(本文"野生型"序列)和第二，其變體， 由SEQIDNO: 1 (ADF-3)和2 (ADF-4)編碼。野生型序列已經公開並且可 以在登記號U47855和U47856(SEQ ID NO: 3和4)下獲得。二如上解釋，絲纖維具有P-摺疊的晶體區域，其間散布類似於液體晶 體聚合物的彈性無定形片段。這兩種片段由兩種不同的蛋白質，由不同的 基因編碼的MaSp I (主要的壺腹狀spidroin I)和MaSp II (主要的壺腹狀 spidroin II)代表。本發明的核酸序列優選地是ADF-3, ADF-4(SEQ ID NO: 1和2)或其變 體。SEQ ID NO: 3和4顯示野生型序列的相應的胺基酸序列。按照優選實施方案，本發明的方法提供由聚合物組成的蜘蛛絲蛋白， 其構件被限定為一個或多個如上定義的蛋白質或所述蛋白質的變體。本發 明的蛋白質的胺基酸序列還涵蓋通過胺基酸插入、缺失和置換而與本文公 開的序列不同的所有的序列。優選地，胺基酸"置換"是一種胺基酸被具有類似結構和/或化學性質 的另一種胺基酸取代，即保守性胺基酸取代的結果。胺基酸置換可以在涉 及的殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性性質的類似 性基礎上進行。例如，非極性(疏水)胺基酸包括，丙氨酸，亮氨酸，異亮 氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；極性中性胺基酸 包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬醯胺和穀氨醯胺； 帶正電荷(鹼性)胺基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸；帶負電荷(酸性) 胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。"插入"或"缺失"典型地在約1-5個胺基酸，優選地約1， 2或3 個胺基酸範圍內。胺基酸添加典型地不超過100，優選地不超過80，更優 選地不超過50，最優選的不超過20個胺基酸，其添加在本發明的蛋白質 上和/或插入其中。注意到本發明僅意欲那些的添加，其不會對本文公開的 蛋白質的機械和其它的性質具有不利影響。可以使用重組DNA技術並分析得到的重組變體的活性，通過在蛋白 質中系統性進行胺基酸的插入，缺失或置換來對容許的改變進行實驗性確 定。這不需要本領域技術人員進行超出常規的實驗。按照優選的實施方案，將上述限定的一個或多個核酸序列包含在載體
中。優選地，該載體是表達載體，其包含編碼上述定義的一個或多個拖絲 蛋白的核酸序列和一個或多個調節序列。這些調節序列可以優選地包括啟 動子p10和/或多角體蛋白，但是也可以使用其它的晚期和極晚期的杆狀病 毒啟動子。
所述載體更優選地是病毒載體，最優選地是杆狀病毒載體系統或痘苗 病毒載體系統。還可以在本發明中使用另外的病毒載體系統。根據不同的 情況，可能需要對載體進行修飾。另外的病毒載體的實例是腺病毒和所有
的負鏈RNA-病毒，例如狂犬病毒，麻瘮病毒，RSV，等。
作為昆蟲細胞，可以優選地使用鱗翅目昆蟲細胞，更優選地來自
Spod叩tera frugiperda和來自粉夜蛾(Trichoplusia ni)的細胞。最優選地，所 述昆蟲細胞是Sf9， Sf21或高效(highfive)細胞。
昆蟲細胞表達系統，例如相對於細菌系統的一個優勢在於這樣的事 實，即產生的蛋白質被糖基化，由此作為微生物降解的靶標。這種性質例 如在藥物領域，只要絲蛋白質傾向於其中需要生物降解的體內應用，可能 是是重要的。該性質可以特別應用在縫線材料和傷口閉合和覆蓋系統中。
按照另一個優選實施方案，表達的拖絲蛋白僅是由野生型ADF-4或 由SEQ ID NO: 2編碼的ADF-4。
作為備選，表達的拖絲蛋白僅是野生型ADF-3或作為拖絲蛋白的由 SEQIDNO: 1的核酸編碼的胺基酸。
本發明人令人驚奇地發現，與現有技術的概念相反，兩種已知的主要 的拖絲蛋白中只有一種(優選地ADF-4)是生產和裝配拖絲絲線所需要的。 因此，製備拖絲的絲的已知方法可以通過使用僅一種成分來製備拖絲的絲 取代用兩種成分來製備拖絲的絲，來將拖絲的絲的製備大大簡化，如本領 域已知的。因此，僅由ADF-3，並且優選地僅由ADF-4組成的拖絲的絲 是本發明的優選實施方案。
MaSpI類可以通過胺基酸脯氨酸的含量來從MaSpII中區分出來。在 MaSpII類中，不存在另外的正式的分類。然而，ADF-3和ADF-4彼此在
它們的胺基酸穀氨^y安的含量和在聚丙氨酸區域的間隔和長度中不同。因
此，本領域技術人員可以容易地確定在MaSpII中，分別對應於ADF-3和 ADF-4的區域。
優選地，所述拖絲蛋白的表達通過分泌表達發生。對於進一步的解釋， 見實施例章節。備選地，表達通過胞質生產而發生。如在實施例中顯示， 在昆蟲細胞中用於表達的條件導致令人驚訝的結果-如上提及-蜘蛛絲蛋白 以高產量和良好的品質表達，並且此外，那些蛋白質自裝配為線已經在胞 質中發生，而不需要另外的生產步驟。
在本發明的背景中，可以使用用於生產蜘蛛拖絲蛋白的方法，所述方 法包括下列步驟
a) 表達如上所限定的蜘蛛拖絲蛋白，
b) 回收所述蛋白，禾口
c) 通過適合的方法將所述蛋白旋轉(spining)為線。 在步驟c)中，可以使用本身為本領域已知的旋轉方法。例如，蜘蛛絲
蛋白的粘稠物溶液通過吐絲器擠壓形成生物絲。得到的生物絲可以牽引或 伸長。只要分子的晶體和無定形排列存在於生物絲中，牽引或伸長將施加 足以使分子定向使它們更加平行於絲壁的切應力並增加生物絲的拉伸強 度和韌性。
粘稠物溶液可以包含來自一種或多種蜘蛛物種的絲蛋白，或來自不同 產絲種屬的絲蛋白的混合物，例如來自蜘蛛和B. mori的絲蛋白的混合物。 在大多數優選的實施方案中，所述的絲蛋白是來自N.clavipes或A. diadematus的拖絲的絲，尤其是蛋白MaSpI, MaSpII， ADF-3，和ADF-4。在 備選實施方案中，粘稠物溶液包含絲蛋白和一種或多種合成聚合物或天然 或合成生物絲蛋白的混合物。
優選地，粘稠物溶液是至少1%， 5%，， 10%， 15X重量/體積(w/v)絲 蛋白。更優選地，所述粘稠物溶液是多到20%, 25%， 30%, 35%, 40%， 45%， 或50。/。w/v的絲蛋白。在優選的實施方案中，粘稠物溶液包含基本純的蜘 蛛絲蛋白。在優選的實施方案中，粘稠物具有約6.9的pH。
所謂"粘稠物溶液"指包含絲蛋白的任何液體混合物，並且易於擠壓 來形成生物絲或薄膜鑄塑。除了蛋白質單體之外，粘稠物溶液還可以包含 更高級的團聚體，其包括，例如二聚體，三聚體和四聚體。通常，粘稠物 溶液是pH 4.0-12.0的水溶液並具有少於40%的有機或離液序列高的試劑 (w/v)。優選地，所述粘稠物溶液不包含任何有機溶劑或離液序列高的試劑，
但是可以包括添加劑來增加溶液的防腐性、穩定性或可使用性。
至於"絲"，是指不確定長度的纖維，範圍在極微的長度到一英裡或
更長的長度。絲(silk)是天然的絲，而尼龍和聚酯作為合成絲的實例。
至於"生物絲"指從蛋白質產生(例如，紡)的絲，所述蛋白質包括重
組產生的蜘蛛絲蛋白。
關於怎樣紡織(spin)蜘蛛絲蛋白纖維的另外的信息可以見於
WO03060099 (Karatzas et al.)，其公開於2003年7月24日，將其併入本文
作為參考。
本發明還包括蜘蛛拖絲蛋白質或線，其包括由SEQ ID NO: 1和/或2 的核酸編碼的胺基酸序列；或其變體。
在優選的實施方案中，所述蜘蛛拖絲蛋白質/線僅包括野生型ADF-4 或由SEQ IDNO:2的核酸編碼的胺基酸作為拖絲蛋白質。
作為備選，所述蜘蛛拖絲蛋白質/線僅包括野生型ADF-3或由SEQ ID NO: 1的核酸編碼的胺基酸作為拖絲蛋白質。
按照另一個方面，本發明提供包括上述定義的蛋白質或由其組成的凝 膠或泡沫。作為怎樣產生這些泡沫和凝膠的實例可以見於實施例，見下面 的"蜘蛛絲衍生蛋白質的裝配"章節。
此外，本發明涉及用於植入物和斯滕特固定模的塗層，所述塗層包含 上述定義的本發明的蛋白質或由其組成。根據不同的用途，所述塗層可以 由可溶的蛋白質、薄膜、凝膠、泡沫、納米纖維和線製備。 一般而言，在 非生物材料諸如陶瓷、金屬、塑料等上的蛋白質塗層"隱藏"非生物表面， 預防炎症反應或身體的排斥。所述蛋白質塗層將容許細胞結合，這將封住 非生物的材料。此外，植入-相關炎症的減少可以通過選擇那些移植物材料 來實現，所述移植物材料與以前用在斯滕特固定模-植入物裝置中的那些相 比，固有地更具生物相容性。常規移植物材料諸如PET聚酯和尼龍具有高 溶解性因素，其顯示所述材料傾向於在天然脈管(vessel)中更高速率地 溶解並因此更易於發生炎症反應。
本發明的材料顯示理想的特性，其抑制在其它在斯滕特固定模-移植 物應用中常用的聚合物材料中觀察到的炎症反應。
本發明還提供線或纖維，其包括如上定義的蛋白質，線或纖維和非蜘
蛛來源的另外的材料或纖維，優選地是植物來源的材料或纖維。例如，蜘 蛛絲蛋白和棉花的混和的纖維可以是有利的。
待用的另外的纖維包括尼龍、芳族聚醯胺，芳綸，羊毛，碳纖維，膠 原蛋白纖維，纖維素，角蛋白纖維，彈性蛋白纖維，樹膠等的一種或多種。
作為另外的方面，本發明提供載體，其包含編碼作為唯一的拖絲蛋白
質的野生型ADF-4的核酸或其包含SEQ ID NO: 1禾Q/或SEQ ID NO: 2的 核酸。
在另一個方面中，提供杆狀病毒載體，其包含編碼一種或多種拖絲蛋 白質的核酸，優選地拖絲蛋白質ADF-3， ADF-4(野生型)，ADF-3(SEQID NO:l)禾口/或ADF-4(SEQIDNO:2)的核酸。
如已經在上面解釋，本文定義的蛋白質/線可以用在生物技術和/或藥 物的領域中，優選地用於製備傷口閉合或覆蓋系統，用在神經外科手術或 眼科外科手術中的縫線材料。
令人驚訝地，證實本發明的蛋白質和由其製備的纖維、線和另外的材 料顯示抗微生物，特別是抗細菌的性質。由於它們的固有的可生物降解性， 它們對於在人或動物中的體內應用具有理想的特性。因此，通過使用本發 明的蛋白質和由其衍生的材料，在外科手術中對身體的有害影響可以被最 小化，另外的外科手術可以避免並且可以加速在外科手術後的逐漸康復 (reconvalescence) 0
此外，蛋白質/線可以優選地用於製備替代材料，優選地人造軟骨或腱 材料。
另外的應用是人造替換物，優選地人造替換肺的穩定。 另外，本發明的線/纖維可以用於製備醫學裝置諸如醫學粘附帶，皮膚 移植物，替代的韌帶，和外科手術網眼；和用於製備廣泛範圍的工業和商 業產品諸如衣服織物，防彈衣襯裡，容器織物，包或錢包帶，纜，繩，粘 附性結合材料，非粘附性結合材料，皮帶材料，交通工具覆蓋物和零件， 建築材料，混凝土，顏料，聚矽氧烷，耐候性材料，柔性分割材料，運動 設備；和事實上高拉伸強度和彈性是需要的特性的纖維或織物的任何應用 中。本發明還意欲以其它形式存在的穩定的纖維產品，諸如幹的噴霧劑塗 層，珠子樣顆粒的適應性和應用，或在與其它的組合物的混合物中的使用。
除非另外指出，本文所用的所有的技術和科學術語與本發明所屬領域 的普通技術人員公知的具有相同的含義。將所有的出版物，專利申請，專 利，和其它的本文提及的參考文獻全部內容併入本文作為參考。如有衝突， 本說明書，包括定義將進行控制。此外，所述材料，方法和實施例僅是舉 例說明性的，而不傾向於限制。
現在，本發明還通過實施例和附圖進行舉例說明，所述附圖顯示如下:


圖1 (SEQ NO:l)和(SEQ NO: 2)在^ /P細胞中的表達。(A) ADF-3和ADF-4在合成後的溶解度。細胞裂解物的可溶(S)和不可溶的成 分(P)通過沉降進行分離。用抗-His6抗體通過免疫印跡法來檢測蛋白質。(B) 在"#-4表達細胞中的絲，如用光學顯微鏡(上板)和在進行免疫細胞化學後 用螢光顯微鏡(中板)觀察到的。將另一種細胞的在免疫細胞化學後的另 外的共焦螢光圖像顯示在下板中。標尺:10Pm。 (C)共合成的ADF-3和 ADF-4的溶解度。可溶(S)的細胞成分通過沉降從不可溶(P)的細胞成分中 分離出來。在蛋白質印跡後，用S-蛋白質-過氧化物酶綴合物檢測ADF-3， 並用抗-T7-標記抗體來檢測ADF-4。 (D)用me/-/^y6-^^病毒感染在混懸 液中的S/9細胞。在指定的時間(在感染後的天數)，將等價於6X10"細胞 的等分試樣取自培養基，將其進行離心來去除細胞並進行SDS-PAGE，隨 後進行免疫印跡。(E)將用附￡/-/^6-^//-4病毒感染達3天的細胞進行免疫 螢光。在細胞表面上的分泌小泡能夠被清楚地檢測到。標尺10Mm。
圖2ADF-4絲和團聚體的形態學。(A)在純化的絲上的掃描電鏡觀察。 標尺5tai(B)在純化的絲上的透射電鏡觀察。標尺:500nm(C)使用小鼠抗 -HiS6抗體，隨後用金-綴合的抗-小鼠抗體在純化的絲上的免疫電鏡觀察。 標尺:500nm(D，E)原子力顯微鏡(AFM)觀察(D)高度圖像(E)偏轉圖像。 絲的高度是0.7tai。標尺5tai。
圖3 ADF-4絲和拖絲絲線的化學穩定性。(A)如指示對ADF-4絲進行 變性。未溶解的絲和團聚體沒有進入凝膠。使用抗-HiS6抗體通過免疫印跡 法對溶解的ADF-4進行檢測。還對用6M GdmSCN進行處理的樣品進行 銀染(GdmSCN/S)。 (B)用如指示的 0.1 u 1的每種溶液將在雲母上的風乾 的ADF-4的絲和在聚丙烯上的拖絲的絲線進行溫育達30秒。用水漂洗後， 通過光學顯微鏡來檢查樣品。標尺25tai。 圖4 (A)通過光學顯微鏡來觀察在Sf9細胞中形成的沒有HiS6-標記的
ADF-4的絲。(B)在用掃描電鏡研究a,3(SEQNO: 1)禾Q ^/^(SEQNO: 2)的雙重表達後獲得的絲的形態學。(C)用光學顯微鏡來使表達 (SEQNO: l)的S/P細胞成像。(D) ADF-3的細胞定位。將被(SEQNO: l)病毒感染3天的細胞進行免疫螢光分析。(E)通過掃描電鏡觀察到的體 外復性後，ADF-4團聚體形成。(F)體外形成的ADF-4團聚體的化學穩定 性。如所示，在用變性劑處理後，通過免疫印跡法來檢測溶解的ADF-3。 標尺5Pm(B,E)和10Pm(A,C，D)。
圖5:蜘蛛絲蛋白的裝配形式。(A)通過掃描電衛SEM沐觀察的由基 於ADF-4的蛋白質形成的球體。(B)通過原子力顯微鏡觀察的由基於 ADF-4的蛋白質形成的納米纖維(高度信息)。(C， D)通過SEM研究由基 於ADF-3的蛋白質形成的微纖維(C).對於切割纖維並隨後觀察截面，使用 聚焦的Ca+離子束(D)。 (E)產生自基於ADF-3的蛋白質溶液的泡沫。(F)產 生自基於ADF-4的溶液的泡沬。(G)由ADF-4納米纖維形成的交聯的凝 膠。在圖5中描述的ADF- 3和ADF-4分別對應於SEQ ID NO: 1禾口 2。
圖6:產生自本發明的蜘蛛絲蛋白的薄膜。將ADF-3衍生的蛋白質以 20 mg/ml的濃度溶解在1，1,1，3,3,3-六氟-2-丙醇中。將200ul的溶液分散 在聚苯乙烯表面上(約20cm2)。在將溶劑蒸發後，可以得到透明的蛋白質 薄膜。
^本文提供的改善基於這樣的觀念，即同時表達和研究十字園蛛的拖絲 的絲的兩種主要的蛋白質成分。由於昆蟲屬於與蜘蛛相同的門，本發明人 選擇昆蟲細胞系Sf9(來自秋黏蟲Spodoptera frugiperda)，使用杆狀病毒作 為載體進行。#-3和的表達。產生包含a^-3和W/一的部分cDNAs
的重組杆狀病毒""。為了監測合成，提供具有HiS6-標記的兩種蛋白質。 為了排除由所述標記所導致的人工序列，還使用無HiS6-標記的形式。
將重組病毒用於感染S"細胞以在胞質中產生蜘蛛絲蛋白。3天溫育 後，通過超聲波處理來將昆蟲細胞裂解並將不可溶的細胞內容物通過沉降 從可溶的材料中分離出來。在進行免疫印跡分析之前，將所述沉降物溶解
在硫氰酸胍(GdmSCN)中。
儘管發現ADF-3的大量級分是可溶的，在所用條件(圖1A)和不存在 His6-標記(圖4A)的情況下，在感染後3天ADF-4幾乎完全不可溶。令人 驚奇的是，研究在表達a^-4(SEQNO:2)的細胞中的團聚體揭示穿過胞質 巻曲的絲，其中大多數細胞僅包含均一寬度的一條或極少的絲(圖1B)。 與此相反，用對照病毒感染的細胞或a^^(SEQNO: l)編碼的病毒從不產 生這樣的絲(圖4C， D)。使用抗His6抗體在被感染的細胞上進行的免疫熒 光顯示所述絲的特異性染色因此證實所述絲由ADF-4組成(圖1B)。
接下來，本發明人研究ADF-3和ADF-4是否可以共裝配成絲。本發 明人使用pFastbacDUAL供體質粒，產生在不同的和獨立的啟動子下，包 含"#-3(SEQNO: l)和W/-《SEQNO: 2)的重組杆狀病毒。用該病毒感染 細胞導致兩種蛋白質的合成，並且與單獨由ADF-4的合成形成的絲相 比，蛋白質絲的形成顯示相似的外觀(圖4B)。有趣的是，在雙重表達系統 中裝配的絲全部由ADF-4形成，而沒有結合或與其穩定締合的ADF-3 (圖 1C並且數據未顯示)。
為了研究表觀自裝配是否僅基於ADF-4的性質或是否涉及另外的因 素或變化，本發明人產生編碼HiS6-ADF-4的分泌形式的重組杆狀病毒。 用該病毒感染細胞導致ADF-4在細胞的培養基中的聚集(圖1D)。免疫熒 光揭示在被感染的細胞的細胞表面包含ADF-4的分泌小泡的豐度(圖1E)。 顯著地，本發明人在宿主細胞的區室和在培養基中都沒有觀察到ADF-4 絲的任何形成。
絲線的形成一般取決於蛋白質的濃度以及另外的因素。有趣的是，在 絲線裝配前，Sf9細胞的細胞內pH6.3對應於在紡絲粘稠物中的pH(19)。 在胞質環境中的ADF-4絲裝配所需要的另外的因素仍是難以捉摸的。體外 研究ADF-4的自裝配的性質強調另外的因素的重要性。通過將絲溶解在6 M GdmSCN中來容易地獲得可溶的ADF-4。在通過透析或稀釋去除 GdmSCN後，溶解的ADF-4迅速聚集。然而，體外形成的ADF-4團聚體 既沒有顯示纖維結構，也沒有顯示在S/P細胞內部形成的ADF-4絲的化學 穩定性(見下面和圖4E， F)。上述發現顯示特定的胞質環境的重要性，其 可以包括另外的，至今尚未確定的對於控制自裝配而言是重要的胞質因
素。
接下來，發明人對ADF-4絲的形態特徵進行鑑定。絲的直徑範圍在
200 nm到lnm，然而對於每條單絲，發現直徑是不變的。此外，所述絲 顯示多到100um的長度，並且經常終止於結、分支或形成閉合的環(圖 2A， D, E)。絲顯示平滑的表面並且經常與納米纖維(直徑 5nm)和其它的 蛋白質團聚體(圖2)相關。免疫印跡法和免疫電鏡顯示絲和相關的裝配形 式由ADF-4組成(圖2C, 3A)。如通過SDS-PAGE分析隨後通過銀染觀察到 的(圖3A)，除了ADF-4之外，在絲中不能檢測到其它的豐富的蛋白質。 每個細胞的少量的絲和幾乎全部的細胞內ADF-4聚集成團聚體顯示 ADF-4在S/P細胞中的自裝配可能是具核的過程，這在以前也在家蠶蛾 (Bom&x woh)的紡絲過程中被建議(26i;。
在S/P細胞中形成的絲的大小似乎被產生它們的細胞的體積限制得過 短而不能進行對於絲線而言是典型的機械力測量(21)。然而，發明人能夠 與十字圓蛛的天然的拖絲的絲線比較來分析溼和幹的ADF-4絲的化學穩 定性。已經報導拖絲的線在許多變性劑中是不可溶的(22)。應用2%的十二 烷基硫酸鈉(SDS)和8 M的尿素在30秒的暴露後，沒有對ADF-4的絲和 拖絲的線的結構產生明顯的影響(圖3並且數據未顯示)。將絲浸沒在6M 的氯化胍(GdmCl)中沒有導致ADF-4絲或拖絲的線的溶解，儘管其導致拖 絲的絲的溶脹。這種溶脹可能是由於纖維的過收縮所引起(2/)，這以前對 於將蜘蛛絲浸沒在水溶液中描述過，並且由在無定形基質中的氫鍵的再形 成所導致(27)。與上面提及的變性劑相反，小滴的6MGdmSCN在數秒內 將ADF-4絲以及拖絲的線徹底溶解(圖3)。結果，發明人得出結論，兩 種結構具有分子相互作用，其對針對特定變性劑的化學抗性負責。
方法
質粒構建
將SEQ NO: 1禾卩2的cDNAs克隆入來自Invitrogen的pFastBac 供體
質粒。將編碼肽標記的序列於5'末端提供給基因片段。對於扭56-標記的 蛋白質，利用*"/屈0/將基因從宿主載體上切下來並連接以同樣消化的 pFastBacTMHTa。對於T7-標記(23)的蛋白質，首先利用屈o/和￡coi /將基
因克隆入pET21。隨後用Bg///和lo/切除包括T7-標記編碼區的插入片 段並連接以用Sam/77/屈o/消化的pFastBacTMl 。為了共表達(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)，將兩種基因克隆入pFasBacTMDUAL並提供以編 碼T7-和S-標記(24)的序列。用6g/// /lo/將(SEQ NO: 2)從 pET21-a#-4 (SEQ NO: 2)上切下來並連接以用TWze/z^w ///裂解的 pFasBacTMDUAL。將兩種合成性寡核苷酸(MWG Biotech)進行退火以提供 S-標記編碼序列，其得到具有雖J/5謹/7/相容性單鏈延伸的雙鏈DNA:GCACATGGACAGCGGTCGG-3，(SEQ ID NO: 5)GGTTTCTTTCATCCCGGG-3，(SEQ ID NO:6)用7V/2e//5am///消化pET213(SEQ NO: l)以除去T7-標記編碼區。 隨後將載體連接以S-標記編碼DNA。利用屈o/7Xma/將S-標記的 3(SEQ NO: l)克隆入pFasBacTMDUAL-a#-4 (SEQ NO: 2)。在雙重構建 體中，^//^和^/-4在獨立的？10(25)和多角體蛋白(26)啟動子的控制之 下。利用pMIB/V5-HisA載體(Invitrogen)作為模板和包含Q o/限制酶切 位點的下列引物通過PCR擴增蜜蜂蜂毒肽的分泌信號的編碼序列用Q7o/剪切得到的PCR產物並連接入同樣消化的pFasBaCTMHTa-"#-4 (SEQ NO: 2)中。通過測序對陽性克隆檢查方向和正確性。細胞培養在BIOINSECT-l無血清昆蟲細胞培養基(Biological Industries)中於27 。C增殖s/P(5^^o/7tem^M^penfo; ATCC#: CRL-1711)細胞。將s/P細胞作 為單層培養於6孔板中的蓋玻片上或生長於80rpm振蕩的搖瓶中。包含m//-J(SEQ NO: l)和"#-4 (SEQ NO: 2)的重組杆狀病毒的生產根據生產商的方案(Invitrogen)使用包含bacmid (杆狀病毒穿梭載體質 粒)和輔助質粒的感受態大腸桿菌DHIOBAC細胞來產生重組bacmids。通
過PCR來證實基因插入bacmid 。在6孔板中用ESCORT轉染試劑 (Sigma-Aldrich)以重組bacmid DNA轉染s/P細胞。將細胞於27"溫育5h， 漂洗，並再溫育72h。收集培養基，離心，並通過斑測定法滴定包含病毒 的上清液。fl^/^和fl#-4的表達以0.1-10範圍的各種MOIs (感染複數)用重組病毒感染細胞(3 XlS細胞/ml)。感染後(PI)三天，通過於500xg離心5min收集細胞。ADF-3和ADF-4的檢測和溶解性以1.2x 17細胞/ml將細胞重懸於100 mMNaCl, 20 mM,(2-羥基乙基) 哌嗪—iV'-(2-乙磺酸)(HEPES)， pH 7.5中並通過超聲波處理進行裂解。通過 於125，000xg離心30min分離可溶的和不可溶的組分。為了進一步的分析， 將沉澱物重懸於6MGdmSCN並針對8M尿素進行透析。將源自1.5x105 細胞的上清液和沉澱物加樣在還原性條件下的10% Tris-甘氨酸聚丙烯醯 胺凝膠上並點印到PVDF膜(Millipore)上。使用小鼠抗His6單克隆抗體 (Sigma-Aldrich, 1:10,000)或小鼠抗T7單克隆抗體(Novagen, 1:10，000)和 抗小鼠IgG過氧化物酶綴合物(Sigma-Aldrich, l:5,000)作為二抗來檢測蜘 蛛絲蛋白。使用S-蛋白過氧化物酶綴合物(Novagen, 1:5,000)來直接檢測S-標記的ADF-3。免疫細胞化學用包含W/-3(SEQ NO: l)或(SEQ NO: 2)的重組病毒於MOI=10 來感染50%匯合的生長在蓋玻片上的細胞。感染後(PI)三天將細胞用甲醇 於-2(TC固定。用1: 300稀釋的小鼠抗His6單克隆抗體(Roche)溫育蓋玻片， 隨後用1: 500稀釋的德克薩斯紅綴合的抗小鼠二抗IgG來進行溫育。用 Olympus BX51螢光顯微鏡觀察細胞並用Magnafire SP相機照相或通過 共聚焦顯微鏡進行分析。ADF-4-絲純化將細胞以1.2xl7細胞/ml重懸於100 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5，並通過加入2% w/v十二垸基硫酸鈉隨後於95。C溫育5 min來進行裂 解。將線於5，000xg進行沉降隨後用8M尿素和Water bidest洗滌。原子力顯微鏡(AFM)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)將純化的絲重懸於Waterbidest中並在新裂解的雲母(AFM)上溫育3 分鐘或加載到Thermanox⑧塑料蓋玻片(Nalgene Nunc)上(SEM)。對於AFM， 用Waterbid^漂洗樣品四次並在利用Multimode SPM (Veeco)連接模式成像 之前進行風乾。對於SEM,在除去溶液後將樣品風乾，真空塗布以金層並 用JSM-5900LV (JEOL Ltd,)於20 kV上進行分析。對於TEM (JEOL Ltd.) 分析，將絲吸附到透明塑膠塗布的載網上並以乙酸雙氧鈾進行負染色。對 於免疫染色，將纖維與小鼠抗-His6抗體一起溫育，隨後用18mm金綴合的 山羊抗小鼠IgG進行標記。沒有Hi"標記的ADF-4的線形成為了排除His6標記對於絲形成的可能影響，在S 細胞中合成T7-標 記的ADF-4。T7-標記的ADF-4的絲形成顯然與His6標記的ADF-4的絲形 成沒有區別(圖4A)。在flrf/-J(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)共表達細胞中的線形成在共表達和的Sf9細胞中，與在只產生ADF-4的細胞中 形成的絲相比，可以檢測出顯示明顯無區別形態的絲(圖4B)。在Sf9細胞中W/-3(SEQ NO: l)的表達儘管免疫細胞化學揭示了在表達a^^(SEQ NO: l)的細胞中的螢光聚 焦，但並不能觀察到絲樣的結構(圖4C，D)。重要的是，在Sf9細胞中合成 的ADF-3是非常易溶的。所以聚焦形成代表了亞細胞積聚而不是蛋白質聚集。ADF-4的體外裝配
ADF-4在通過透析除去變性劑或在稀釋入水性緩衝液之後聚集。得到的團聚體並不顯示任何纖維狀的形態(圖4E)。測試化學穩定性顯示與在細 胞質中形成的ADF-4絲相反，體外形成的團聚體可溶於2%SDS或8 M 尿素(圖4F)。蜘蛛絲來源的蛋白質的裝配進行下列實驗以證明來自蜘蛛絲序列ADF-3 (SEQ ID NO:l)或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的蛋白質能夠裝配成形態不同的形式。如在B/oc&m 2004 Vol.43 pp.13604-11362 (27)中所述來在水溶液中構建、產生和製備基 於ADF-3和ADF-4的蛋白質。如果沒有另外提及，蛋白質溶液包含10mM 的Tris-(羥甲基)-氨基甲烷(Tris)pHS.O。1. 球體通過將0.8 M的硫酸銨加入0.2% (w/v)的基於ADF-4的蛋白質溶液來 產生顯示直徑範圍在0.5到2tai之間(圖5a)的蛋白質球體。2. 納米纖維通過將1% (w/v)基於ADF-4的蛋白質溶液在室溫溫育2周來形成顯 示直徑在0.7和4nm之間(圖5b)的納米纖維。3. 微纖維為了形成微纖維，將5-10W的25% (w/v)的基於ADF-3的蛋白質溶液 緩慢注射到0.5M的磷酸鉀pH8.0中，形成穩定的蛋白質溶液液滴。在溫 育1分鐘後，使用鑷子將蛋白質液滴從溶液中去除。在空氣中再溫育1分 鍾後，使用第二組鑷子可以將蛋白質纖維從蛋白質液滴中以約2cm/s的速 率從蛋白質液滴中抽提。所述纖維顯示具有4tai的直徑的圓形截面(圖 5c,d)。4 .泡沫將蛋白質泡沬(圖5e， f)產生自包含2.5 mM的過二硫酸銨(APS)， IOOWV[的tris(2，2'-二吡啶基)二氯釕(n) (Rubpy)和10% (w/v)的基於ADF-3 的蛋白質或2%0/力的基於ADF-4的蛋白質的溶液。所述蛋白質溶液用空 氣發泡。為了穩定得到的泡沫結構，將蛋白質通過暴露於來自鎢燈的可見 光達1分鐘來進行交聯(28)。隨後在95"C對泡沫進行乾燥。5. 凝膠在1。/。(w/v沐度的基於ADF-4的納米纖維(見節2)顯示凝膠樣的外觀， 其可容易地通過攪拌或剪切而被破壞。為了改善凝膠的機械性質，容許 APS和Rubpy通過擴散進入凝膠來產生10mMAPS禾B 100WVI Rubpy的終 濃度。在光誘導交聯後(見，節4)，可以獲得在尺寸上穩定的凝膠(圖5g)。6. 薄膜將ADF-3衍生的蛋白質以20 mg/ml的濃度溶解在1,1,1,3，3,3-六氟-2-丙醇中。將200iil的溶液分散在聚苯乙烯表面上(約20cm2)。在將溶劑蒸 發後，可以得到透明的蛋白質薄膜(見，圖6)。
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權利要求
1一種蜘蛛拖絲蛋白，其包含由SEQ ID NO1或2的核酸序列，或那些核酸序列的變體編碼的胺基酸，所述變體每個被限定為與SEQ ID NO1或2的序列比較，具有一個或多個取代，插入和/或缺失，在所述變體在適度嚴格條件下與包含SEQ ID NO1或2的序列的核酸雜交的條件下，或在所述變體包含由於遺傳密碼子的簡併性所造成的核酸變化的條件下，其編碼與SEQ ID NO1或2的核酸序列相同或功能上等價的胺基酸。
2. —種蜘蛛拖絲蛋白質或線，其包含權利要求l的蜘蛛拖絲蛋白。
3. 權利要求1或2的蜘蛛拖絲蛋白質/線，其僅包含野生型ADF-4或由SEQ ID NO:2的核酸編碼的胺基酸;或作為拖絲蛋白的SEQ ID NO: 4的胺基酸。
4. 權利要求1或2的蜘蛛拖絲蛋白質/線，其僅包含野生型ADF-3或由SEQ ID NO:l的核酸編碼的胺基酸;或作為拖絲蛋白的SEQ ID NO: 3的胺基酸。
5. —種凝膠或泡沫，其包含權利要求1-4中一項或多項的蛋白質或由其組 成。
6. 用於植入物和斯滕特固定模的塗層，其包含權利要求1-4中一項或多項 的蛋白質或由其組成。
7. —種線或纖維，其包含權利要求1-4中一項或多項的蛋白質/線和另外 的纖維，所述纖維不是蜘蛛來源的，並且優選地是植物來源的纖維或合成 纖維。
8. —種薄膜，其包含權利要求l-4中一項或多項的蛋白質或由其組成。
9. 傷口閉合或覆蓋系統，縫線材料，替換材料，優選地人造軟骨或腱材料， 其可使用權利要求1-4的一項或多項的線/蛋白質獲得。
10. —種載體，其包含編碼作為唯一的拖絲蛋白的野生型ADF-3禾口/或 ADF-4的核酸或包含SEQ ID NO: 1禾口/或SEQ ID NO: 2的核酸。
11. 一種杆狀病毒載體，其包含編碼一種或多種拖絲蛋白的核酸，優選地拖 絲蛋白ADF-3, ADF-4 (野生型)，ADF-3 (SEQ ID NO:l)和/或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的核酸。
12. 權利要求1-4的一項或多項的蛋白質/線在技術、生物技術和/或藥物領域的應用。
13. 權利要求1-4中一項或多項的蛋白質/線用於製備傷口閉合或覆蓋系統， 優選地用於製備縫線材料的應用，所述縫線材料更優選地傾向於用在神經 外科手術或眼外科手術中。
14. 權利要求l-4中一項或多項的蛋白質/線用於製備替換材料，優選地人 造軟骨或腱材料的應用。
15. 權利要求l-4中一項或多項的蛋白質/線用於穩定人造替換物，優選地人造替換肺的應用。
全文摘要
本發明涉及天然來源的蛋白質和由其製備的材料，特別是由其衍生的線、纖維、泡沫和凝膠。本發明還提供將這些蛋白質/線和材料用在技術、生物技術和/或藥物領域中，特別是用在製備傷口閉合系統或覆蓋系統，縫線材料中和在製備替換材料，優選地人造軟骨或腱材料以及其它的商業應用中的應用。
文檔編號D01F4/02GK101133080SQ200580024375
公開日2008年2月27日 申請日期2005年6月23日 優先權日2004年6月25日
發明者D·許梅裡希, T·沙伊貝爾 申請人:慕尼黑技術大學