一種菸草角斑病菌的分子鑑定引物及鑑定方法
2023-05-16 06:32:01 1
一種菸草角斑病菌的分子鑑定引物及鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了一種菸草角斑病菌的分子鑑定引物及鑑定方法。該菸草角斑病菌的分子鑑定引物如序列表SEQIDNO:1至SEQIDNO:2所示，其中，序列SEQIDNO:1為鑑定菸草角斑病菌的上遊引物，序列SEQIDNO:2為鑑定菸草角斑病菌的下遊引物。本發明所述菸草角斑病菌分子鑑定引物可以特異性鑑定菸草角斑病病菌。此外，本發明還提供了可靠、特異性強、靈敏度高的菸草角斑病菌快速分子鑑定的方法。
【專利說明】一種菸草角斑病菌的分子鑑定引物及鑑定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種菸草角斑病菌的分子鑑定引物及鑑定方法，屬於植物病菌檢測領 域。
【背景技術】
[0002] 菸草是我國重要的經濟作物之一。菸草角斑病（Pseudomonas syringae pv.angulata)是菸草主要的細菌性病害，在我國北方煙區發生嚴重，每年均造成一定程度 的危害和經濟損失。
[0003] 傳統細菌的分類鑑定主要是基於形態學特徵、致病性測定、生理生化特性等，工作 繁瑣，時間長，鑑定時還易受人為及環境等諸多因素的幹擾，而且不能直接從植物組織中檢 測出病原菌，難以滿足病害控制中快速、靈敏、穩定的檢測要求，很容易錯過病害防治的最 佳時期，而免疫血清學鑑定方法特異性較差，常常受到抗血清質量的影響，容易造成假陽 性，因此這些方法的應用均受到一定的限制。目前，我國官方機構進行細菌鑑定過程中主要 採用傳統的分類學鑑定以及生物學鑑定（16S rRNA序列測定分析）相結合的方式，鑑定時 間至少需要1個月以上，對於農業生產過程中所面臨的需要及時快速鑑定的病原菌，這些 方法存在明顯的不足。隨著生物技術在病害鑑定方面開發應用及病菌DNA數據在基因庫中 的不斷積累，使分子生物學方法鑑定細菌種類技術日趨完善和成熟。建立細菌的PCR特異 鑑定引物，利用細菌分離培養技術及PCR技術，可以在（1-2) d內對初期侵染的細菌進行鑑 定，從而指導菸農及時準確用藥，對保障我國菸葉生產具有重要的意義。
[0004] 對於菸草角斑病的分子鑑定方法，河南農業大學的蔣世君等2010年申請了中國 專利CN 101206193"快速檢測和鑑定菸草野火病菌和角斑病菌的方法"，該方法涉及的角斑 病菌的PCR鑑定引物設計於hrpZ基因，且同時擴增出菸草野火病菌，也就是說不能有效區 分野火病和角斑病或者其它丁香假單孢菌。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有技術中菸草角斑病菌的生物學檢測方法特異性差、靈敏 度低、周期長、血清學鑑定方法成本高並易造成假陽性等問題，提供菸草角斑病菌特異分子 鑑定引物以及可靠、特異性強、靈敏度高的菸草角斑病菌快速分子鑑定的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明採用以下技術方案：
[0007] 基於菸草角斑病的AvrPphE基因區域設計合成了菸草角斑病菌特異的PCR鑑定引 物，該引物可以特異鑑別菸草角斑病菌，菸草野火病菌、其它的丁香假單孢菌及菸草葉面分 離的其它細菌分離物均擴增不出特異的條帶。
[0008] 具體地，一組菸草角斑病菌的分子鑑定引物，如下：
【權利要求】
1. 一組菸草角斑病菌的分子鑑定引物，其特徵在於，該引物如序列表SEQ ID NO :1至 SEQ ID NO :2所示，其中，序列SEQ ID NO: 1為鑑定菸草角斑病菌的上遊引物，序列SEQ ID NO :2為鑑定菸草角斑病菌的下遊引物。
2. -種菸草角斑病菌的鑑定方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟： (1) 菸草角斑病菌分離培養； (2) PCR擴增；其中，PCR擴增時的引物為序列SEQ ID NO :1所示的用於鑑定菸草角斑 病菌的上遊引物，序列SEQ ID NO :2所示的用於鑑定菸草角斑病菌的下遊引物； (3) PCR擴增產物分離及結果判別。
3. 根據權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於，菸草角斑病菌分離培養的具體步驟 為：用滅菌的剪刀將菸草角斑病疑似病葉病斑剪下，消毒後置於LB固體培養基中25°C培養 2-3天，收集病斑周圍長出的細菌菌落於無菌的LB液體培養基中，混勻後，吸取菌液塗LB固 體平板，25°C培養2-3天，挑取單菌落於LB液體培養基中，25°C培養，用於PCR檢測，或者直 接用滅菌牙籤蘸取單菌落用於PCR檢測。
4. 根據權利要求2所述的鑑定方法，其特徵在於，PCR擴增產物分離及結果判別的具體 步驟為：將PCR擴增產物用1. 5%瓊脂糖電泳分離，於紫外分析儀中根據擴增產物的大小判 定結果。
【文檔編號】C12Q1/04GK104212896SQ201410445480
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】萬秀清, 喬嬋, 李若, 李麗傑, 王春軍, 元野, 賀國強, 顏培強, 李尊強, 郭思達, 孫宏偉, 焦玉生, 李恆全, 邱恩建, 劉德育, 陳榮平, 黃磊, 張海霞, 劉偉, 魏繼承 申請人:中國菸草總公司黑龍江省公司牡丹江菸草科學研究所