從紅牛膝中分離純化皂苷類成分的方法與流程

2023-05-06 03:34:52 1

本發明涉及天然藥物化學，具體涉及從紅牛膝中分離純化皂苷類成分的方法。

背景技術：

紅牛膝，為四川涼山彝族自治州、雲南楚雄彝族自治州、貴州等彝族地區的彝醫臨床常用藥材，在涼山彝族自治州，稱為勒死補你或乃死補你為莧科植物頭花杯莧cyathulacapitata(wall.)moq.的根，用於治療跌打損傷、風溼、類風溼等疾病。

國內外對牛膝類藥材的研究主要集中在中醫臨床上常用的牛膝achyranthesbidentatablume與川牛膝cyathulaofficinaliskuan；紅牛膝的相關研究較少。紅牛膝作為四川涼山彝族自治州、雲南楚雄彝族自治州、貴川等彝族地區的彝醫臨床常用藥材，目前對紅牛膝成分的研究報導較少。

技術實現要素：

本發明提供了從紅牛膝中分離純化皂苷類成分的方法，所述皂苷類成分如下之一所示：

化合物ⅲ：r1＝h，化合物ⅳ：化合物ⅴ：

該方法包括如下操作：

(1)取紅牛膝，以含水或不含水的醇類溶劑提取，提取液濃縮至無醇味，以正丁醇萃取，取正丁醇部位上矽膠柱，依次用如下配比的三氯甲烷:甲醇:水下相梯度洗脫：15:1:0.2、10:1:0.2、8:1:0.2、6:1:0.2、3:1:0.2、2:1:0.2，薄層追蹤，合併相同組分，並對合併的相同組份按順序編號；

(2)分別取第3、4或5組份，上矽膠柱，依次用如下配比的三氯甲烷:甲醇:水下相梯度洗脫：(6～4):1:0.2、3:1:0.2、2:1:0.2，薄層追蹤，合併相同組分，上葡聚糖凝膠柱，甲醇：水(30～50):(70～50)洗脫，分別得化合物ⅲ、iv或v。

進一步地，步驟(2)中，取洗脫得到的第3組份上矽膠柱，依次用如下配比的三氯甲烷:甲醇:水下相梯度洗脫：6:1:0.2、3:1:0.2、2:1:0.2，薄層追蹤，合併相同組分，上葡聚糖凝膠柱，甲醇：水50:50洗脫，得化合物ⅲ。

進一步地，步驟(2)中，取洗脫得到的第4組份上矽膠柱，依次用如下配比的三氯甲烷:甲醇:水下相梯度洗脫：6:1:0.2、3:1:0.2、2:1:0.2，薄層追蹤，合併相同組分，上葡聚糖凝膠柱，甲醇：水50:50洗脫，得化合物ⅳ。

進一步地，步驟(2)中，取洗脫得到的第5組份上矽膠柱，依次用如下配比的三氯甲烷:甲醇:水下相梯度洗脫：4:1:0.2、3:1:0.2、2:1:0.2，薄層追蹤，合併相同組分，上葡聚糖凝膠柱，甲醇：水30:70洗脫，得化合物。

其中，所述醇類溶劑選自甲醇或乙醇；所述含水醇類溶劑中醇類溶劑的濃度為60～85％v/v。

本發明一個具體實施方式中，所述含水醇類溶劑中醇類溶劑的濃度為70～80％v/v。

其中，採用薄層追蹤時，以硫酸乙醇溶液為顯色劑。

本發明中，正丁醇萃取前，可以參照系統溶劑法進行逐級萃取，如本發明一個具體實施方式中，依次使用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯進行萃取。

上述方法可以從紅牛膝中分離得到齊墩果酸皂苷類成分，可以保證較高的純度，為紅牛膝的深入研究鑑定了一定的物質基礎。

發明人在對紅牛膝的化學成分進行分離純化過程中，發現了多種齊墩果酸類皂苷成分，其中就包括3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸、3-o-(β-d-吡喃葡萄糖醛酸)-齊墩果酸28-o-β-d-吡喃葡萄糖苷、3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸-28-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。經藥理研究及臨床驗證表明，齊墩果酸皂苷類成分具有保肝護肝、調節免疫、抗炎、抑菌、抗病毒、延緩衰老、防治心血管疾病等作用[1-4]，在藥品及保健品的開發中具有廣闊的應用前景。

另外，目前還沒有見使用具體化學成分對紅牛膝的質量進行控制的報導，本發明分離的齊墩果酸類皂苷在一定程度上與紅牛膝的藥效相關，或可以作為對紅牛膝質量檢測的物質基礎。

其中，經過uplc檢測發現，3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸-28-o-(β-d-吡喃葡萄糖)在各批次藥材中的含量波動較小。以此成分來作為檢測紅牛膝的指標成分，不僅可以從一定程度上反應藥效，還可以使得檢測結果更加穩定，重現性好。

本發明中所述的「提取」，是指採用天然藥物領域內常用的提取手段，例如煎煮、回流、超聲、微波輔助提取、浸漬、滲淥等方法中的一種或多種的組合。

本發明中所述的「濃縮至無醇味」，是指採用天然藥物領域中常用的濃縮方法，使溶劑中的醇揮發完全或接近完全，濃縮後，剩餘物在進一步的操作中不會受到醇類溶劑的影響或者影響不大。常用的濃縮手段有減壓濃縮、低溫加熱揮發、薄膜濃縮等。

本發明所述「以正丁醇萃取」，是指在操作過程中同時存在正丁醇和水這兩種溶劑，且兩者需要分層。具體操作過程中，如果濃縮液含有足夠的水，則可直接加入正丁醇進行處理，加水並非是必須步驟；如果濃縮液不含水或含水量太少，則需要加入正丁醇和適量水進行脫脂處理。

採用正丁醇萃取時，由於水和正丁醇在一定比例內互溶，為避免萃取時目標成分的過量損失，本領域一般情況下都使用水飽和正丁醇。

本發明採用常規過柱方法，預先等分收集一定較小體積的洗脫液，以薄層色譜進行點板追蹤，將具有相同成分的洗脫液進行組合，再濃縮後做進一步純化的準備。

在洗脫過程中，洗脫液的用量與柱直徑、高度等尺寸有關，洗脫液的用量多少隨著不同柱尺寸變化而適應性改變，這一改變可以通過薄層監測進行簡單的調整。

另外，每一種梯度使用的洗脫液用量，也可以根據薄層監測上的斑點變化來進行調整。

本發明一個具體實施方式中，一種洗脫液的用量比值大約是15:1:0.2，1體積份；10:1:0.2，1體積份；8:1:0.2，2體積份；6:1:0.2，2體積份；3:1:0.2，4體積份；2:1:0.2，5體積份。

分離化合物ⅲ使用的洗脫液的用量比值大約是6:1:0.2，2體積份；3:1:0.2，6體積份；2:1:0.2，12體積份。

分離化合物iv使用的洗脫液的用量比值大約是6:1:0.2，2體積份；3:1:0.2，8體積份；2:1:0.2，15體積份。

分離化合物v使用的洗脫液的用量比值大約是4:1:0.2，4體積份；3:1:0.2，15體積份；2:1:0.2，20體積份。

附圖說明

圖1化合物ⅲ1hnmr圖(meod-d4)

圖2化合物ⅲ13cnmr圖(meod-d4)

圖3化合物ⅳ1hnmr圖(meod-d4)

圖4化合物ⅳ13cnmr圖(meod-d4)

圖5化合物ⅴ1hnmr圖(meod-d4)

圖6化合物ⅴ13cnmr圖(meod-d4)

圖7空白對照(a)、混合對照品(b)和樣品(c)uplc圖，1：hnx-5，2：hnx-3

具體實施方式

實施例1

為了進一步明確彝藥紅牛膝中的化學成分、有效成分、獲得對照品，建立紅牛膝藥材及其成方製劑的質量標準，闡明紅牛膝藥理藥效的物質基礎，本實施例對紅牛膝藥材的化學成分進行了比較系統的研究。

1儀器與材料

1.1儀器

watersacquityuplch-classsystem型超高效液相色譜儀(美國waters公司)；mettlerae240電子分析天平(梅特勒-託利多(上海)儀器有限公司)；kq-250b型超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)；ikarv10旋轉蒸發器(德國ika公司)；shb-ⅲ循環水式真空泵(鞏義市英峪華科儀器廠)；數顯恆溫水浴鍋hh-2(國華電器有限公司)。

1.2材料與試劑

紅牛膝，紅牛膝藥材採自四川省涼山彝族自治州會理縣六華鄉大坪村，經西南民族大學劉圓教授鑑定為莧科植物頭花杯莧cyathulacapitata(wall.)moq.的根。矽膠g板(中國青島海洋化工集團公司)；柱層析矽膠(100-200目；200-300目；青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠lh-20填料(日本三菱化工有限公司)；三氯甲烷、甲醇、甲酸、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇、硫酸等為分析純；水為蒸餾水。

2試驗方法

2.1藥材的提取、分離

取紅牛膝藥材(過2號篩)1000g，按液料比20:1加入體積分數為80％乙醇，90℃條件下提取3次，每次60min，趁熱過濾，合併濾液，濾液減壓濃縮至無醇味後，加蒸餾水約500ml使溶解，水相依次用石油醚(60-90℃，500ml×3)、三氯甲烷(500ml×3)乙酸乙酯(500ml×5)和正丁醇萃取(500ml×5)，減壓回收溶劑後得乙酸乙酯部分4.2g，正丁醇部分35.0g。

乙酸乙酯部分(4.2g)用少量甲醇溶解，加矽膠(5g，100-200目)拌勻，幹法裝柱，抽實。乙酸乙酯:石油醚(0-100％)為洗脫劑梯度洗脫，tlc檢測，合併相同組分，減壓濃縮得化合物ⅰ(50mg)。

正丁醇部分(10g)用少量甲醇溶解，加矽膠(20g，100-200目)拌勻，幹法裝柱，抽實。依次用三氯甲烷:甲醇:水(15:1:0.2，1l；10:1:0.2，1l；8:1:0.2，2l；6:1:0.2，2l；3:1:0.2，4l；2:1:0.2，5l)下相梯度洗脫，每25ml一份，tlc檢測，5﹪濃硫酸乙醇為顯色劑，合併相同組分，並對合併的相同組份進行編號(可以從「1」開始)，分別減壓濃縮得組分1、2、3、4、5。取組分2經反覆矽膠柱層析(三氯甲烷:甲醇:水＝10:1:0.1)得化合物ⅱ(42mg)。取組分3用少量甲醇溶解，加適量矽膠(200-300目)拌勻上矽膠柱，用三氯甲烷:甲醇:水(6:1:0.2，200ml；3:1:0.2，600ml；2:1:0.2，1.2l)下相梯度洗脫，tlc檢測，合併相同組分，減壓濃縮，上葡聚糖凝膠柱，甲醇-水(50:50)洗脫，得化合物ⅲ(89mg)，組分4上矽膠柱，用三氯甲烷:甲醇:水(6:1:0.2，200ml；3:1:0.2，800ml；2:1:0.2，1.5l)下相梯度洗脫，tlc檢測，合併相同組分，減壓濃縮，上葡聚糖凝膠柱，甲醇-水(50:50)洗脫，得化合物ⅳ(38mg)，組分5上矽膠柱，用三氯甲烷:甲醇:水(4:1:0.2，400ml；3:1:0.2，1.5l；2:1:0.2，2l)下相梯度洗脫，tlc檢測，合併相同組分，減壓濃縮，上葡聚糖凝膠柱，甲醇-水(30:70)洗脫，得化合物ⅴ(105mg)。

2.2結構鑑定

化合物ⅰ：白色片狀結晶，與β-谷甾醇對照品分別點於同一薄層板，在三種不同溶劑系統中rf值和顯色均一致，混合後熔點不降低，確定化合物ⅰ為β-谷甾醇，附圖2。

化合物ⅲ：白色粉末狀結晶，水溶液振搖後產生持久性泡沫，libermann-burchard反應呈陽性，經酸水解，薄層色譜鑑別，苷元為齊墩果酸。esi-ms(m/z)777.3056[m-h]-，給出分子式c42h66o13，表明分子中苷元連有2個糖基，碎片離子：631.2922[m-h-146]-，455.2480[m-h-146-176]-，推測分子中連有鼠李糖和葡萄糖醛酸，13c-nmr譜中δ123.69，145.20為烯碳特徵信號，δ181.90為羧基碳信號，hnmr(meod-d4)譜中δ1.15(1h，s)、1.04(1h，s)、0.94(1h，s)、0.93(1h，s)、0.90(1h，s)、0.83(1h，s)、0.80(1h，s)，δ5.23(1h，t)，為齊墩果酸結構片段，13c-nmr顯示兩個糖端基信號，譜中δ102.63和106.67ppm信號，確定了糖的構型，鼠李糖為α-l-型，葡萄糖醛酸為β-d-型，91.04ppm信號表明苷元3位與葡萄糖醛酸連接，83.67ppm信號表明鼠李糖連接在葡萄糖醛酸的3位上。將化合物ⅲ的光譜數據與文獻[5]比較，基本一致，鑑定化合物3為3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸。

化合物ⅳ：白色粉末狀結晶，水溶液振搖後產生持久性泡沫，libermann-burchard反應呈陽性，經酸水解，薄層色譜鑑別，苷元為齊墩果酸。esi-ms(m/z)793.36[m-h]-，給出分子式c42h66o14，表明分子中苷元連有2個糖基，與化合物ⅲ相比，分子中多一個氧原子，推測分子中連有葡萄糖和葡萄糖醛酸，13c-nmr譜中δ123.86，144.85為烯碳特徵信號，δ178.07為羧基碳信號，hnmr(meod-d4)譜中δ1.17(1h，s)、1.07(1h，s)、0.97(1h，s)、0.95(1h，s)、0.93(1h，s)、0.86(1h，s)、0.81(1h，s)，δ5.27(1h，t)，為齊墩果酸結構片段，13c-nmr顯示兩個糖端基信號，譜中δ95.72、和106.98ppm信號，確定了糖的構型，葡萄糖與葡萄糖醛酸均為β-d型，δ95.72ppm信號表明苷元28位與葡萄糖連接，91.09ppm信號表明苷元3位與葡萄糖醛酸連接。將化合物5的光譜數據與文獻[6]比較，基本一致，鑑定化合物ⅳ為3-o-(β-d-吡喃葡萄糖醛酸)-齊墩果酸28-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。

化合物ⅴ：白色粉末狀結晶，水溶液振搖後產生持久性泡沫，libermann-burchard反應呈陽性，經酸水解，薄層色譜鑑別，苷元為齊墩果酸。esi-ms(m/z)939.2986[m-h]-，給出分子式c48h76o18，表明分子中苷元連有3個糖基，碎片離子：777.3056[m-h-162]-，455.2480[m-h-162-146-176]-，推測分子中連有葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸，13c-nmr譜中δ123.69，145.20為烯碳特徵信號，δ181.90為羧基碳信號，hnmr(meod-d4)譜中δ1.15(1h，s)、1.04(1h，s)、0.94(1h，s)、0.93(1h，s)、0.90(1h，s)、0.83(1h，s)、0.80(1h，s)，δ5.23(1h，t)，為齊墩果酸結構片段，13c-nmr顯示三個糖端基信號，譜中δ95.74、102.63和106.67ppm信號，確定了糖的構型，鼠李糖為α-l-型，葡萄糖與葡萄糖醛酸為β-d-型，δ95.74ppm信號表明苷元28位與葡萄糖連接，90.90ppm信號表明苷元3位與葡萄糖醛酸連接，83.54ppm信號表明鼠李糖連接在葡萄糖醛酸的3位上。將化合物ⅴ的光譜數據與文獻[6]比較，基本一致，鑑定化合物5為3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸-28-o-β-d-吡喃葡萄糖苷。

化合物ⅲ：r1＝h，

化合物ⅳ：

化合物ⅴ：

化合物ⅲ、ⅳ和ⅴ的化學結構

表1皂苷元的碳核磁共振化學位移值(meod-d4)

表2皂苷中糖部分的碳核磁共振化學位移值(meod-d4)

表3皂苷中皂苷元和糖的部分氫核磁共振化學位移值(meod-d4)

3小結

對紅牛膝中的化學成分進行研究，分離得到5個化合物，鑑定其中4個，分別為β-谷甾醇(ⅰ)，3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸(ⅲ)，3-o-(β-d-吡喃葡萄糖醛酸)-齊墩果酸-28-o-(β-d-吡喃葡萄糖)(ⅳ)和3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸-28-o-(β-d-吡喃葡萄糖)(ⅴ)，以上4個化合物均為首次在該植物中分離得到。

試驗過程中發現：紅牛膝中含有大量皂苷類成分，皂苷類成分極性較大，分離困難，乙酸乙酯-甲酸-水洗脫體系可取得較好分離效果，但濃縮過程中會出現較多雜質點，可能因酸性較強致化合物分解，最終選擇三氯甲烷:甲醇:水體系進行洗脫。

實施例2

儀器與材料

1.1儀器

watersacquityuplch-classsystem型超高效液相色譜儀(美國waters公司)；mettlerae240電子分析天平(梅特勒-託利多(上海)儀器有限公司)；ikarv10旋轉蒸發器(德國ika公司)；kq-250b型超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)；shb-ⅲ循環水式真空泵(鞏義市英峪華科儀器廠)；數顯恆溫水浴鍋hh-2(國華電器有限公司)。

1.2材料與試劑

藥材來源見表4，經西南民族大學劉圓教授鑑定為莧科植物頭花杯莧cyathulacapitata(wall.)moq.的乾燥根，憑證標本保存於西南民族大學民族醫藥研究院標本室；對照品3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸(簡稱hnx-3)和3-o-[α-l-吡喃鼠李糖(1→3)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸]-齊墩果酸-28-o-(β-d-吡喃葡萄糖)(簡稱hnx-5)，為實驗室自製，經核磁和質譜鑑定，採用面積歸一化法計算，純度96％和95％；乙腈(色譜純，美國sigma公司)，磷酸(色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司)，石油醚、乙醇、正丁醇等為國產分析純，市售；蒸餾水，實驗室自製。

表4紅牛膝藥材來源

2試驗方法

2.1色譜條件和系統適應性試驗

2.1.1流動相的選擇

色譜柱：acquityuplchssc18(2.1×50mm，1.7μm)；流動相組成：乙腈-0.1％磷酸水，線性梯度洗脫，洗脫程序見表5；流速：0.2ml.min-1；檢測波長：210nm；進樣量：1μl；柱溫：40℃。

表5梯度洗脫程序

2.1.2適應性選擇

分別精密吸取混合對照品、供試品溶液進樣。在上述色譜條件下，混合對照品溶液和樣品溶液各成分均可與相鄰組分分離，滿足含量測定要求，uplc色譜圖見圖7。

2.2對照品溶液的製備

分別取hnx-3和hnx-5適量，精密稱定，用甲醇作溶劑配製成濃度分別為1.005、1.010mg.ml-1的對照品母液，備用。

2.3標準曲線的繪製

分別精密吸取皂苷的對照品母液，用甲醇稀釋、定容，得系列質量濃度的對照品溶液，取上述溶液1μl注入超高效液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(y)對進樣量(x，μg)進行線性回歸，得回歸方程：hnx-3：y1＝1e+06x+9739.6(r2＝0.9997)，hnx-5：y2＝984877x-1995.7(r2＝0.9999)，質量濃度依次在0.1005～1.206mg/ml、0.101～1.212mg/ml範圍內與峰面積線性關係良好。

2.4供試品溶液的製備

精密稱取紅牛膝根粉末(過2號篩)1.0g，加入80％乙醇(v/v)20ml，加熱回流1h，濾過，濾液濃縮至無醇味，加水30ml，石油醚(30ml)脫脂後正丁醇萃取(30ml×2)，減壓濃縮除去正丁醇，殘渣加甲醇定容於25ml容量瓶內，即得供試品溶液，備用。

3結果與分析

3.1精密度試驗

取混合對照品溶液，按照「2.1」項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積並計算rsd值得：hnx-3為0.39％、hnx-5為0.93％，表明儀器精密度良好。

3.2重複性試驗

稱取紅牛膝根粉末6份，按供試品的製備方法和選定的色譜條件測定樣品，計算皂苷成分的含量。結果其含量分別為hnx-3和hnx-5平均值分別為9.70、21.68mg.g-1，rsd值依次為2.18％、1.94％，表明方法重複性良好。

3.3穩定性試驗

取同一紅牛膝樣品溶液，室溫放置，分別於0、2、4、6、8、12h按選定色譜條件進行測定，計算皂苷類成分含量，其rsd值分別為化合物1.27％、1.68％，表明樣品在12h內穩定。

3.4加樣回收率試驗

稱取已知含量紅牛膝根粉末6份，每份0.25g，分別精密加入質量分數為已知含量樣品中hnx-3和hnx-5含量的80％、100％、120％對照品，按供試品溶液製備方法製備，按選定色譜條件測定，計算回收率，結果見表6。

表6加樣回收率試驗

3.5不同批次紅牛膝藥材含量測定

分別稱取不同批次紅牛膝根樣品粉末各1.0g，按照「2.3」項下方法製備供試品溶液，「2.1」項下色譜條件測定，記錄峰面積，根據回歸方程計算含量。測定結果見表7。

表7紅牛膝樣品中兩種皂苷含量(mg·g-1)

4小結

(1)試驗中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1磷酸水等流動相體系對紅牛膝皂苷類成分的洗脫效果，結果乙腈-0.1磷酸水洗脫效果最好，各成分均可達到基線分離，皂苷類成分紫外吸收較弱，波長選在210nm處，各成分均有較強吸收，且雜質幹擾較小，最終選擇210nm為本次試驗檢測波長，本試驗建立的檢測方法簡單、快速、重複性好，可以用於紅牛膝藥材中皂苷類成分的檢測。

(2)皂苷類成分具有抗炎、鎮痛、抗氧化等藥理活性，是彝藥材紅牛膝中主要藥效成分之一，本試驗首次採用uplc法對彝藥紅牛膝中皂苷類成分進行含量測定，目前對於紅牛膝藥材化學成分研究較少，暫無可用對照品。自製的hnx-3和hnx-5含量均在95％以上，可用於含量測定。

(3)測定6批樣品中，hnx-3含量差異較大，最低為2.09mg·g-1，最高為9.45mg·g-1，平均含量為5.02mg·g-1；兩種皂苷總和前5批樣品差異不大。s1-s5樣品中hnx-5的含量較為接近，該成分在藥材中含量均衡，因此，hnx-5能很好的反應紅牛膝藥材中總皂苷的含量，將hnx-5作為紅牛膝藥材皂苷類成分的質量控制指標，除樣品s6外，hnx-5含量均較高，最低為17.55mg·g-1(s5)，最高達到26.25mg(s2)，平均含量為20.34mg·g-1，鑑於本次試驗樣品批次較少，紅牛膝藥材中hnx-5含量暫定不低於10mg·g-1(1.0％)為合格。

引用文獻信息：

[1]李金亭，胡正海.牛膝類藥材的生物學與化學成分的研究進展[j].中草藥，2006，37(6)：952-956.

[2]孟大利，李銑.中藥牛膝化學成分和藥理活性的研究進展[j].中國藥物化學雜誌，2001，11(2)：120-124.

[3]廖彭瑩，王東，楊崇仁，張穎君.莧科牛膝資源植物的化學成分研究進展[j].中草藥，2013，44(14):2019-2026.

[4]王菊平，吳曉東，宋獻美.牛膝總皂苷對過氧化氫致人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用研究[j].亞太傳統醫藥，2016，12(2)：10-12.

[5]周容.川牛膝及西南風車子的化學成分研究[d].中國科學院成都有機化學研究所，2004.

[6]王曉娟，朱玲珍.牛膝皂甙的化學成分研究[j].第四軍醫大學學報，1996，17(6)：32-35.