一種植物組培外植體抗褐化消毒劑的製作方法
2023-05-17 15:22:46 1
一種植物組培外植體抗褐化消毒劑的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種植物組培外植體抗褐化消毒劑，屬於農林領域的植物組織培養技術。包括以還原性殺菌劑代替常規的氯化汞或次氯酸鈉進行外植體表面消毒的方法。組培外植體經流水衝洗後，乙醇溶液瞬間消毒，然後分別以四羥甲基硫酸磷和2-苄基-4-氯苯酚溶液先後浸泡外植體。較之傳統的外植體消毒劑，本發明採用的還原性殺菌劑高效廣譜，對植物細胞作用溫和，對外植體消毒同時抑制褐化，提高外植體預處理效率，降低組培外植體死亡率，操作簡便，對人安全，環境友好，便於推廣應用。
【專利說明】一種植物組培外植體抗褐化消毒劑
【技術領域】
[0001]本發明屬農林領域的植物組織培養技術，具體涉及組培外植體消毒與抗褐化方法。
技術背景
[0002]植物組織培養技術種苗生產、脫除病毒、種質改良等具有廣闊的市場前景。目前植物組織培養技術環節還存在不少問題，外植體汙染的防治是組織培養成功的主要難點。常規的外植體消毒方法是先用70%酒精浸泡10-30S，以無菌水衝洗2-3次，0.1%氯化汞浸8-12min或用2%次氯酸鈉(飽和次氯酸韓溶液)浸泡15_20min。氯化萊雖然消毒效果好，但常溫下微量揮發，可滲透皮膚，對人毒性極強，致死量為0.05克，對環境危害大，2013年10月中國籤署《水俁汞汙染防治公約》，汞製劑的生產應用將更加嚴厲控制。次氯酸鈉(鈣)放出活性氯離子從而殺死菌體，消毒效果較氯化汞差，產生的氯氣對人體刺激大，有毒，次氯酸鈉溶液氧化性很強，對植物材料有較大的破壞致死作用。此外，使用抗生素消毒，殺菌範圍窄，抗生素溶液需過濾除菌，植物易產生抗藥性，也易引起材料生理變異。
[0003]目前組培外植體消毒仍然首選氯化汞和次氯酸鈉。不含汞或次氯酸鈉(鈣)的外植體消毒劑專利《苔蘚植物作為植物外植體消毒劑的用途、及該消毒劑組合物及其製備方法和使用方法》(公布號:101632392)，消毒劑成分為苔蘚植物提取液，還包括滲透劑、穩定劑和助溶劑，但消毒劑原材料並不普及，提取程序繁瑣，成本高，可能將限制該發明的廣泛推廣應用。專利《外植體的表面滅菌方法》(公布號:101461329)用酒精、溴水前後消毒外植體，溴水對植物有較強 氧化損傷，消毒效果一般，並非首選消毒劑。而其他關於外植體消毒劑專利仍使用氯化汞或次氯酸鈉，如公布號1628507A、101138317A、102326514A、101946809A。
[0004]外植體褐化也是組織培養成功的三大障礙之一，克服外植體褐化的方法主要有:(1)選擇適當的外植體採集季節和部位。(2)抗氧化劑浸泡外植體。(3)培養基添加抗氧化劑、抗氧化酶活性促進劑和酚類(色素)物質吸附劑。(4)培養物多次轉移到新鮮培養基。其中(2)和(3)普遍採用的抗氧化劑主要有抗壞血酸、半胱氨酸、檸檬酸、亞硫酸鹽。增強植物外植體內抗氧化酶活性的物質油菜素內酯，酚類(色素)物質吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮或活性炭。如專利公布號CN103250645A、CN102986534、CN102986533、CN103004754A、CN102805032A、CN102823490A、CN102577953A、CN103125380A、CN102318560A、CN102860255A、CN102115727A。
[0005]較有特色的抑制褐化專利有:公布號CN103202233A《一種蝴蝶蘭防褐化組培方法及防褐化培養基》在初代培養和增殖分化培養中將金盞花、檸檬、西紅柿、迷迭香等提取液添加到相應的培養基中。CN103004602A《一種抑制山核桃外植體褐化的方法》兒茶素應用到培養基中。CN102870677A《一種促進互葉白千層叢生芽增殖及防止繼代培養褐化的方法》培養基應用稀土化合物包括鑭、鈰、釹、鐠、釤的硝酸鹽和氧化物。CN101148653《抑制蘭屬植物組織培養褐變發生的方法》將外植體消毒後用赤黴素和/生長素浸泡，誘導不定芽在培養基加入6-BA，4-PU或TDZ.CN1737142《一種防止植物愈傷組織褐化現象產生的方法》在繼代培養基添加多胺(精胺或亞精胺)，黑暗培養，培養瓶定期氣體交換。CN1742564《一種牡丹組培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法》採用的MS培養基取1 / 2-1 / 3微量元素，Ca2+加倍，CaCl2與CaNO3的摩爾比為1:1。
[0006]目前植物組培外置體消毒首選氯化汞或次氯酸鈉(鈣)，對外植體有較大毒副作用，對人體有毒，危害環境，外植體消毒殺菌和抗褐化是分步進行的，效率低下。急需研發殺菌廣譜高效，對植物藥害小，對人體安全，環境友好，操作方便，價格便宜的新型消毒劑。
【發明內容】
[0007]本發明解決的是目前植物組織培養外植體消毒劑對人體有毒，嚴重汙染環境及對植物培養物傷害大的技術問題。由於還原性物質對植物細胞作用溫和，損傷小，還能抑制外植體切口酚類物質被氧化成有毒物質(醌類)，從而保護植物細胞，所以採用還原性高效殺菌劑具有對組培外植體消毒的同時抑制褐化，提高成活率的雙重功效。本發明公布了抗褐化消毒劑的成分、配製方法和使用方法。
[0008]一種植物組培外植體抗褐化消毒劑及消毒方法，其特徵在於，所採用的抗褐化消毒劑四羥甲基硫酸磷(THPS)，分子式[P(CH20H)4]2S04，能較快殺滅病原(細)菌，為環保型室內空氣消毒、水處理殺菌劑，而且其具有較強的還原性，在環境中能很快地被氧化成毒性極低的ΤΗΡ0，可直接排放(張靜，黃種買.一種新型環境友好殺生劑-四羥甲基硫酸磷.工業水處理，2004,24(11):13-15 ;智建輝，湯斌，李莉芳等.四羥甲基硫酸膦的室內空氣消毒效果與毒性.環境與健康雜誌，2007,24(3):156-158 ;楊文忠，綠色水處理化學品.精細與專用化學品2007.15(23):17-19;揚巍編譯.新型環境友好殺菌劑四羥甲基硫酸鱗(THPS).磷酸鹽工業，2003 (2) 10-7)。
[0009]本發明公布的另一抗褐化消毒劑2-苄基-4-氯苯酚，C13H11C10，酚類消毒劑，還原性強，對真菌、細菌有較好滅殺作用，可用作農藥、醫藥中間體。是美國環保署通告允許可用於與食品接觸表面清潔劑的組分，也是美國FDA批准可用於食品加工機械和容器消毒的組分，環境友好，在水中降解性達到94%以上(韓海軍，焦家俊.2-苄基-4-氯-苯酚的合成工藝研究.甘肅石油和化工，2006 (2):15-18 ;馬忠華，張佳燕，聶進.三氟甲基磺酸鋅催化選擇性合成2-苄基-4-氯苯酚.應用化學，2010，27 (3):304-307)。
[0010]本發明提供的技術方案如下:
[0011]所述的抗褐化消毒 劑四羥甲基硫酸磷直接溶解於水，配成濃度0.5-1.0%水溶液。2-苄基-4-氯苯酚溶解於無水乙醇和吐溫-20，與乙醇、吐溫-20重量(g)體積(ml)比為1:3: 5，然後溶解於水，2-苄基-4-氯苯酚使用濃度0.5%。
[0012]本發明提供的技術方案還包括消毒劑組合應用於外植體消毒的使用方法。常規方法取得外植體，經流水衝洗後，75%乙醇液浸泡10-60秒，經本發明的四羥甲基硫酸磷浸泡60-90分鐘，期間多次攪拌或震蕩，無菌水漂洗3次，2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡30-60分鐘，期間多次攪拌或震蕩，無需無菌水漂洗，使殘留在外植體的藥劑可繼續發揮作用，只用濾紙吸乾外植體表面溶液，就可常規接種。
[0013]本發明的有益效果在於:以還原性高效殺菌劑浸泡外植體，對真菌、細菌有較快殺滅作用，可降低外植體汙染率，也可降低褐化率，提高成活率，該藥劑使用濃度下無氣味，對人體無害，環境友好，成本低廉，適宜在植物組織培養【技術領域】推廣。
【具體實施方式】
[0014]實施例一
[0015]蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)葉切塊流水30衝洗分鐘以上，75%乙醇30秒鐘,無菌水洗滌2次，分別用以下方法浸泡消毒(I) 2%次氯酸鈉浸泡30分鐘，無菌水漂洗3次。
(2)0.1 %氯化汞浸泡8分鐘，無菌水漂洗5次。(3)0.5%四羥甲基硫酸磷溶液浸泡60分鐘，無菌水漂洗3次後，0.5%的2-苄基-4-氯苯酚溶液浸泡30分鐘，無需無菌水漂洗，濾紙吸乾表面溶液，直接接種。培養基成分I / 2MS+6-BA5mg/L+NAA0.2mg/L+椰子汁20% (V /V)。每瓶接種6個外植體，每次5瓶，重複3次。接種後在25°C、15001ux光下培養，光照12h / d。
[0016]蝴蝶蘭外植體培養29天後，以本發明消毒劑和0.1 %氯化汞消毒汙染率最低，都為0，次氯酸鈉消毒的有少量汙染。本發明消毒劑處理的褐化率比次氯酸鈉消毒的低，比用氯化汞低很多，見表1，所以本發明消毒劑在蝴蝶蘭葉片消毒有應用優勢，是適宜消毒劑。
[0017]表1蝴蝶蘭葉切塊外植體各消毒方法效果觀察*
【權利要求】
1.一種植物組培外植體抗褐化消毒劑，其特徵在於:採用還原性殺菌劑浸泡消毒外植體。
2.如權利要求1所述的外植體消毒劑，其特徵在於:所述的還原性消毒劑為四羥甲基硫酸鱗和2-苄基-4-氯苯酚。
3.如權利要求2所述的消毒劑，其特徵在於:所 述的四羥甲基硫酸磷直接溶解於水，2-苄基-4-氯苯酚溶解於無水乙醇和吐溫-20，2-苄基-4-氯苯酚與乙醇、吐溫-20重量(g)體積(ml)比為1: 3: 5，然後溶解於水。
4.如權利要求2所述的消毒劑，其特徵在於:四羥甲基硫酸磷濃度0.5-1.0%，浸泡時間60-90分鐘，期間多次攪拌或震蕩。2-苄基-4-氯苯酚濃度0.5%，浸泡時間30-60分鐘，期間多次攪拌或震蕩。
5.如權利要求4所述的消毒劑，外植體經四羥甲基硫酸磷浸泡，無菌水洗滌2遍，再經2-苄基-4-氯苯酚浸泡，取出用無菌紙吸乾殘留溶液，直接接種。
【文檔編號】A01H4/00GK103891713SQ201410113999
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月14日 優先權日:2014年3月14日
【發明者】劉福平 申請人:福建省亞熱帶植物研究所