牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法

2023-05-17 19:53:51 1

專利名稱：牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法
技術領域：
本發明涉及牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。
背景技術：
乳鐵蛋白(Lf lactoferrin)是一種鐵結合性的糖蛋白，存在於大多數哺乳動物的乳汁、唾液、胰液、眼淚和汗液等幾乎所有外分泌物中，但含量甚微。而牛初乳(即奶牛產犢後1-7天內分泌的乳)中含有大量的乳鐵蛋白，它在增強機體免疫能力，調節機體生理狀態平衡，改善胃腸功能，抗菌抗病毒等方面起著重要作用。基於它的多種功能，人們不斷探索各種提取方法。自Sorensen等人最早在動物乳中發現了乳鐵蛋白以來，人們相繼開發出多種乳鐵蛋白的分離方法。
其中，主要方法是通過離心脫脂，等電點沉降酪蛋白，鹽析去除雜蛋白後，層析純化乳鐵蛋白。根據不同原理，層析主要可分為疏水間相互作用、離子交換層析、親和層析三種，而要獲得符合醫藥和實驗室要求的高純度乳鐵蛋白則需用親和層析純化。研究不同原料、不同分離純化技術及不斷提高得率對乳鐵蛋白分離純化技術改進提高具有重要理論和技術意義。

發明內容
本發明旨在為了獲得符合醫藥和實驗室要求的高純度乳鐵蛋白，提供一種改進的牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。
實現上述目的的具體技術解決方案如下牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，包括獲取脫脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、親和層析、收集高離子強度峰蛋白、透析和凍幹；其特徵在於取透析6小時後的上清液，上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，用含0～1摩爾的氯化鈉(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩爾磷酸鉀緩衝液以40毫升～180毫升/小時(40～180ml/h)速度線性洗脫。
本發明的整體工藝路線與傳統的實驗室分離方法相同，但是在關鍵工藝親和層析獲取高純度乳鐵蛋白過程中進行了條件篩選、優化，確定使用肝素-瓊脂糖(Heparin-sepharoseCL-6B)樹脂親和層析柱從牛初乳中分離提純乳鐵蛋白時，利用內含0～1摩爾氯化鈉(0～1M NaCl)pH6.5～8.5 0.05～0.005M磷酸鉀緩衝液洗脫得率比報導中內含0.05～1摩爾氯化鈉(0.05～1M NaCl)pH7.4 5mM巴比妥鈉—鹽酸緩衝液(巴比妥鈉-HCl緩衝液)高15％以上。
本發明首次採用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharose CL-6B)樹脂親和層析柱從牛的初乳中分離提純高純度的乳鐵蛋白，經檢測純度在90％以上；通過不同緩衝液的對照，找到一種比報導所用緩衝液具有更高得率的緩衝液系統；建立了使用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)親和層析從牛初乳中分離提取乳鐵蛋白的最佳技術條件。
與傳統意義上的親和層析比較，肝素-瓊脂糖(Heparin-seharose CL-6B)無須進行特異性配體固定，使用方便、廣泛；另外現有技術主要是從奶酪乳清中提純乳鐵蛋白，而牛初乳中乳鐵蛋白的含量比奶酪乳清中高，且由於初乳和奶酪乳清的理化特性不同，本發明建立了用肝素-瓊脂糖(Heparin-seharoseCL-6B)樹脂親和層析柱從初乳中分離提純的技術參數。
本發明在國外分離提純乳鐵蛋白的同類方法中，對緩衝液這一重要的技術參數進行摸索，得到了效果更好的磷酸鉀緩衝液體系，在獲得高純度乳鐵蛋白(純度在90％以上)的基礎上進一步提高得率(得率提高15％以上)。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步地說明。
牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝路線如下獲取脫脂乳→去除酪蛋白→去除球蛋白→透析→親和層析→收集高離子強度峰蛋白→透析→凍幹實施例1取產後24小時內的荷斯坦奶牛初乳，在4℃下4000g離心30分鐘脫脂後；用2摩爾鹽酸(2M HCl)調pH至4.6，4℃下4000g離心30分鐘去除酪蛋白；用2摩爾氫氧化鈉(2M NaOH)調pH至6.8，按42％飽和度加入硫酸氨((NH4)2SO4)，室溫下作用3小時，2000g離心20分鐘去球蛋白；取上清液透析6小時後上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，在蠕動泵推動下，用含0～1摩爾氯化鈉(0～1M NaCl)的pH6.5、0.05摩爾磷酸鉀緩衝液以150毫升/小時速度線性洗脫；由設置好的自動部分收集器收集，紫外檢測儀檢測，記錄儀記錄不同收集管內的蛋白峰曲線；收集高離子強度峰蛋白，透析後凍幹。
肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱是利用肝素(一種多聚陰離子的蛋白聚糖)作為配基，通過糖苷鍵與一些結構糖蛋白結合，利用不同離子強度的緩衝液洗脫來分離結合強度不同的蛋白質。
親和層析操作如下將肝素—瓊脂糖乾粉用去離子水溶脹8小時，抽濾去除氣體；用不含氯化鈉的磷酸鉀緩衝液浸泡後，裝入玻璃純化柱內，平衡8小時；將透析後的樣品上柱。
實施例2其洗脫工藝條件為pH7.0 0.01摩爾磷酸鉀緩衝液(內含0～0.5摩爾氯化鈉)以50毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例3其洗脫工藝條件為pH7.4 0.01摩爾磷酸鉀緩衝液(內含0.1～0.6摩爾氯化鈉)以180毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例4其洗脫工藝條件為pH7.7 0.005摩爾磷酸鉀緩衝液(內含0.05～0.7摩爾氯化鈉)以120毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
實施例5其洗脫工藝條件為pH8.0 0.005摩爾磷酸鉀緩衝液(內含0.2～0.6摩爾氯化鈉)以90毫升/小時速度洗脫；其它操作工藝方法同實施例1。
權利要求
1.牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，包括獲取脫脂乳、去除酪蛋白、去除球蛋白、透析、親和層析、收集高離子強度峰蛋白、透析和凍幹；其特徵在於取透析6小時後的上清液，上樣至平衡過的肝素—瓊脂糖(Heparin-Sepharose CL-6B)親和層析柱，用含0～1摩爾的氯化鈉(0～1M NaCl)、其pH6.5～8.5、0.05～0.005摩爾磷酸鉀緩衝液以40毫升～180毫升/小時(40～180ml/h)速度線性洗脫。
2.根據權利要求1所述的牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法，其特徵在於所述的親和層析操作方法是，將肝素—瓊脂糖乾粉用去離子水溶脹8～12小時，抽濾去除氣體；用不含氯化鈉的磷酸鉀緩衝液浸泡後，裝入玻璃純化柱內，平衡8～12小時。
全文摘要
本發明涉及牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法。其特點是關鍵工藝確定使用肝素－瓊脂糖(Heparin－sepharose CL－6B)樹脂親和層析柱從牛初乳中分離提純乳鐵蛋白，同時採用磷酸鉀緩衝液洗脫。本發明的分離提純方法可實現獲得純度在90％以上的提取物，採用磷酸鉀緩衝液，在獲得高純度乳鐵蛋白(純度在90％以上)的基礎上進一步提高得率，得率比報導的巴比妥鈉—鹽酸緩衝液高15％以上。
文檔編號C07K14/435GK1486989SQ03152940
公開日2004年4月7日 申請日期2003年8月21日 優先權日2003年8月21日
發明者王志耕, 葉震敏 申請人:安徽農業大學