一種製備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法與流程
2023-04-30 23:00:21 1
本發明屬於鐵皮石斛加工領域，具體涉及一種製備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法。
背景技術：
鐵皮石斛是蘭科石斛屬氣生蘭科的名貴藥用草本植物，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳、延年益壽等功效及增強免疫力、抗氧化、降血糖、降血脂、防癌抗癌等神奇的功效。鐵皮石斛的傳統加工仍以石斛鮮條、鐵皮楓鬥、石斛超微粉等粗放型為主。我國鐵皮石斛精深加工業的發展速度相當緩慢，且缺乏技術的深度創新，已難以適應現代鐵皮石斛種植業的發展。因此，如何推動鐵皮石斛精深加工業發展是目前亟待解決的關鍵問題之一。石斛莖中含有多種生物鹼、多糖、胺基酸及澱粉等。石斛多糖屬於活性多糖的一種，具有抗炎、抗病毒、修復自身提高免疫力的功效，一直被選作鐵皮石斛深加工研究的主要對象，包括多糖的提取、結構分離及活性功能評價等，而將鐵皮石斛多糖降解成為小分子低聚糖的研究較少。眾所周知，低聚糖也具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖及提高免疫力等功效，且有研究證實某些特殊結構的低聚糖功能性強於活性多糖，而且專一性更高、可吸收性更好等特點。因此，藉助鐵皮石斛中重要的活性多糖成分製備小分子低聚糖，是提升鐵皮石斛多糖應用層次的新思路，有望推動鐵皮石斛精深加工業發展，具有現實意義。
技術實現要素：
針對上述問題，本發明提供了一種製備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法。本發明通過酶解法製備了鐵皮石斛低聚糖，提高了鐵皮石斛的抗氧化活性。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種製備具有體外抗氧化活性的鐵皮石斛低聚糖的方法，所述方法利用酶直接酶解鐵皮石斛製備鐵皮石斛低聚糖。
所述方法包括以下步驟：
磨粉：將鐵皮石斛鮮條放置於烘箱中烘乾後用萬能粉碎機破碎，並過60目分離篩得鐵皮石斛乾粉備用；
溶解：將鐵皮石斛乾粉溶解在磷酸鹽緩衝液中得鐵皮石斛乾粉液，濃度為g/ml；
限制性酶解：向鐵皮石斛乾粉液中加入一定量酶製劑酶解一段時間後得酶解液；
滅酶：將酶解液100～150℃滅菌時間4～10min，使剩餘酶製劑失去活性；
過濾：將滅酶後的酶解液5000～10000rpm離心5～10min取上清液；
濃縮：將上清液濃縮10-100倍得鐵皮石斛低聚糖。
所述酶解中，酶為β-甘露聚糖酶與纖維素酶復配的複合酶，β-甘露聚糖酶與纖維素酶的配比為2:1，複合酶添加量為12u/ml，酶解溫度為40℃，酶解ph值為6.0，酶解時間為8h。
所述方法製備得到的鐵皮石斛低聚糖的dpph清除率可達23.7％，總抗氧化活性可達0.65u/ml。
所述方法製備得到的鐵皮石斛低聚糖是以低聚甘露糖為主的低聚糖混合物。
所述酶選自甘露聚糖酶、纖維素酶、纖維二糖酶、葡聚糖酶、木聚糖酶中的至少一種。
所述酶解中，酶的添加量為1u/ml-20u/ml。
所述酶解中，酶解ph值為5.0-8.0。
所述酶解中，酶解溫度控制為30℃-50℃。
所述酶解中，酶解時間控制為1h-24h。
本發明的有益技術效果：本發明方法製備了鐵皮石斛低聚糖，該方法簡單，可實施行強，製備得到的鐵皮石斛低聚糖的dpph清除率可達23.7％，總抗氧化活性可達0.65u/ml。
附圖說明
圖1、不同加酶量對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響；
圖2、不同初始ph對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響；
圖3、酶解溫度對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響；
圖4、不同培養時間對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細描述。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用於解釋本發明，並不用於限定本發明。
相反，本發明涵蓋任何由權利要求定義的在本發明的精髓和範圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進一步，為了使公眾對本發明有更好的了解，在下文對本發明的細節描述中，詳盡描述了一些特定的細節部分。對本領域技術人員來說沒有這些細節部分的描述也可以完全理解本發明。
實施例1
將鐵皮石斛鮮條放置於烘箱中烘乾後用萬能粉碎機將其破碎並過60目分離篩備用。
取1g鐵皮石斛乾粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩衝液中混勻，添加12u/ml的酶製劑進行酶解，酶解溫度為40℃，酶解時間為8h，酶解後將樣品放置於沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產物留取上清液，將上清液濃縮至1ml，最後測定各樣品的體外抗氧化活性。
其中，磷酸鹽緩衝液的ph為6.0；酶製劑為β-甘露聚糖酶與纖維素酶的複合物，配比為2:1。
在上述條件下酶解之後，所得結果如下：
在上述酶解條件下所得的酶解鐵皮石斛產物的dpph清除率可達23.7％，總抗氧化活性為0.65u/ml。
鐵皮石斛水解物多糖主要測定體外抗氧化活性，包括dpph自由基清除率和總抗氧化活力等。具體方法如下：
dpph自由基清除率的測定：取500μl的低聚糖混合液加入500μldpph無水乙醇溶液(0.2mg/ml)後，混合振蕩，黑暗中放置30min後以蒸餾水為空白溶液，517nm處測定吸光度值b1；以無水乙醇代替dpph乙醇溶液進行實驗，測定樣品溶液本底的吸光度值b2；以蒸餾水代替樣品溶液進行實驗，測定空白對照溶液的吸光度值b0。計算公式為：dpph自由基清除率(％)＝(b1-b2)/b0*100。
參照總抗氧化能力(t-aoc)測定試劑盒中的操作方法：向離心管中依次加入試劑一0.5ml，低聚糖混合液0.5ml，試劑二應用液1ml，試劑三應用液0.25ml後，用渦旋振蕩器充分混勻，37℃水浴30min，取出加入0.05ml的試劑四混勻，放置10min，用雙蒸水調零，于波長520nm處測定各管吸光度值。對照組中，不同濃度的低聚糖混合液在水浴後加入，加入量不變，其它溶液的加入順序不變。計算公式如下：總抗氧化能力(單位/毫升)＝(od測定值-od對照值)/0.01/30*反應液總量/取樣量/樣本測試前稀釋倍數。
實施例2
將鐵皮石斛鮮條放置於烘箱中烘乾後用萬能粉碎機將其破碎並過60目分離篩備用。
取1g鐵皮石斛乾粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩衝液中混勻，添加5u/ml的酶製劑進行酶解，酶解溫度為30℃，酶解時間為12h，酶解後將樣品放置於沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產物留取上清液，將上清液濃縮至1ml，最後測定各樣品的體外抗氧化活性。
其中，磷酸鹽緩衝液的ph為7.0；酶製劑為單一β-甘露聚糖酶。
在上述條件下酶解之後，所得結果如下：
在上述酶解條件下所得的酶解鐵皮石斛產物的dpph清除率可達15.6％，總抗氧化活性為0.32u/ml。
實施例3
將鐵皮石斛鮮條放置於烘箱中烘乾後用萬能粉碎機將其破碎並過60目分離篩備用。取1g鐵皮石斛乾粉置100ml錐形瓶中，加入50ml的磷酸鹽緩衝液中混勻，添加一定量的酶製劑進行酶解，酶解溫度為30℃，酶解時間為12h，酶解後將樣品放置於沸水中蒸煮5min以滅酶活，離心酶解產物留取上清液，將上清液濃縮置1ml左右即可。
分別選取不同酶水解鐵皮石斛並測定了其酶解產物體外抗氧化活性，結果如表1所示。
表1、不同種類酶對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響
結果表明，選用的幾種酶均能直接水解鐵皮石斛，水解產物均具備體外抗氧化活性，其中以甘露聚糖酶的作用最為顯著，其次為纖維素酶的水解產物。自由基的清除率分別為15.6％和11.2％，總抗氧化活力分別為0.32u/ml和0.28u/ml。甘露聚糖酶及纖維素酶主要被用來水解以甘露糖及葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的聚糖類物質。多糖是鐵皮石斛中最為主要的功能活性成分之一，很多鐵皮石斛品種中的多糖是由甘露糖及葡萄糖為主的單糖連接而成，以此當選擇甘露聚糖酶和纖維素酶為水解酶時鐵皮石斛水解產物最多。
實施例4
分別選取不同酶水解鐵皮石斛並測定了其酶解產物體外抗氧化活性，結果如表2所示。酶選用不同比例的甘露聚糖酶和纖維素酶。酶解過程中酶解溫度為30℃，酶解ph值為7.0，酶解時間為12h。
表2、酶的不同比例對鐵皮石斛水解產物抗氧化活性的影響
實施例5
不同酶的添加量的體外抗氧化活性如圖1所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的複合酶(配比為2:1)，酶解溫度為30℃，酶解ph值為7.0，酶解時間為12h。
當加酶量增加時水解產物的自由基清除率及總抗氧化活力均不斷提高，添加至12u/ml時效果最好，此時自由基清除率為20.5％，總抗氧化活力為0.54u/ml。
實施例6
不同酶解過程ph對體外抗氧化活性如圖2所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的複合酶(配比為2:1)，酶解溫度為30℃，酶添加量為12u/ml，酶解時間為12h。
結果顯示不同ph值對酶解反應的影響不同，隨著ph的增高，鐵皮石斛酶解產物的抗氧化活性呈現先增高再降低的趨勢。當ph升高至6.0時活性最高，自由基清除率為21.5％，總抗氧化活力為0.56u/ml。當ph過低或過高時都會直接影響水解產物的生成，制約其抗氧化活性的高低，在不合適的ph條件下水解酶的活性不穩定，出現失活情況，影響了酶解反應的正常作用。
實施例7
不同酶解溫度對體外抗氧化活性如圖3所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的複合酶(配比為2:1)，酶解ph為6.0，酶添加量為12u/ml，酶解時間為12h。
溫度對鐵皮石斛酶解反應的影響很大，過低的溫度限制了酶的反應速率，降低了水解的效率，而過高的反應溫度又導致作用酶出現失活現象，使酶促反應停止。
實施例8
不同酶解時間對體外抗氧化活性如圖4所示。選用的酶為甘露聚糖酶與纖維素酶的複合酶(配比為2:1)，酶解ph為6.0，酶添加量為12u/ml，酶解溫度為40℃。
隨著反應時間的延長，鐵皮石斛水解產物的抗氧化活性逐漸提高，反應至8h後趨於穩定，再進一步延長水解時間也不能顯著提高抗氧化活性。當水解至8h時自由基清除率為23.7％，總抗氧化活力為0.65u/ml。說明鐵皮石斛能夠在以上條件下被直接水解，且水解產物具備明顯的體外抗氧化功能。