一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法
2023-05-01 05:30:01 2
專利名稱：一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養的方法，特別是涉及一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法。
背景技術：
對人工培養細胞來說， 一般要求在培養液中含有5%-20%的血清，血清主要作用包括提 供基本營養物質；提供激素和各種生長因子；提供結合蛋白；提供促接觸和伸展因子使細 胞貼壁免受機械損傷；對培養中的細胞起到某些保護作用。但是使用血清培養細胞也存在 以下缺點(1)對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損 傷癒合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常 狀態，血清可能促進某些細胞的生長(成纖維細胞)同時抑制另一類細胞生長(表皮細胞)； (2)血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反 應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響 細胞生長，甚至造成細胞死亡；(3)動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異 甚大，其成分不能保持一致；(4)取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響， 可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠；(5)血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其 中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成；(6)大規模生產 中，血清來源越來越困難，價格昂貴。由於血清既昂貴又使用不方便，現有技術中的高血清濃度不良影響尤為明顯，因此， 亟需一種能在較低的血清濃度或無血清的條件下培養細胞的方法。 發明內容本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法。本發明的技術方案概述如下一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，其特徵是包括如下步驟用含容積比為 0-1%的血清培養液，在高於1個標準大氣壓10-180mmHg的壓力下培養細胞20-50h。 優選的是培養液中血清的濃度為0-0.5%。本發明的一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，其關鍵是利用應壓力代替較高濃 度的血清。細胞在無血清或低血清和一定應壓力的條件下生長，可降低實驗成本，簡化實 驗條件、減輕或排除血清中種類繁多的生長因子對細胞生長的影響，有利於更準確的觀察 特定實驗刺激如單一的生長刺激因子或單一的生長抑制因子的生理、藥理和病理的作用。 無血清或低血清細胞培養，為廉價生產基因工程相關產物，如單克隆抗體提供了可能。
圖1為不同壓力對平滑肌細胞生長的影響。圖2為含容積比0. 5%血清常壓培養24h的人臍靜脈內皮細胞。圖3為含容積比0. 5%血清高於1個標準大氣壓180mmHg壓力培養24h的人臍靜脈內 皮細胞。圖4為無血清常壓培養48h的大鼠平滑肌細胞。圖5為無血清高於1個標準大氣壓lOO隱Hg壓力培養48h的大鼠平滑肌細胞。圖6為可調壓力細胞培養箱示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。 實施例1低血清培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12株)37°C、 5%(:02條件，HUVEC-12細胞常壓培養於含容積比為10%胎牛血清、100 U/ml 青黴素和100 U/ml鏈黴素的DMEM完全培養基中，待生長融合後，細胞用含容積比0. 5% 胎牛血清的DMEM洗三次，並用0. 5%胎牛血清的DMEM培養24h，使其同步化，繼續分別在 高於1個標準大氣壓OmmHg和180mraHg恆壓、37°C、 5%0)2條件下培養細胞24h。結果見圖2和圖3，圖3顯示高壓培養的血管內皮細胞在0.5%胎牛血清的條件下，細 胞生長速度較常壓培養的血管內皮細胞在0.5%胎牛血清的條件下(圖2)生長速度快，細 胞計數結果顯示高壓培養比常壓培養細胞數增加30%。5%(:02混合氣體由衡陽市西園氣站提供(也可以採用其它企業出售的5%0)2混合氣 體)。可調壓力細胞培養箱由普通細胞培養箱改造，培養箱門被改裝加固能承受一定的壓力。 另外在外面設置了壓力控制器可以穩定壓力。具體結構見圖6。 實施例2無血清培養血管平滑肌細胞大鼠第10代平滑肌細胞PBS洗三次，傳代後分別在高於1個標準大氣壓OmmHg和 100mmHg恆壓、37°C、 5%(:02條件下培養於含100U/ml青黴素和100 U/ml鏈黴素的無血 清的DMEM培養液中，培養細胞48h。結果見圖4和圖5，圖4顯示，無血清常壓培養細胞全部凋亡，圖5顯示無血清高壓 培養大鼠平滑肌細胞仍能生長繁殖。 實施例3無血清培養血管平滑肌細胞大鼠第10代平滑肌細胞PBS洗三次，傳代後在高於1個標準大氣壓10mmHg恆壓、 37°C 、 5%C02條件下培養於含100 U/ml青黴素和100 U/ml鏈黴素的無血清DMEM培養液 中，培養細胞50h。 實施例4低血清培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12株) HUVEC-12細胞生長融合後，PBS洗三次，傳代後在高於1個標準大氣壓180 mmHg恆壓、 37°C、 5%C0條件下用含100 U/ml青黴素和100 U/ml鏈黴素的0. 5%胎牛血清DMEM培養 24h。 實施例5低血清培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12株)HUVEC-12細胞生長融合後，PBS洗三次，傳代後在高於1個標準大氣壓150 mmHg恆壓、 37°C、 5%C0條件下用含100 U/ml青黴素和100 U/ml鏈黴素的0. 1%胎牛血清DMEM培養 20h。 實施例637°C、 5%0)2條件，大鼠第3-10代平滑肌細胞常壓培養於含體積分數為10%胎牛血 清、100 U/ml青黴素和100 U/ml鏈黴素的DMEM完全培養基中，待生長融合後，細胞用含 PBS洗三次，用10%血清的DMEM高於1個標準大氣壓0 mmHg和30mmHg—180ramHg恆壓培 養24h，採用血管緊張素ll作為陽性對照組(見圖l)。上述結果提示含10%的血清培養液條件下，高壓培養還能促進細胞的生長。同時說明 可調壓力細胞培養箱能夠正常工作。
權利要求
1.一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，其特徵是包括如下步驟用含容積比為0-1％的血清培養液，在高於1個標準大氣壓10-180mmHg的壓力下培養細胞20-50h。
2. 根據權利要求1所述的一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，其特徵是所述培養 液中血清的濃度為0-0.5%。
全文摘要
本發明公開了一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，包括如下步驟用含容積比為0-1％的血清培養液，在高於1個標準大氣壓10-180mmHg的壓力下培養細胞20-50h，本發明的一種無血清或低血清濃度的細胞培養方法，其關鍵是利用應壓力代替較高濃度的血清，細胞在無血清或低血清和一定應壓力的條件下生長，可降低實驗成本，簡化實驗條件、減輕或排除血清中種類繁多的生長因子對細胞生長的影響，有利於更準確的觀察特定實驗刺激如單一的生長刺激因子或單一的生長抑制因子的生理、藥理和病理的作用，無血清或低血清細胞培養，為廉價生產基因工程相關產物，如單克隆抗體提供了可能。
文檔編號C12N5/06GK101113432SQ200710057738
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月25日 優先權日2007年6月25日
發明者廖端芳, 佳 張, 凱 李, 李君牧, 莉 肖, 許燦新, 陳成立 申請人:南華大學