一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法
2023-05-01 02:13:16
一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法
【專利摘要】本發明一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法，屬乳酸菌冷凍保護【技術領域】。其方法如下：將5%接種量的乳酸乳球菌SK11轉接新鮮M17培養基，30℃靜置培養至6h（對數生長中期）後添加16g/L蠶蛹多肽，生長至12h（穩定中後期）收集發酵液；細胞經生理鹽水洗滌兩次後，重懸於等體積添加16g/L蠶蛹多肽的M17培養基中，並置於4℃下進行冷凍脅迫；30d後乳酸乳球菌SK11存活率是空白對照的9.36倍。其工藝簡單、操作易行，可廣泛應用於乳酸菌的冷凍保存。
【專利說明】一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法，屬乳酸菌冷凍保護【技術領域】。
【背景技術】
[0002]乳酸菌是工業生產菌株中的一個龐大種群，大量的乳酸菌被應用於生產食品、化學助劑和其它生物製品。隨著人們對食品、藥品保健功能要求的不斷提高，迫切需要獲得具有旺盛生命力的乳酸菌在被人體攝入後仍然能夠發揮其特有的保健益生作用。然而，乳酸菌的最適生長溫度一般在30 -37° C，在實際生產過程中，由於起酵物的冷凍保藏、低溫育培和發酵產品的冷藏，使乳酸菌不得不置身於遠遠低於其自身最適生長溫度的環境中。生產和生活中對高活性乳酸菌的需求使乳酸菌抵禦冷凍脅迫的研究成為焦點。
[0003]酸麵團是指利用大量微生物在麵糊中的自然發酵作用而製作的麵團，俗稱酵頭。乳酸菌是酸麵團發酵的主要生產菌株。由於酸麵團的儲存和運輸溫度為4° C，因此，選取了這個實際生產中應用較為普遍的溫度作為冷凍脅迫的處理條件。在冷凍環境中，微生物細胞將產生一系列的生理功能紊亂。然而，對提高微生物細胞冷凍抗性的策略研究還十分有限，目前主要通過添加部分冷凍保護劑如海藻糖、甘油等減少冷凍過程中對細胞造成的機械損傷。因此，尋找能夠提高乳酸菌冷凍脅迫抗性的外源保護劑具有重要的研究意義。
[0004]已有研究發現穀胱甘肽(glutathione，GSH)能提高乳酸菌抵禦冷凍脅迫，但GSH價格昂貴限制了其應用。本發明自製蠶蛹多肽(Silkworm pupa peptides, SPP)是以幹蠶蛹索氏抽提油脂得蠶蛹蛋白(蛋白含量94%)酶解後冷凍乾燥所得。因此，本申請專利首次將蠶蛹多肽應用於乳酸菌冷凍保護中具有重要的實際應用價值和經濟價值。
【發明內容】
[0005]本發明涉及一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法。這種方法有效地提高了乳酸乳球菌存活率，可廣泛用於乳酸菌及其他微生物的冷凍保藏。
[0006]為達到上述目的，發明採用如下技術方案:
將5%接種量的乳酸乳球菌SKl I轉接新鮮M17培養基(胰蛋白腖5.0g、魚蛋白腖5.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5g、硫酸鎂0.25g、甘油l0.0g、乳糖3.0g、磷酸氫二鉀5.0g、瓊脂30.0 g、蒸溜水1L，另加1%的葡萄糖)，30°C靜置培養至6h (對數生長中期)後添加16g/L蠶蛹多肽(SPP)，生長至12h (穩定中後期)收集發酵液。細胞經生理鹽水洗滌兩次後，重懸於等體積添加16g/L蠶蛹多肽(SPP)的M17培養基中，並置於4°C下進行冷凍脅迫。
[0007]本發明工藝簡單、操作易行，4°C冷凍脅迫30天後，乳酸乳球菌SKll存活率是空白對照的9.36倍。
【專利附圖】
【附圖說明】[0008]圖1冷凍脅迫初期添加不同濃度SPP對乳酸乳球菌SKll冷凍抗性的影響。
[0009]圖2不同前培養時期添加SPP對乳酸乳球菌SKll冷凍抗性的影響。
[0010]圖3前培養耦合冷凍脅迫初期共同添加SPP對乳酸乳球菌SKll冷凍抗性的影響。
【具體實施方式】
[0011]實施例:本發明涉及一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法，其特徵在於具有如下的過程:將5%接種量的乳酸乳球菌SKll轉接新鮮M17培養基，30°C靜置培養至6h(對數生長中期)後添加16g/L蠶蛹多肽，生長至12h (穩定中後期)收集發酵液。細胞經生理鹽水洗滌兩次後，重懸於等體積添加16g/L蠶蛹多肽的M17培養基中，並置於4°C下進行冷凍脅迫，30d後乳酸乳球菌SKll存活率是空白對照的9.36倍；所述的M17培養基的組成為:胰蛋白腖5.0g、魚蛋白腖5.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5g、硫酸鎂
0.25g、甘油10.0g、乳糖3.0g、磷酸氫二鉀5.0g、瓊脂30.0 g、蒸溜水1L，另加1%的葡萄糖。
[0012]有關本發明的實驗
以下將結合實施實例形式，對本發明的上述內容作進一步說明。
[0013]實驗一冷凍脅迫初期添加不同濃度SPP (蠶蛹多肽)對乳酸乳球菌冷凍抗性的影響
對冷凍脅迫初始時添加不同濃度SPP (蠶蛹多肽)對乳酸乳球菌冷凍抗性的影響進行了分析。冷凍脅迫處理後的菌懸液經10，OOOXg離心5 min後，用等體積的生理鹽水(0.85%NaCl, w/v)洗漆兩次並重懸,取10 mL重懸液，以不同的稀釋度點種於M17培養基平板上測定單位體積菌落數(colony forming per unit, CFU)。將平板放置在30° C下培養72h，對平板上的菌落進行計數。設三個平行樣。用Excel軟體計算平均值和標準偏差。計算存活率時，考慮了誤差的傳遞。
[0014][誤差傳遞公式:
【權利要求】
1.本發明涉及一種提高乳酸乳球菌抵禦冷凍脅迫的方法，其特徵在於具有如下的過程:將5%接種量的乳酸乳球菌SKll轉接新鮮M17培養基，30°C靜置培養至6h (對數生長中期)後添加16g/L蠶蛹多肽，生長至12h (穩定中後期)收集發酵液，細胞經生理鹽水洗滌兩次後，重懸於等體積添加16g/L蠶蛹多肽的M17培養基中，並置於4°C下進行冷凍脅迫，30d後乳酸乳球菌SKll存活率是空白對照的9.36倍。
2.所述的M17培養基的組成為:胰蛋白腖5.0g、魚蛋白腖5.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5g、硫酸鎂0.25g、甘油10.0g、乳糖3.0g、磷酸氫二鉀5.0g、瓊脂30.0g、蒸溜水1L， 另加1%的葡萄糖。
【文檔編號】C12N1/20GK103468601SQ201310262018
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2013年6月27日
【發明者】廖鮮豔, 毛愷, 盧楠, 曹傑, 張璐娜, 郭文珂 申請人:上海大學