農用抗生素多氧黴素p及其生物合成方法與應用的製作方法
2023-04-29 09:06:16 1
專利名稱：農用抗生素多氧黴素p及其生物合成方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種農用抗生素多氧黴素P及其生物合成方法與應用。
背景技術：
多氧黴素是由可可鏈黴菌(Sti^ptomyces cacaoi)產生的核苷肽類抗生素，由核苷和肽基兩部分通過肽鍵縮合而成(
圖1)。由於它在結構上與幾丁質合成酶的天然底物 UDP-N-乙醯葡萄糖胺類似，因此能夠競爭性地抑制幾丁質的合成，從而抑制真菌、昆蟲等的生長。多氧黴素已經作為ー種重要的農用抗真菌抗生素進行了大規模的應用，用於防治稻瘟病、梨黒斑病、蘋果斑點落葉病和白粉病、菸草赤星病、蔬菜白粉病、菌核病等真菌性植物 ラ丙ゼ。尼可黴素(Nikkomycin)是由圈卷產色鏈黴菌(Streptomyces ansochromogenes 7100)產生的ー種核苷肽類抗真菌抗生素，結構與多氧黴素非常類似(圖1)。在尼可黴素生物合成途徑中，SanN催化肽基部分的前體吡啶醯CoA形成吡啶醛。在sanN基因阻斷突變株(AsanN)中，由於肽基部分合成的阻斷而喪失了產生尼可黴素的能力，但是核苷部分的合成不受影響。且在多氧黴素生物合成基因簇中，並不存在sanN的同源基因，不會由於同源基因的互補導致尼可黴素的恢復產生，從而降低了分離純化的難度。多氧黴素的核苷部分為5-氨基己糖醛酸以N-糖苷鍵連接尿嘧啶，在尿嘧啶C-5 位經常有甲基、羧基、羥甲基等修飾。而其肽基部分N端胺基酸為CP0AA，C端胺基酸為Ρ0ΙΑ， 它們分別以肽鍵與核苷部分相連，形成多種多氧黴素組分(多氧黴素A-M)。這些多氧黴素組分均易溶於水，難溶於甲醇、乙醇、丁醇、丙酮、氯仿、苯、乙醚等常見有機溶剤。不同結構的多氧黴素對不同真菌的抑制作用存在差異。因此，為了擴大多氧黴素的抑菌譜範圍，合成新的多氧黴素組分是必要的。
發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種化合物。本發明提供的化合物，其結構式為如下式1
權利要求
1. ー種化合物，其結構式為如下式1
2.ー種製備權利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟發酵圈卷產色鏈黴菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，收集發酵產物，即得到權利要求1所述化合物；所述圈卷產色鏈黴菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 為將質粒 pPOL導入圈卷產色鏈黴菌sanN阻斷突變株Δ sanN中得到的重組菌。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在幹所述圈卷產色鏈黴菌(Sti^ptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol 的保藏號為 CGMCC No. 5520 ；所述發酵的溫度為觀で，所述發酵時間為4天-6天；所述發酵為震蕩培養，所述震蕩培養的轉速為220rpm，所述震蕩培養的旋轉半徑為30mm。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於在所述收集發酵產物的步驟後，還包括如下步驟1)將所述發酵產物離心取上清液、過濾，收集濾液；2)將步驟1)得到的濾液經乙酸乙酯萃取，收集水相，濃縮，得到濃縮液；3)將步驟幻得到的濃縮液經吸附樹脂純化，收集流穿液；4)將步驟幻得到的流穿液經陽離子交換樹脂純化，收集洗脫液；5)將步驟4)得到的洗脫液經無水乙醇沉澱、離心、沉澱溶解、過濾，收集濾液1；6)將步驟幻得到的濾液1經HPLC純化，收集洗脫液，得到權利要求1所述的化合物。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述離心的時間為5min-10min，所述離心的離心カ為4000g_8000g ；所述過濾採用孔徑為3mm濾紙；步驟幻中，所述乙酸乙酯和所述濾液的體積比為1 3，萃取3次；所述濃縮為旋轉蒸發濃縮；步驟幻中，所述吸附樹脂純化為將所述濃縮液經大孔吸附樹脂HP20分離，收集流穿液；所述分離的流速為15ml/min ；步驟4)中，所述陽離子交換樹脂純化為將所述流穿液經強酸性陽離子交換樹脂Dowex 50WX 2分離，用0. 4M氨水洗脫，所述洗脫流速為8ml/min-10ml/min ；步驟5)中，所述沉澱的溫度為4°C，所述沉澱的時間為12h，所述離心的溫度為4°C，所述離心的離心カ為8000g-13000g，所述離心的時間為20min ；所述溶解採用的溶劑為水，所述過濾採用2.2μπι微孔濾膜；步驟6)中，所述HPLC純化為將所述濾液1經HPLC分離，用體積比為90 10的三氟乙酸水溶液和甲醇組成的混合物進行洗脫，收集洗脫液為收集15. Omin-15. 5min的洗脫液； 所述洗脫的流速0. 3ml/min，所述三氟乙酸溶液為體積濃度為1%。的三氟乙酸水溶液。
6.根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特徵在於步驟1)中，在所述過濾前，還包括將所述上清液調PH值至4. 5後靜置12h的步驟；在所述步驟3)和步驟4)間，還包括將所述流穿液調pH至4. 5的步驟；在步驟4)和步驟5)之間，還包括將所述洗脫液調解pH值至4.5的步驟。
7.一種重組菌，為將質粒pPOL導入圈卷產色鏈黴菌sanN阻斷突變株AsanN中得到的重組菌。
8.圈卷產色鏈黴菌(Sti^ptomycesansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol，其保藏號為 CGMCC No. 5520。
9.一種抑菌劑，其活性成分為權利要求1所述的化合物或權利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷產色鏈黴菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol發酵產物或權利要求7所述的重組菌或權利要求8所述的圈卷產色鏈黴菌(Streptomyces ansochromogenes)7100 Δ sanN/pol CGMCC No. 5520 ；所述菌具體為長柄鏈格孢 OUternaria longipes)。
10.權利要求1所述的化合物或權利要求2-6中任一所述的方法中的所述圈卷產色鏈黴菌(Streptomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/pol發酵產物或權利要求7所述的重組菌或權利要求8所述的圈卷產色鏈黴菌(Str印tomyces ansochromogenes) 7100 Δ sanN/ pol CGMCC No. 5520在抑菌和/或製備抑菌劑中的應用；所述菌具體為長柄鏈格孢 OUternaria longipes)。
全文摘要
本發明公開了一種農用抗生素多氧黴素P及其生物合成方法與應用。本發明提供了的化合物，其結構式為如下式1本發明還提供了一種製備上述化合物的方法，包括如下步驟發酵重組菌7100ΔsanN/pol，收集發酵產物，即得到上述化合物；上述重組菌7100ΔsanN/pol為將pPOL導入圈卷產色鏈黴菌sanN阻斷突變株中得到的重組菌。本發明的實驗證明，本發明提供了一種新的化合物——多氧黴素P，其為發酵重組菌7100ΔsanN/pol製備得到的發酵產物，該化合物具有抑制真菌生長的活性。
文檔編號C12R1/465GK102532277SQ20111044111
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者李磊, 李金娥, 譚華榮 申請人:中國科學院微生物研究所