一種pax6基因檢測牛生長性狀的方法及其診斷試劑盒的製作方法

2023-09-22 18:25:55 2

專利名稱：一種pax6基因檢測牛生長性狀的方法及其診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及基因單核苷酸多態性的檢測，特別涉及一種PAX6基因檢測牛生長性狀的方法及其診斷試劑盒。
背景技術：
遺傳標記指可追蹤染色體、染色體某一節段、某個位點在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特徵，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。遺傳標記大致經歷了形態標記、細胞標記、生化標記和分子標記四個發展階段。1974年,Grodzicker等首次提出用限制性片段長度多態性(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)作為遺傳標記,開創了直接用DNA作為遺傳標記的先河，從而揭開了分子標記研究的序幕。經過數十年的發展，尤其是1985年Mullis等[27]發明了 PCR技術以後，分子標記研究呈現出「百家爭鳴」的景象。分子標記之所以能反映DNA水平的遺傳變異情況主要是基於被研究的DNA分子由於缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短與重排不一的重複機制而產生多態性。經過大量的研究發現，DNA分子標記有許多特點，如直接以DNA的形式表現；某些標記表現共顯性；標記數量多；表現為中性；多態性高等。如今，分子標記在生命科學研究領域中已經被廣泛應用，在遺傳標記中佔主導地位。單核苷酸多態性(sinTle nucleotide polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander (1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/T)的變化而引起的多態性。它的變異形式有:顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的鹼基變異的SNPs約佔2/3。在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，基因編碼區內的SNPs (cSNPs)比較少，因為在外顯子內的變異率僅佔周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義 ，因此倍受關注。標記輔助選擇就是將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。標記輔助選擇主要經歷了三個階段:第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現分子標記輔助選擇的目標。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用於基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。分子育種，即分子標記輔助選擇(molecularmark-assist selection, MAS),該技術是藉助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。在畜禽育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關，並且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。近年來，人們發展了許多用於探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP) ,PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的鹼基突變。Takao經實驗證明小於300bp的DNA片段中的單鹼基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單鹼基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯醯胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，並且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑑別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。牛的PAX6基因(paired box gene6)位於15號染色體上,長28.24kb,包含13個外顯子和12個內含子，該基因對調控垂體前葉GH、ACTH、FSH、LH等激素的分泌有著至關重要的作用，而GH等激素的分泌直接關係到動物的生長性狀。當該基因發生變異時，導致PAX蛋白異常，喪失了轉錄因子的調節作用，從而嚴重影響生物的生長發育性狀。因此，對PAX6基因遺傳變異及其與生長發育、經濟性狀關係進行研究，具有重要理論和實踐意義。目前，在國內有關家畜上PAX6基因研究的資料報導很少，作為大家畜的黃牛在國內還未見該基因多態性的報導。因此本研究利用PCR-SSCP技術首次對中國黃牛PAX6基因進行遺傳變異分析，研究表明PAX6基因不同基因型對6，12和24月齡的南陽牛體重、體高、體斜長、胸圍、坐骨端寬和平均日增重有顯著影響(P〈0.05)。本實驗室的研究結果表明，PAX6基因可以作為南陽牛生長性狀有效選擇標記。

發明內容
本發明解決的技術問題在於提供一種檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法，尋找與經濟性狀關聯的SNP作為分子標記，加快具有優質經濟性狀黃牛種群的建立。本發明通 過以下技術方案來實現:一種檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，以包含PAX6基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛PAX6基因；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小；用變性劑處理PCR擴增產物之後，再對變性後的擴增片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為:上遊引物:5』-ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3』 ；下遊引物:5』-CAAACACCCATCCTCAA-3』 ；所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性 4min ;94°C變性 30s，59.1°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環；72°C延伸IOrnin0瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，所用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為1.5%。所述的聚丙烯醯胺凝膠電泳質量濃度為10%。所述根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態性為:TT基因型表現為17056位為核苷酸T純合；TC基因型表現為17056位為核苷酸T/C雜合；CC基因型表現為17056位為脫氧核苷酸C純合；其中，單核苷酸多態性CC基因型為突
變純合基因型。
與現有技術相比，本發明具有以下獨特的技術效果:本發明根據已公布牛PAX6 基因(GenBank Accession N0.NW001493316.1)的序列設計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，並對PCR產物進行測序，將測序後得到的黃牛PAX6基因的部分序列與NCBI公布的序列進行比較，發現在PAX6基因的第17056位存在SNP多態性。針對上述第17056位的SNP多態性，本發明還公開了其篩查和檢測方法，進行PCR擴增後，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物片段大小，用變性劑處理擴增產物後進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，能夠簡單、快速、低成本、精確地檢測其單核苷酸的多態性。本發明提供的檢測方法為PAX6基因的SNP與黃牛部分生長性狀進行關聯分析，研究表明基因型對南陽牛群體的體重等性狀有顯著影響(p〈0.05)。以上研究表明，PAX6基因結果表明該位點能夠作為提高黃牛體重和日增重等性狀的分子標記，以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。本發明還涉及一種用於實施本發明所述方法的專用試劑盒，所述試劑盒內容包括:一、試劑盒成分:1.1特異引物，所述的特異引物包括:上遊引物:5』-ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3』 ；下遊引物:5』-CAAACACCCATCCTCAA-3，；1.2生化試劑，所述生化試劑包括:
TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內含Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ；二、試劑盒操作說明:2.1PCR操作說明(I) PCR擴增反應體系PCR反應體系見表2。(2) PCR擴增反應程序95°C預變性 4min ;94°C變性 30s，59.1°C退火 30s，72°C延伸 30s，34 個循環；72°C延伸IOrnin02.2電泳檢測與基因型判斷( I) PCR產物的瓊脂糖電泳檢測擴增得到長度為211bp的PCR產物，經用1%的瓊脂糖電泳檢測，表現唯一的211bp的PCR條帶，見圖2所示。 (2 ) PCR 產物的 SSCP 分析對每個個體擴增片段變性處理後，進行10%聚丙稀醯胺凝膠電泳檢測，其個體可以出現CC，或CT，或TT帶型，見圖4所示。2.3待檢個體的選擇與淘汰依據表4的分析結果(南陽牛PAX6基因的TT基因型個體的體重、體高、體斜長、胸圍、坐骨端寬和平均日增重顯著大於TC和CC基因型個體)，將TC，CC型個體淘汰；ττ型個體留種進行擴繁，將形成一個優良的群體。2.4注意事項(I)DNA的提取可以按照以上提供的步驟操作，也可以依據不同廠家的全血DNA提取試劑盒的要求來提取，但是要保證DNA的純度，若提取效果不佳，需要純化後再進行後續的試驗。(2)反應體系和反應程序可以依據不同的廠家產品的要求來操作，但要保證擴增的特異性和擴增產物的濃度，以免影響後續的試驗結果。


圖1是本發明的技術流程示意圖。圖2是本發明用來檢測PCR產物片段大小的瓊脂糖凝膠電泳(泳道1-7分別代表不同黃牛個體的PCR擴增產物；M為Marker I，條帶分別為100_bp，200-bp，300-bp，400-bp，500-bp,600-bp)。圖3是本發明中PCR產物混合測序篩查到的黃牛PAX6基因序列17056位T-C突變測序結果圖(黑色方框所指處為單核苷酸突變位置，自上至下分別為TT、TC和CC基因型的測序結果圖)。圖4是本發明用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯醯胺凝膠電泳(自左至右泳道分別代表基因型TT、TC和CC的電泳帶型)。
具體實施例方式本發明首先根據NCBI公布的PAX6基因序列(GenBankAccessionN0.NW001493316.1)設計引物，分別以3個黃牛品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物並對其純化，測序。然後，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最後，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和生長性狀的關聯分析，篩選出與黃牛生長性狀密切相關的分子標記。下面對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I地方黃牛品種PAX6基因部分DNA序列的克隆1、黃牛樣本採集本發明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體採集樣本見表1:河南南陽牛(276)，陝西秦川牛(308)，河南郟縣紅牛(141)；表I黃牛樣本的 採集
權利要求
1.一種檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法,其特徵在於， (1)以包含PAX6基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛PAX6基因， 所述的引物對P為: 上遊引物:5 』 -ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3，； 下遊引物:5』 -CAAACACCCATCCTCAA-3』 ； (2)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(I)中PCR擴增產物片段大小； (3)用變性劑處理步驟(I)中PCR擴增產物之後，再對變性後的擴增片段進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態性。
2.如權利要求1所述的檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，步驟(I)所述的PCR擴增反應程序為: 95°C預變性4min ;94°C變性30s，59.1°C退火30s，72。。延伸30s，34個循環；72°C延伸lOmin。
3.如權利要求1所述的檢測黃牛PAX6基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求1所述的檢測黃牛PAX6基因的單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的聚丙烯醯胺凝膠電泳為質量濃度10%的聚丙烯醯胺凝膠電泳。
5.如權利要求1所述的檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定黃牛PAX6基因第17056位的單核苷酸多態性為:TT基因型表現為17056位為核苷酸T純合；TC基因型表現為17056位為核苷酸T/C雜合；CC基因型表現為17056位為核苷酸C純合；其中，單核苷酸多態性CC基因型為突變純合基因型。
6.權利要求1-5中任意一權利要求所述的檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性的方法在鑑定不同黃牛群體多態性中的診斷應用。
7.權利要求6所述的應用，其特徵在於用於中國黃牛肉用和生長性狀的分子標記輔助選擇中的應用。
8.一種用於檢測黃牛PAX6基因單核苷酸多態性方法的專用試劑盒，所述試劑盒的內容包括: (1)特異引物，所述的特異引物包括: 上遊引物:5』 -ATCTTGATTTGATTTGCAGGT-3』 ； 下遊引物:5』 -CAAACACCCATCCTCAA-3』 ； (2)生化試劑:所述生化試劑盒包括: TaqDNA聚合酶；滅菌超純水；內含 Mg2+、dNTPs 的 2 X Buffer ；包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker I ； (3)操作說明書所述操作說明書包括 PCR操作說明； 電泳檢測與基因型判斷；待檢個體的選擇與淘汰；注意 事項。
全文摘要
本發明公開了一種檢測黃牛生長性狀的基因診斷試劑盒，是一種PAX6基因檢測黃牛生長性狀的方法，該方法以包含PAX6基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛PAX6基因；通過DNA測序和PCR-SSCP技術進行基因多態性的檢測與快速分型，該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記，故本發明提供的檢測方法可用於黃牛生長性狀的分子標記輔助選擇，進而快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。本發明檢測方法簡單、成本低，檢測結果直接、可靠，適用於對黃牛PAX6基因第17056位突變的大規模的篩查和診斷。
文檔編號C12Q1/68GK103146810SQ20121054973
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月18日 優先權日2012年12月18日
發明者陳宏 , 黃永震, 魏天寶, 藍賢勇, 雷初朝, 胡沈榮 申請人:西北農林科技大學