一種免疫層析快速試劑盒及其生產製備的製作方法

2023-04-29 03:02:26 1

專利名稱：一種免疫層析快速試劑盒及其生產製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及了一種免疫層析試紙條、其製備方法及含有所述試紙條的試劑盒。具 體而言，本發明涉及一種基於上轉發光技術的免疫層析試紙條，採用凍幹法生產所述免疫 層析試紙條的生產方法，以及包含所述免疫層析試紙條的檢測試劑盒。本發明還涉及了應 用上述生產方法生產的用於檢測甲胎蛋白、C反應蛋白的免疫層析試紙條及其試劑盒。
背景技術：
中國專利申請200410034104. 0中記載了一種被稱為上轉發光材料(UCP)的物質 以及應用該材料作為標記物的免疫層析試紙條。雖然上轉發光材料具有高靈敏性、高穩定性、高簡易性、高靈活性和高安全性等諸 多優點，使其在作為生物標記物方面具有廣泛的應用前景。但是至今仍然沒有一種商品化 的上轉發光法定量檢測試紙可以供臨床使用，原因是在於現有的基於上轉發光法的免疫層 析試紙條無法滿足對定量檢測試紙的生產質量要求。如中國專利申請200410034104. 0所 述，以往UPT (上轉發光技術，Up-Converting Phosphor Technology)快速試紙的製備方法 中結合墊或結合物釋放墊是採用烘乾方法。由於UCP顆粒容易團聚，導致烘乾結合墊後裁 剪的變異過大，批內精密度低，變異係數(CV)大於15%。變異係數CV常被用於表示精密 度，包括批內和批間變異係數兩種(分別對應於批內精確度和批間精確度)，CV越小精密度 越高。批間精密度的CV值一般大於批內，低含量標本的CV值一般大於高含量標本。最常 見的精密度評價是對穩定的樣品作多次測定，求這些重複測定值的均值和標準差s，以及變 異係數CV。重複次數一般要求10-20次。若在一批內的重複測定，這是批內精密度；衛生 部發的《臨床化學體外診斷試劑盒質量檢驗總則》WS/T124-1999中有這方面的檢測和計算 方法的規定。一般臨床免疫試劑的批內和批間CV均應該< 15%。醫院實驗室對病人標本檢測時，由於該行業的沿襲特點，一直是對每份標本只作 一次檢測發出報告。因此國際上將精密度性能列為實驗方法、儀器或試劑盒分析性能的第 一位。檢測結果必須具重現性，也即具有良好的精密度。因此急需開發出具有較高精密度 的基於上轉發光法技術的免疫層析試紙條。甲胎蛋白(α -Fetoprotein, AFP)是 1956 年 Bergstrandh 和 Czar 在人胎兒血清 中發現的一種專一性的甲種球蛋白，是胚胎早期的主要蛋白質，來源於胎兒肝臟和卵黃囊。 胎兒的AFP濃度非常高，可達l-10mg/ml，但在出生後迅速下降，生後2個月只有痕量AFP可 檢測到，並幾乎完全被血清白蛋白所替代。甲胎蛋白是原發性肝細胞癌(PHC)較為特異的 腫瘤標誌物，70%以上的患原發性肝細胞癌病人早期血清中AFP含量升高。同時在其它一 些惡性腫瘤中也能發現AFP水平升高，如睪丸癌。對血清中AFP含量的檢測可以用作肝癌 高發區普查以及肝癌的早期臨床診斷，同時也可以評定肝癌的治療效果和判斷預後。C-反應蛋白(CRP)是參與炎症的主要時機反應蛋白，在各種急性炎症、組織損傷、 心肌梗塞、手術創傷、放射性損傷等疾病發作後數小時迅速升高，並有成倍增長之勢。病變 好轉時，又迅速降至正常，其升高幅度與感染的程度呈正相關。C-反應蛋白還可用於細菌和病毒感染的鑑別診斷。一旦發生炎症，C-反應蛋白水平即升高，而病毒性感染C-反應蛋白 大都正常。近年來發現C-反應蛋白濃度甚至在正常範圍內的輕度升高都與心血管疾病發生 的危險性增加有關，可以推測以後心肌梗死事件發生的可能性。超敏C-反應蛋白是心腦血 管疾病中的一項獨立風險預測指標，可以敏感地預測糖尿病合併心、腦血管事件的危險發生率。AFP和CRP都是常見的POCT檢測指標。應用上轉發光免疫分析技術開發AFP及 CRP快速檢測免疫層析試紙條應用於床旁快速檢測(POCT)領域有臨床應用價值，但是批內 精密度(CV)應不高於15%才能滿足臨床使用需要。因此需要具有可以應用於POCT檢測的 高精密度，基於上轉發光技術的成品AFP及CRP快速檢測免疫層析試劑條及試劑盒。

發明內容
為了克服上述現有技術中的不足，本發明提供一種基於上轉發光技術的採用 經凍幹法製備的結合墊或結合物釋放墊的免疫層析試紙條，具有精密度高即變異係數 CV^ 15%的特點。本發明的試紙條是檢測原理是通過一系列表面修飾與活化，上轉換發光材料 UCP (Up-Converting Phosphor, UCP)顆粒可與生物活性分子相結合，利用UPT生物傳感器， 對在層析過程中通過特異免疫反應結合於特定區域(檢測帶與質控帶)的UCP顆粒進行掃 描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗系統實現精確定量或定性。具體地，本發明提供了一種基於上轉換發光技術的免疫層析試紙條，其特徵在於 含有上轉換發光材料(UCP)-生物分子顆粒的結合墊或結合物稀釋墊是經凍幹的。在一個優選的實施方案中，所述免疫層析試紙條的分析膜為硝酸纖維素膜。在另一個優選的實施方案中，所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔、結 果判讀窗口和終點指示窗口，如圖2B所示。在另一個優選的實施方案中，通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結果 判讀窗口對應於分析膜上的檢測帶和質控帶；終點指示窗口對應於吸水墊上的終點指示 帶，如圖2B所示。在另一個優選的實施方案中，所述生物分子選自AFP抗體、CRP抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫特羅(瘦肉精)抗 體、鹽酸萊克多巴胺抗體、C型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗體、B肝表面抗原 抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。優選地，所述上述抗體均為單抗。本發明還提供了一種製備上述免疫層析試紙條的方法，其中在製備結合墊或結合 物稀釋墊的過程中，所述結合墊或結合物稀釋墊是經凍幹的。在一個優選的實施方案中，所述所述製備結合墊或結合物稀釋墊的過程包括a)將UCP-生物分子懸濁液離心並棄上清；b)向a)步驟得到的UCP-生物分子沉澱物中加入UCP保存液，吹打混勻；c)向b)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加入凍幹液；d)將C)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加於玻璃纖維上；e)將玻璃纖維放於_80°C下，預凍時間0. 5小時，真空凍幹2小時。
在一個優選的實施方案中，所述UCP保存液為pH7. 2的0. 15M的磷酸緩衝液，含 有2wt% BSA和0. 05wt% NaN3，所述凍幹液為ρΗ7· 2的0. 15Μ的磷酸緩衝液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1.氨酸。本發明還提供了一種基於上轉換發光技術的免疫層析快速試劑盒，包括本發明的 上述免疫層析試紙條。在一個優選的實施方案中，上述試劑盒中試紙條的生物分子選自AFP抗體、CRP抗 體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫特 羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、C型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A抗 體、B肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。優選地，所述上述抗體均為單抗。在一個實施方案中，本發明提供了一種含有上述AFP-UPT快速檢測免疫層析試劑 條的試劑盒。在另一個實施方案中，本發明提供了一種含有上述CRP-UPT快速檢測免疫層析試 劑條的試劑盒。本發明克服了以往烘乾法生產上轉發光免疫層析試紙條碰到的精密度低，變異系 數cv%過大的問題，克服了上轉發光法免疫層析試紙條產業化當中的極其重要的問題。使 得上轉發光法免疫層析試紙條可以應用於臨床。


圖1為兩個光子激發UCP產生上轉發光的過程。圖2為附圖為本發明凍幹法上轉發光免疫定量檢測免疫層析試紙條免疫層析試 紙條的剖面結構示意圖。其中圖2A中1為樣品墊、2為結合墊、3為分析膜、4為吸水墊、5 為粘性低襯、6為UCP結合物、7為檢測帶T線、8為質控帶C線。圖2B中9為加樣孔、10為 結果判讀窗口、11為終點指示窗口。圖3為對比烘乾法和凍幹法方法差別。圖4為烘乾法和凍幹法製備的免疫層析試紙條的測量變異對比。圖5為本發明AFP-UPT試劑盒的對AFP定量標準品線性檢測結果。圖6為本發明AFP-UPT上轉發光檢測試劑盒和AFP電化學發光免疫試劑盒測定 AFP臨床樣本比較。圖7本發明CRP-UPT試劑盒對CRP定量標準品的線性檢測結果。圖8為為本發明CRP-UPT上轉發光檢測試劑盒和免疫比濁法貝克曼CRP試劑盒測 定CRP臨床樣本比較。
具體實施例方式下面用實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用於說明本 發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的具體改進都屬於本發明要 求保護的範圍。實施例1 基於上轉發光法技術的免疫層析試紙條製備過程中採用烘乾法和採用 凍幹法時的差別及其對CV的影響A)對比烘乾法和凍幹法方法差別(如圖3所示)
凍乾結合墊的製備UCP顆粒採購自上海科潤光電技術有限公司，玻璃纖維、纖維 素膜採購自Millipore公司、塑料卡和吸水墊購買自上海金標生物科技有限公司，塑料卡 購買自深圳市金燦華實業有限公司。a)將50ml UCP標記物(UCP-生物分子)懸濁液，以12000rpm在4°C下離心30min，
棄去上清液；b)在UCP沉澱物中加入5ml的保存液(pH = 7. 2的0. 15M磷酸緩衝液，含2wt% BSA 和 0. 05wt% NaN3)，吹打混勻；c)加入 45ml 的凍幹液(pH = 7. 2 的 0. 15M 磷酸緩衝液，含 4. 2wt% BSA,5. 6wt% 海藻糖和1.5wt%甘氨酸)；d)將UCP標記物懸濁液按12. 5ml/cm2加於玻璃纖維上；e)將玻璃纖維在-80°C下，預凍0. 5h ；真空凍幹2h ；f)裁剪玻璃纖維，裝塑料卡烘乾法製備結合墊的步驟a) d)與凍乾結合墊的製備相同，e):將玻璃纖維在37°C的鼓風乾燥箱中2小時。f)裁剪玻璃纖維，裝塑料卡B)兩種生產方法的成品(C反應蛋白CRP上轉發光法免疫層析試紙條)進行CV檢 測對比取高、低濃度血清各一份，用兩種方法製備的試紙條測量，同一份血清用每種試紙 條各測10次，計算10次測量結果的變異係數(CV)。結果如圖4及表1和表2所示表1高濃度血清測量結果(單位ng/ml)
權利要求
1.一種基於上轉換發光技術的免疫層析試紙條，其特徵在於含有上轉換發光材料 (UCP)-生物分子顆粒的結合墊或結合物稀釋墊是經凍幹的。
2.權利要求1所述的免疫層析試紙條，其特徵在於分析膜為硝酸纖維素膜。
3.權利要求1所述的免疫層析試紙條，其中所述試紙條包括一外殼，所述外殼上包括 加樣孔、結果判讀窗口和終點指示窗口。
4.權利要求3所述的免疫層析試紙條，其中通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品 墊上；結果判讀窗口對應於分析膜上的檢測帶和質控帶；終點指示窗口對應於吸水墊上的 終點指示帶。
5.權利要求1-4任一項所述的免疫層析試紙條，其中所述生物分子選自AFP抗體、CRP 抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克倫 特羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、C型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗體、B肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。
6.一種製備權利要求1-4任一項所述的免疫層析試紙條的方法，其中在製備結合墊或 結合物稀釋墊的過程中，所述結合墊或結合物稀釋墊是經凍幹的。
7.權利要求6所述的方法，其中所述製備結合墊或結合物稀釋墊的過程包括a)將UCP-生物分子懸濁液離心並棄上清；b)向a)步驟得到的UCP-生物分子沉澱物中加入UCP保存液，吹打混勻；c)向b)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加入凍幹液；d)將c)步驟得到的UCP-生物分子懸濁液中加於玻璃纖維上；e)將玻璃纖維放於_80°C下，預凍時間0.5小時，真空凍幹2小時。
8.權利要求6或7所述的方法，其中所述UCP保存液為pH7.2的0. 15M的磷酸緩衝液， 含有2wt% BSA和0. 05wt%NaN3,所述凍幹液為pH7. 2的0. 15M的磷酸緩衝液，含有4. 2wt% BSA,5. 6wt%多糖和 1. 氨酸。
9.一種基於上轉換發光技術的免疫層析快速試劑盒，其特徵在於包括權利要求1-4任 一項所述的免疫層析試紙條。
10.權利要求9所述的試劑盒，其中所述免疫層析試紙條中的生物分子選自AFP抗體、 CRP抗體、肌鈣蛋白I CTN-I抗體、腦鈉肽BNP抗體、N端前體腦鈉肽N-pro-BNP抗體、鹽酸克 倫特羅(瘦肉精)抗體、鹽酸萊克多巴胺抗體、C型肝炎病毒HCV抗原、流感病毒A型Flu-A 抗體、B肝表面抗原抗體和髓過氧化物酶MPO抗體。
全文摘要
本發明涉及了一種免疫層析試紙條的生產方法及應用這種生產方法而製備的甲胎蛋白快速定量免疫層析試紙條和C反應蛋白快速定量免疫層析試紙條。該層析試紙條採用上轉發光材料即UCP作為生物標記物。其結構主要包括樣品墊、結合墊或結合物稀釋墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和塑料卡組成。本發明涉及了產業化生產這種上轉發光法免疫層析試紙條的方法、使用方法。應用該上轉發光檢測免疫層析試紙條可快速、簡便、定量的測定被檢測物的含量，準確的對疾病進行，為疾病的預防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/52GK102116770SQ20091026278
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者周蕾, 李華柏, 楊瑞馥, 林長青 申請人:北京熱景生物技術有限公司, 周蕾, 楊瑞馥