低免疫原性重組水蛭素突變體的製備的製作方法
2023-04-29 08:09:36
專利名稱：低免疫原性重組水蛭素突變體的製備的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程製藥領域或蛋白質多肽藥物領域，涉及一種採用蛋白質工程領域技術研製新型低免疫原性重組水蛭素突變體的製備方法及其應用。
背景技術：
水蛭素是一類最初從醫用水蛭唾液腺中分離得到的由65 66個胺基酸組成的多肽物質，主要有HV1、HV2、HV3三種同源性很高的異構體(Hirudin Variant)。水蛭素可以通過直接抑制凝血酶的活性而有效地抑制動脈、靜脈血栓的形成及彌散性血管內凝血(DIC)， 因此，水蛭素在預防和治療深度靜脈血栓、冠狀動脈血栓、以及心絞痛等疾病方面具有極高的應用價值。目前，國外已有兩個重組水蛭素產品批准上市1. Desirudin(商品名Revasc, 瑞士 Novartis 產品)；2· Lepirudin (商品名Ref Iudan,英國 Pharmion 及美國 Berlex Laboratories產品)。兩者結構上僅在N-端存在微小差異，Desirudin為Vall_Val2, 而Lepirudin為Leul-Tyr2。Desirudin用於手術時深度靜脈血栓(DVT)的預防與治療， Lepirudin用於肝素誘導的血小板減少性疾病病人的抗凝治療。此外，水蛭素在防治不穩定性心絞痛、彌散性血管內凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動脈血栓等方面都具有巨大的潛在臨床應用價值。然而，水蛭素上市以後，國外多家臨床使用單位卻發現，由於水蛭素是一種異源蛋白，具有較強的免疫原性，注射給藥後易產生中和性抗體，從而嚴重影響了其臨床用藥效果[Fischer, K. G. et al. (2003) Thromb Haemost 89 (6)，973-982 ;Huhle，G. et al. (2001) Thromb Haemost 85 (5), 936-938 ；Greinacher, A. et al. (2003)]。其中 Fischer, K. G.等報導，高達74%的病人在使用水蛭素五天以後就可在其血液中檢測到抗水蛭素抗體，Huhle, G.等報導所產生的水蛭素抗體可以通過中和作用直接導致水蛭素失活，使其藥理活性喪失。因此，研究如何去除或顯著降低水蛭素藥物的免疫原性以提高其臨床用藥效果具有十分重要的潛在臨床應用價值。
發明內容
本發明公開了一種低免疫原性重組水蛭素突變體及其製備方法。本發明對克服現有水蛭素藥物的免疫原性問題，改善水蛭素藥物的臨床用藥效果，充分發揮其臨床使用價
值具重要意義。本發明首先利用卩遼菌體肽庫及Pepscan(SPOTS)技術鑑定出水蛭素優勢抗原表位，然後以丙氨酸(ALA)掃描技術對優勢抗原表位的關鍵性結合殘基進行掃描並精確定位,並通過定點突變技術去除其免疫原性,從而得到抗凝比活性基本不變,但免疫反應性顯著降低的水蛭素突變體，進而通過動物實驗證明水蛭素突變體免疫原性顯著降低。本發明的目的是公開一種抗凝比活性基本不變但其免疫原性顯著降低的水蛭素突變體。具體實施方案下面的優選例對本發明做詳細敘述，但並不意味著限制本發明的範圍。實施例中常規分子克隆操作參照文獻(《分子克隆實驗指南》第二版，金冬雁等譯，1995年，科學出版社)。實施例I重組水蛭素III抗原表位的鑑定米用New England Biolabs 公司的 Ph. D. _7 Phage Display Peptide Library Kit進行表位淘選。首先用適當稀釋的豚鼠抗rHV3抗體包埋平板，孵育過夜。每板加滿封阻液，4°C作用至少lhr,TBST (TBS+0. 1% [v/v]Tween-20)緩衝液快速洗板6次。用Iml的 TBST緩衝液稀釋2 X IO11的噬菌體(即10 μ I的原始文庫)，然後加到已包被好的板上，室溫溫和搖動10-60min。傾倒除去未結合噬菌體，TBST緩衝液洗板10次。以Iml O. I-ImM 濃度的rHV3的TBS溶液競爭洗脫。洗脫液接入大腸桿菌ER2738的過夜培養物中。37°C劇烈搖動培養4. 5hr，離心，取上清。加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，沉澱並提純擴增的噬菌體，並將擴增的噬菌體用於下一輪淘選，共淘選3輪，第三輪淘選物不擴增，稀釋一定倍數， 與對數中期的大腸桿菌ER2738混合，感染大腸桿菌細胞，加入45°C預溫的上層瓊脂，混合， 立即傾注於37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上。冷卻後，37°C過夜培養。挑選單個藍色斑點擴增，提純噬菌體。通過噬菌體ELISA篩選陽性克隆。用HRP標記的兔抗M13單克隆抗體孵育，加入TMB溶液顯色，選擇顯色程度最強的24個克隆，提取DNA並測序，有11個序列與 rHV3胺基酸序列匹配(相同胺基酸彡3個)。由此確定抗原表位序列(圖I)。根據Pepscan(SPOTS)技術原理,設計覆蓋重組水蛭素III全蛋白序列的十肽點陣序列29個，每個序列前後交錯2個胺基酸(表I)，並由Sigma公司定製合成纖維素膜上。適當體積甲醇漂洗5min，再用TBS溶液洗滌lOmin，洗滌3次，封阻緩衝液室溫封阻2h。 O. 1-10 μ g/ml的豚鼠抗rHV3多克隆抗體(用封阻緩衝液稀釋)孵育3h。TBST溶液洗滌 lOmin，洗滌一次。O. 5-2 μ g/ml的HRP標記的兔抗豚鼠的二抗孵育2h。TBS洗滌5min，洗滌三次。採用化學發光方法(參照ECL試劑盒說明書將混合A液和B液，均勻塗布於點陣膜上)，Tanon4200凝膠成像系統檢測各點信號強弱。這樣通過將纖維素膜依次與豚鼠抗 rHV3的多克隆抗體，HRP-兔抗豚鼠二抗處理，顯色，確定抗原表位序列(圖2)。表I合成的多肽點陣序列
權利要求
1.一種低免疫原性重組水蛭素突變體，其特徵在於將水蛭素分子優勢抗原表位區域 (第53 58位)的胺基酸殘基進行替換以降低其免疫反應性和免疫原性。
2.根據權利要求I所描述的對水蛭素分子優勢抗原表位區域(第53 58位)進行替換的胺基酸可以是丙氨酸(Ala)或甘氨酸(Gly)。
3.根據權利要求I所描述的對水蛭素分子優勢抗原表位區域(第53 58位)所進行的胺基酸替換可以是單個胺基酸替換，也可以是多個胺基酸替換。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，具體涉及一種低免疫原性重組水蛭素突變體及其製備方法。本發明首先利用噬菌體肽庫及Pepscan(SPOTS)技術鑑定出水蛭素優勢抗原表位，然後以丙氨酸(ALA)掃描技術對優勢抗原表位的關鍵性結合殘基進行掃描並精確定位，並通過定點突變技術去除其免疫原性，從而得到抗凝比活性基本不變，但免疫反應性及免疫原性顯著降低的水蛭素突變體。本發明對克服現有水蛭素藥物的免疫原性問題，改善水蛭素藥物的臨床用藥效果，充分發揮其臨床使用價值具重要意義。
文檔編號C07K1/107GK102584988SQ201210013460
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者塞拉, 張學瑞, 譚樹華, 趙芳, 郭享邑 申請人:中國藥科大學