一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片及其應用的製作方法

2023-05-02 07:25:56

專利名稱：一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞凋亡研究技術,特別提供了一種用於細胞凋亡研究的集 成化微流控晶片及其應用。
背景技術：
細胞凋亡是一種由基因調控的細胞主動死亡過程，與多種人類重大疾 病發生密切相關，在正常胚胎和器官發育、免疫反應、腫瘤和神經退行性 變等疾病發生過程中具有重要作用。此外，細胞凋亡還是一個複雜的細胞 信號轉導過程，受來自細胞內和細胞外諸多信號的調控，並通過生物信號 在細胞間的傳遞實現。這一過程中涉及多種細胞功能的變化，並產生多種 細胞凋亡相關事件，如細胞膜結構和功能異常，導致細胞質膜脂雙層喪失 二側不對稱性，使細胞膜磷脂醯絲氨酸(PS)外翻；線粒體膜功能變化導 致線粒體跨膜電位(A Wm)下降，線粒體細胞色素C釋放；以及胞內核糖核
酸酶激活出現核DNA片段化等。這些事件貫穿於細胞凋亡過程的不同時 期，彼此相互聯繫。對這些事件過程的研究有利於闡述不同細胞凋亡誘導 因子的作用機制，並對臨床診斷、治療和藥物篩選具有重要作用。
目前，常規的細胞凋亡研究過程為配製不同濃度藥物溶液，在多孔 板或多平皿上進行細胞培養、濃度梯度藥物施加、細胞洗滌和標記等操作， 最後以流式細胞儀、普通光學或螢光顯微鏡等手段進行細胞凋亡檢測。該 方法存在諸多局限，主要表現為細胞需求量大，樣品前處理時間長，操 作繁瑣，分析多為離線進行，不易捕捉瞬間發生的細胞凋亡事件各個過程 的相關信息，難以實現對細胞凋亡動力學過程的實時分析。
微流控晶片實驗室又稱晶片實驗室(Lab-on-a-Chip)或微流控晶片 (Microfluidic)，指的是把化學和生物等領域中所涉及的樣品製備、反應、 分離、檢測，細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到-塊幾平方釐米(甚至更小)的晶片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿 整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術。微流 控晶片所具有的不同操作單元技術靈活組合，整體可控和規模集成的特點 在用於細胞研究的過程中主要表現在1)晶片通道尺寸(通常10-100 ii m)與典型哺乳類細胞直徑大小(10-20 Pm)相適應，利於單細胞操縱、分 析；2)晶片的多維網絡結構形成相對封閉的環境，與生理狀態下細胞的空 間特徵接近；3)晶片通道微尺度下傳熱、傳質較快，可以提供有利的細胞 研究環境；4)晶片可以滿足高通量細胞分析的需要，可同時獲取火量的生 物學信息；5)晶片多種單元技術的靈活組合使集成化的細胞研究成為可能， 諸如細胞進樣、培養、分選、裂解和分離檢測等過程可在一塊晶片上完成。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片及 其應用。本發明集成了藥物濃度梯度生成、晶片細胞培養、受激、洗滌、 標記等單元操作；大大簡化了細胞接種、受激、洗滌和標記操作過程，顯 著降低細胞和試劑耗量，此外， 一次運行還可獲得多個實驗相關參數。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為；
一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片，晶片主要由兩個功能單 元構成，
第一個單元為一個樹狀的、從上至下逐層增加分支的濃度梯度生成單
元，在其最上端設有藥物入口和培養基入口；每個分支的通道為迂迴的折 線形；
k二個單元為陣列式細胞培養單元，細胞培養單元由一個或一個以上 的細胞培養室相互串聯作為一列，三列或三列以上相互並聯構成陣列式細 胞培養單元，每兩列的出口逐級相互連接，最終連接成一個出口通道，該
出口通道的末端作為細胞入口 ，在出口通道上設有衝洗液入口和染料入口 ；
此外，在第一個單元和第二個單元之間有一排"幾"字形的壩結構， 用於阻擋細胞流入第一個單元；所述"幾"字形的壩結構的"幾"字上端 通道深度小於"幾"字下端兩側通道深度；位於晶片上遊的第一個單元最 下層分支的每一個通道出口都通過一個"幾"字形的壩結構與位於晶片下 遊的第二個單元中的一列細胞培養室入口相連接。
第二個單元中的每一列細胞培養室的個數相同，並且每兩列細胞培養 室由微通道相連接，這些微通道再每兩個互相連接，最終連接成一個通道； 第一個單元生成的每一種濃度的藥物溶液都作用於下遊第二個單元中與其 相連接的一列細胞培養室中的細胞。
所述集成化微流控晶片的應用過程如下；
將細胞懸液加入第二個單元細胞入口的儲液池中，施加壓力，待細胞 流入細胞培養室後，移走儲液池中的細胞懸液，並使晶片中溶液處於靜止 狀態；
晶片在細胞培養箱中放置，置於顯微鏡下觀察細胞是否帖壁； 待細胞貼壁後向第一個單元處於藥物入口和培養基入口上方的兩個儲 液池中分別加入含有凋亡誘導劑最低濃度和最高濃度的培養基溶液，並使 溶液始終保持從上遊第一個單元流向下遊第二個單元，晶片置於細胞培養 箱中.
-一小時至三天後向第二個單元的洗滌液入口的儲液池加入洗滌溶液，施 加壓力，對細胞進行洗滌；
^m二個單元的標記液入口的儲液池加入標記溶液，施加壓力，對細胞 進行標記；
晶片置於螢光顯微鏡下，進行細胞凋亡檢測。
本發明具有如下優點
1. 本發明只需向第一個單元的兩個儲液池內分別加入含有細胞凋亡誘 導劑最低濃度和最高濃度的培養基溶液就可以在第一個單元的出口處生成 濃度梯度並自動作用於第二個單元中的細胞。
2. 本發明只需向第二個單元的洗滌溶液儲液池和標記溶液儲液池中分
別加入洗滌液和標記液，就可進行細胞的洗滌和標記操作。
3. 本發明創造性的在晶片上集成了藥物濃度梯度生成、晶片細胞培養、 受激、洗漆、標記及多種細胞響應的檢測，並用於臨床藥物誘導腫瘤細胞 凋亡過程研究。該微流控晶片集細胞培養、藥物濃度梯度自動生成、小分 子-細胞相互作用等單元操作於一體。
4. 與傳統的多孔板技術相比，本發明省去了配製不同濃度藥物溶液的 繁冗操作，並大大簡化了細胞接種、受激、洗滌和標記操作過程，顯著降 低細胞和試劑耗量，此外， 一次運行還可獲得多個實驗相關參數。


圖1為集成化細胞凋亡研究微流控晶片的結構示意圖，圖中(1)為培養 基入口， (2)為藥物入口， (3)為濃度梯度生成單元，(4)為細胞培養單 元，(5)為衝洗液入口， (6)為染料入口， (7)為細胞入口， (8)為壩形 結構的俯視圖(a)和側視圖(b);
圖2為不同濃度阿黴素作用後，典型的HepG2細胞凋亡形態學變化，(a) 光鏡結果細胞皺縮，變圓，間距變大。(b)螢光結果凋亡細胞染色質 凝聚，表現橙-綠色斑點(圖中箭頭所指)，細胞形態改變程度隨著藥物作用 濃度升高而明顯；
圖3為不同濃度阿黴素作用後，HepG2細胞膜變化，凋亡早期，位於細 胞膜內側的磷脂醯絲胺酸(PS)外翻，呈現綠色圓環( )，凋亡晚期細胞 膜通透性增加，表現為紅色斑點外包裹綠色圓環(▲)，壞死細胞為紅色(■)， 凋亡細胞比例隨著藥物作用濃度增加而明顯增加；
圖4為不同濃度阿黴素作用後，HepG2細胞線粒體膜電勢(MMP)變 化，MMP耗散導致依賴MMP的Rh-123外洩，細胞螢光強度降低，其程度 隨著藥物作用劑量升高而增強。
具體實施例方式
一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片，晶片主要由兩個功能單 元構成，
第一個單元為- -個樹狀的、從上至下逐層增加分支的濃度梯度生成單 元，在其最上端設有藥物入口和培養基入口；每個分支的通道為迂迴的折 線形；
第二個單元為陣列式細胞培養單元，細胞培養單元由一個或一個以上 的細胞培養室相互串聯作為一列，三列或三列以上相互並聯構成陣列式細 胞培養單元，每兩列的出口逐級相互連接，最終連接成一個出口通道，該 出口通道的末端作為細胞入口 ，在出口通道上設有衝洗液入口和染料入口 ；
此外，在第一個單元和第二個單元之間有一排"幾"字形的壩結構， 用於阻擋細胞流入第一個單元；所述"幾"字形的壩結構的"幾"字上端 通道深度小於"幾"字下端兩側通道深度；位於晶片上遊的第一個單元最 下層分支的每一個通道出口都通過-^個"幾"字形的壩結構與位於晶片下 遊的第二個單元中的--列細胞培養室入口相連接。
首先將細胞懸液加入圖l所示的細胞入口儲液池中，施加一定壓力， 待一定數量的細胞進入細胞培養室後移走儲液池中的細胞懸液，並使晶片 中溶液處於靜止狀態。晶片在細胞培養箱中放置數小時後，置於顯微鏡下 觀察細胞是否貼壁。待細胞貼壁後通過晶片上遊的兩個入口分別加入培養 基和最高濃度藥物溶液，施加一定壓力，兩股液流經逐級混合、分流後， 生成具有藥物濃度梯度特徵的一系列溶液，並直接作用於下遊培養室中的 細胞。晶片置於細胞培養箱中，溶液始終保持以較小流速從濃度梯度生成 單元流向細胞培養單元。待一定時間後加入洗滌溶液，施加一定壓力，對 細胞進行洗滌。再加入標記溶液並施加一定壓力，對細胞進行標記。最後， 將晶片置於螢光顯微鏡下，進行細胞凋亡檢測。
實施例l
用圖l所示的微流控晶片進行細胞凋亡形態學變化研究。晶片接種肝癌 細胞(human hepatocellular carcinoma, HepG2)後置於37。C， 5%C02培養 箱中6小時。待細胞貼壁後，加入阿黴素濃度為0pM和4.0 |JM的DMEM 培養基(高糖)，晶片置於細胞培養箱中24h，並使溶液始終保持以較小流速 從濃度梯度生成單元流向細胞培養單元。加入磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗滌細胞，晶片置於光學顯微鏡下觀察。然後以lmgmL—' 的丫啶橙V溴化乙啶標記細胞，並立刻置於螢光顯微鏡下觀察。如圖2所示， 阿黴素誘導HepG2細胞發生凋亡，並呈現典型的細胞凋亡形態學變化細胞 皺縮，變圓，間距變大；凋亡細胞染色質凝聚，表現為橙-綠色斑點(圖中 箭頭所指)。此外，細胞形態改變程度隨著藥物作用濃度升高而明顯。
實施例2
用圖1所示的微流控晶片進行細胞凋亡時細胞膜變化研究。晶片接種 HepG2後置於37。C， 5%C02培養箱中6小時。待細胞貼壁後，加入阿黴素 濃度為0 pM和4.0 pM的DMEM培養基(高糖)，晶片置於細胞培養箱 中24h，並使溶液始終保持以較小流速從濃度梯度生成單元流向細胞培養單 元。加入PBS溶液洗滌細胞，加入標記液Annexin V / PI，晶片置於暗處 15min,最後晶片置於螢光顯微鏡下觀察。如圖3所示，阿黴素誘導HepG2 細胞膜呈現特徵性改變凋亡早期，位於細胞膜內側的磷脂醯絲胺酸(PS) 外翻，呈現綠色圓環( )；凋亡晚期細胞膜通透性增加，表現為紅色斑 點外包裹綠色圓環(O;壞死細胞為紅色(■)。此外，凋亡細胞比例隨 藥物濃度增加，而明顯增加。
實施例3
用圖1所示的微流控晶片進行細胞凋亡時線粒體膜電勢(MMP)變化 研究。晶片接種HepG2後置於37。C， 5%C02培養箱中6小時。待細胞貼 壁後，加入阿黴素濃度為0|jM禾卩4.0 |JM的DMEM培養基(高糖)，芯 片置於細胞培養箱24h，並使溶液始終保持以較小流速從濃度梯度生成單元 流向細胞培養單元。加入PBS溶液洗滌細胞，加入標記液羅丹明-123 (5|jg mL—1)，晶片置於培養箱中30min，再加入PBS溶液洗滌細胞，最後晶片置 於螢光顯微鏡下觀察。如圖4所示，阿黴素導致依賴MMP的Rh-123外洩， HepG2細胞螢光強度降低，畫P耗散，其程度隨著藥物作用劑量升高而增強。
注在以上三個實例中，所用的一些相同的條件為 接種時，細胞懸液濃度為2-5X10fi cell mL' o
權利要求
1、一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片，其特徵在於；晶片主要由兩個功能單元構成，第一個單元為一個樹狀的、從上至下逐層增加分支的濃度梯度生成單元，在其最上端設有藥物入口和培養基入口；每個分支的通道為迂迴的折線形；第二個單元為陣列式細胞培養單元，細胞培養單元由一個或一個以上的細胞培養室相互串聯作為一列，三列或三列以上相互並聯構成陣列式細胞培養單元，每兩列的出口逐級相互連接，最終連接成一個出口通道，該出口通道的末端作為細胞入口，在出口通道上設有衝洗液入口和染料入口；此外，在第一個單元和第二個單元之間有一排「幾」字形的壩結構，用於阻擋細胞流入第一個單元；所述「幾」字形的壩結構的「幾」字上端通道深度小於「幾」字下端兩側通道深度；位於晶片上遊的第一個單元最下層分支的每一個通道出口都通過一個「幾」字形的壩結構與位於晶片下遊的第二個單元中的一列細胞培養室入口相連接。
2、 按照權利要求l所述用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片，其特 徵在於第二個單元中的每一列細胞培養室的個數相同，並且每兩列細胞 培養室由微通道相連接，這些微通道再每兩個互相連接，最終連接成一個 通道。
3、 --種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片的應用，其特徵在於 使用權利要求l所述集成化微流控晶片，過程如下，將細胞懸液加入第二個單元細胞入口的儲液池中，施加壓力，待細胞 流入細胞培養室後，移走儲液池中的細胞懸液，並使晶片中溶液處於靜止 狀態；晶片在細胞培養箱中放置，置於顯微鏡下觀察細胞是否帖壁； 待細胞貼壁後向第一個單元處於藥物入口和培養基入口上方的兩個儲 液池中分別加入含有凋亡誘導劑最低濃度和最高濃度的培養基溶液，並使 溶液始終保持從上遊第一個單元流向下遊第二個單元，晶片置於細胞培養 箱中；一小時至三天後向第二個單元的洗滌液入口的儲液池加入洗滌溶液，施 加壓力，對細胞進行洗滌；在第二個單元的標記液入口的儲液池加入標記溶液，施加壓力，對細胞 進行標記；晶片置於螢光顯微鏡下，進行細胞凋亡檢測。
全文摘要
一種用於細胞凋亡研究的集成化微流控晶片及其應用，其主要由濃度梯度生成單元和陣列化細胞培養單元構成，位於晶片上遊的濃度梯度生成單元的每一個出口都通過一個壩形結構與位於晶片下遊的一列細胞培養室相連接。本發明創造性的在晶片上集成了藥物濃度梯度生成、晶片細胞培養、受激、洗滌、標記及多種細胞響應的檢測，並用於臨床藥物誘導腫瘤細胞凋亡過程研究。與傳統的多孔板技術相比，省去了配製不同濃度藥物溶液的繁冗操作，並大大簡化細胞接種、受激、洗滌和標記操作過程，顯著降低細胞和試劑耗量，並可一次運行獲得多個實驗相關參數。
文檔編號C12M1/00GK101168717SQ20061013402
公開日2008年4月30日 申請日期2006年10月25日 優先權日2006年10月25日
發明者欣 劉, 葉囡楠, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所