控制基因表達的表觀遺傳調控複合物的製作方法

2023-12-09 09:33:41

專利名稱：控制基因表達的表觀遺傳調控複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因表達的表觀遺傳調控領域。特別地，本發明涉及以控制基因體內 和體外表達為目標的、具有組蛋白甲基轉移酶活性的組合物和方法。
背景技術：
表觀遺傳學涉及由細胞或多細胞組織向其子代傳遞的、並非由基因的核苷酸序列 編碼的信息。通常通過對DNA或染色質結構的化學修飾實現表觀遺傳控制。例如，可以通 過對與基因組DNA結合的組蛋白進行甲基化和乙醯化以調節基因表達。組蛋白的甲基化和 乙醯化常發生在組蛋白的末端，此域為外露的表面並且由於具有大量如精氨酸(R)和賴氨 酸(K)的胺基酸殘基而帶有淨正電荷。組蛋白末端的化學修飾受具有組蛋白甲基轉移酶活 性(MTase)和組蛋白乙醯轉移酶活性(HAT)的酶調節。表觀遺傳修飾可發生在生物體正常發育的不同時段，並且也發生在正常細胞向癌 細胞轉化期間。此類修飾常造成特定基因的沉默或活化。大量文獻證明，在癌症中多數腫 瘤細胞都顯示出異常的DNA表觀遺傳印記(FeinbergAP & Vogelstein B, (1983)Nature 1 (5895) 89-92)。幹細胞是能夠在很大程度上進行自我更新並且能夠分化成祖細胞的細胞。就這一 點而言，幹細胞也是癌症起源的潛在因素。幹細胞可具有長的壽命，在此期間幹細胞發生的 遺傳突變和表觀遺傳修飾會增加其惡性化趨勢。根據假設，由於幹細胞所在的環境處於增 殖和分化的競爭性細微平衡中，微小而意義深遠的表觀遺傳變化能夠將所述平衡推向腫瘤 幹細胞表型一側。對調控表觀遺傳修飾的原因和方式的鑑定對於癌症的理解、檢測和治療， 尤其是對於腫瘤幹細胞的治療特別重要。實際上，人們認為復發和惡性癌症病例難以治療 的因素之一為所述癌症可能包含不對常規治療做出反應的腫瘤幹細胞。體細胞核移植(SCNT)被用於產生用於畜牧業生產(克隆或幹細胞治療)、蛋白質 生物製備和建立疾病模型的動物(Wilmut I, Beau jean N，de SousaPA，Dinnyes A, King TJ， Paterson LA, Wells DN, Young LE. (2002)Nature. OctlO ；419 (6907) :583_6)。與 SCNT 功 效和成功率相關的問題之一是體細胞基因組包含妨礙成功重編程(r印rogramming)的大 量穩定的表觀遺傳標記。此外，受體卵細胞可以包含發揮表觀遺傳作用的因子，這些因子也 會導致所述方法的失敗。因此，需要提供改進SCNT功效的組合物和方法，並以此通過這種 方式促進生物加工的應用。小鼠原始生殖細胞(PGC)的特化為分析體內表觀遺傳修飾作用提供了有吸引力 的實驗模型。首先在小鼠胚胎E7. 5期發現約45個PGC的起始群(Ginsburg，M. ,Snow,M. H. & McLaren, A. (1990) Development 110，521_8)。其後，這些 PGC 遷移並從 E10. 5 期起進入生 殖脊，在生殖脊中對生殖細胞繼續執行進一步的大量表觀遺傳程序。在E13. 5期，雌性體內 生殖細胞進入減數分裂前期，而雄性體內生殖細胞在雄性腺中進入有絲分裂阻滯。PGC特化後馬上發生顯著的表觀遺傳修飾，包括分別通過HMTase和HAT對組蛋 白末端進行甲基化和乙醯化(Surani et al. , 2004 (CSHSymposium) ；Seki et al. ,2004 ；Lachner, M. , 0 『 Sullivan，R. J. & Jenuwein，T. (2003)J Cell Sci 116,2117-24 ；和 Vaquero, A. ,Loyola,A. & Reinberg,D. (2003) Sci Aging Knowledge Environ 2003,RE4)o 在假定能調控PGC的這些表觀遺傳變化的候選基因中有屬於保守性SET/TO域蛋白質家族 的 HMTase。因此，需要提供改進細胞內表觀遺傳調控機制控制的試劑和方法。特別地，需要可 以更好地控制基因表達的組合物和方法以影響幹細胞和癌細胞的細胞命運決定。

發明內容
本發明的第一個方面提供了包含至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一 域和至少一個具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二域的分離多肽複合物，其中所述第二域能 夠甲基化位於組蛋白H2A末端區域的精氨酸殘基。在本發明的一個具體實施方案中，所述第二域具有精氨酸甲基轉移酶活性，可提 供精氨酸殘基的對稱性NG，N' G-二甲基化，如位於組蛋白H2A末端區域第3位點的精氨 酸殘基(H2AR3)的對稱性NG，N' G-二甲基化。任選地，所述第二域還能夠甲基化位於組 蛋白H4末端區域的精氨酸殘基，如位於組蛋白H4末端區域第3位點的精氨酸殘基(H4R3)。 在本發明的一個實施方案中，精氨酸甲基轉移酶活性歸屬於Prmt5精氨酸甲基轉移酶域或 其衍生物或同源物。根據本發明，所述第一域能夠特異性地靶向結合於哺乳動物基因組DNA中參與基 因表達控制的一個或多個共有序列。此類位點通常位於但不限於非編碼啟動子區、非翻譯 區或內含子中。在一個具體實施方案中，本發明的DNA結合域能夠結合PRDI/Blimpl型結 合位點，此類結合位點為具有四個GGGAAAG基序的共有序列，其中兩個基序位於靶基因的 5'-啟動子區，另外兩個基序位於轉錄起始位點的下遊。適合地，DNA結合域包含Blimpl 蛋白質，PRDI/Blimpl多肽的DNA結合部分，或其同源物或其衍生物。本發明的第二個方面提供了適於誘導多肽複合物在哺乳動物細胞中表達的核酸 表達載體構建物，所述載體包含可操作性地連接於啟動子序列的一個或多個編碼序列，其 中，所述一個或多個編碼序列編碼至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一多肽域和 至少一個具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特異性地靶向結合哺 乳動物基因組DNA中參與基因表達控制的一個或多個共有序列，而所述第二域具有精氨酸 甲基轉移酶活性，可向位於多肽底物中的精氨酸殘基提供對稱性NG，N' G- 二甲基化。依照本發明的一個具體實施方案，所述多肽底物是組蛋白。任選地，所述第二多肽 域能夠甲基化位於組蛋白H2A末端區域第3位點的精氨酸殘基(H2AR3)，並且也能夠甲基化 位於組蛋白H4末端區域的精氨酸殘基。適合的表達載體包括質粒、粘粒、病毒載體和如YAC的人工染色體。啟動子序列可 任選選自組成型啟動子或誘導型啟動子。適合的誘導型啟動子包括特徵明顯的Tet或三苯 氧胺調控系統。其它的系統可包括熱激敏感型啟動子。在本發明的一個實施方案中，所述表達載體包含表達盒，在所述表達盒中，第一編 碼序列編碼第一多肽域，而第二編碼序列表達第二多肽域。任選地，所述第一編碼序列編碼 PRDI/Blimpl多肽，而第二編碼序列編碼Prmt5多肽。在一個具體實施方案中，通過一個或 多個插入序列分隔所述第一和第二編碼序列是有利的。所述一個或多個插入序列可適當地包含至少一個內部核糖體進入位點(IRES)，以促進細胞中第一和第二編碼序列的雙順反子 表達。本發明的表達載體還可以包含一個或多個核酸序列，該序列編碼選自選擇標記、抗生 素抗性標記和報告子的多肽。本發明的第三個方面提供了控制哺乳動物細胞中基因表達的方法，包括誘導細胞 中多肽複合物的形成，其中所述多肽複合物包含至少一個具有位點特異性DNA結合活性的 第一域和至少一個具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位 於組蛋白H2A末端區域的精氨酸殘基。在一個具體實施方案中，通過在細胞中誘導PRDI/ Blimpl多肽或其同源物或其衍生物的表達來誘導細胞中多肽複合物的形成。在一個具體實施方案中，通過使用編碼Blimpl多肽或其衍生物或同源物的表達 載體轉染細胞來誘導細胞內PRDI/Blimpl多肽的表達。任選地，通過使用上文所述的表達 載體轉染細胞來誘導細胞內PRDI/Blimpl多肽的表達。典型的哺乳動物細胞為來自組織的 或細胞系形式的人類細胞。在本發明的一個具體實施方案中，所述哺乳動物細胞為腫瘤細 胞或細胞系或癌細胞或細胞系。合適地，本發明此方面的方法可在體外或體內實施。在本發明的一個具體實施方案中，基因表達控制導致一個或多個選自以下組 的基因的表達控制c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xyltl、DnaHl、Baip2、Nek7、Dusp2、 ENSMUSG00000027041、Sirt4和Blimpl的。在細胞中誘導所述多肽複合物會導致這些基因 中一個或多個基因的表達降低。本發明的第四個方面提供了促進幹細胞自我更新並抑制其分化的方法，該方法包 含抑制幹細胞中Blimpl/Prmt5複合物的形成。所述幹細胞可任選為哺乳動物幹細胞，合適 的幹細胞是人類幹細胞。在本發明的一個具體實施方案中，所述幹細胞選自成體幹細胞、始 祖幹細胞和多能幹細胞。應當了解的是，本發明無意於人類的生殖性克隆或以促進人類生 殖性克隆為目的而操作或使用人類胚胎。在本發明此方面的一個具體實施方案中，通過使幹細胞接觸Blimpl抑制劑化 合物、Prmt5抑制劑化合物和/或Blimpl/Prmt5複合物抑制劑化合物來抑制所述細胞中 Blimpl/Prmt5複合物的形成。適合的抑制劑化合物可選自小分子抑制劑、與BlimplmRNA 或Prmt5mRNA結合的siRNA分子、與BlimplmRNA或Prmt5 mRNA結合的反義寡核苷酸以及 Blimpl或Prmt5多肽的負顯性形式。本發明的另一方面提供了控制細胞中Prmt5定位，特別是內源Prmt5定位的方法， 該方法包括在所述細胞中誘導Blimpl多肽的表達，從而誘導細胞中Blimpl/Prmt5複合物 的形成。在細胞中誘導的Blimpl可以是內源Blimpl或外源Blimpl。適合的細胞可以是哺 乳動物幹細胞。本發明的另一方面提供了本發明的多肽複合物以及包含上述表達載體構建物的 細胞(適合的細胞為哺乳動物/人類細胞)在治療癌症中的用途。附圖簡述

圖1 (a)顯示E7. 5-E12. 5期間小鼠生殖細胞特化和發育的關鍵事件的總結；(b) 顯示通過兩個代表性起始PGC(灰色)和兩個體細胞(白色)的單細胞cDNA PCR的候選 SET/PR域基因表達分析。黑色區域表明檢測到PGC和體細胞中的表達。圖2 顯示免疫沉澱(IP)的小鼠Blimpl複合物具有精氨酸甲基轉移酶活性。(a) 在293T細胞中表達Myc標記的小鼠Blimpl或相應的對照，使用抗Myc抗體通過Western
7印跡分析Myc免疫沉澱物；(b)使用同樣的免疫沉澱物用於針對純化組蛋白H3、H2A和重組 H2A(rH2A)的HMTase分析，分別顯示其螢光圖(F)和麗春紅染色膜⑵；(c)放射性同位素 標記rH2A的微測序，X軸表示rH2A中第1位至第14位的胺基酸，Y軸表示以每分鐘次數 (cpm)計的單個胺基酸殘基的[3H]摻入；和(d)顯示H4和H2A. 1氨基最末端序列保守性的 比對。圖3 顯示生殖細胞中Blimpl和Prmt5的重疊表達形成特異的H2A/H4R3me圖譜。 (a、b、c)顯示通過抗81111^1(￡1)、抗？1~1^5 03)和抗Prmtl(c)特異性抗體免疫染色而檢測到 的不同發育階段PGC中Blimpl、Prmt5和Prmtl的表達圖譜，使用抗Stella/PGC7、抗0ct4 或抗TG1/SSEA1抗體檢測到的生殖細胞，與DAPI染色的DNA圖像一起形成的複合圖像；(d、 e)顯示在293T細胞中表達Myc標記的小鼠Blimpl或相應的對照；使用抗Prmt5抗體(anti Prmt5)、抗Myc 抗體(anti Myc)或抗Prmtl 抗體(anti Prmtl)通過Western 印跡分析Myc、 Prmt5或Prmtl免疫沉澱物，信號標記(*)為非特異性信號；(f)使用抗H4R3me2s抗體通過 所示不同發育階段PGC的免疫染色來分析生殖細胞中H2A/H4 R3的甲基化；使用抗階段特 異性標記物(即0ct4或TG1/SSEA1)的抗體對生殖細胞進行共染色；與DAPI染色的DNA圖 像一起形成複合圖像；比例尺10 y m (各圖的比例相同)。圖4 顯示基因座Dhx38內Blimpl/Prmt5結合元件的體內鑑定。(a)Dhx38轉錄 起點(TS)和起始密碼子(ATG)附近推定的Blimpl結合位點的位置，(A、B、C、D)顯示用於 ChIP分析的擴增序列；(b)ChIP分析中內源Prmt5與基因座Dhx38的基因組DNA的相互作 用，使用抗Prmt5抗體或IgG抗體(anti-IgG)免疫沉澱E10. 5胚胎單獨生殖嵴細胞提取物 的上清(s)或細胞核(n)部分，使用末端基因組DNA(+)和水(-)作為對照。圖5 顯示將Blimpl和Prmt5由細胞核轉移到細胞質後生殖細胞中Dhx38的表達 上調，造成H2A/H4R3me2s修飾水平的下降；在所示發育階段生殖脊的冷凍切片上進行(a) Dhx38、(b)Blimpl 和 Prmt5 以及(c)H2A/H4R3me2s 的免疫染色；使用抗 Prmt5、抗 Myc 或 抗Prmtl特異性抗體檢測生殖細胞；與DAPI染色的DNA圖像一起形成複合圖像；比例尺 10ym(各圖的比例相同)。圖6 顯示多能EG和胚胎癌(EC)細胞中Blimpl、Prmt5和Dhx38的分析。(a)對 EG細胞進行的Blimpl、Prmt5和Dhx38免疫染色；與DAPI染色的DNA圖像一起形成複合圖 像，注意Dhx38和Blimpl表達之間的反向關係；(b)對ES、EG或EC(P19)提取物中Blimpl 和0ct4的Western印跡分析；(c)Myc標記的小鼠Blimpl在所示P19多能EC細胞中的表達； 使用抗Prmt5、抗Myc或抗Prmtl抗體通過Western印跡分析Prmt5免疫沉澱物，使用抗微 管蛋白抗體檢測起始物(input)上樣量相等的泳道中的微管蛋白水平，發現向EC(P19)細 胞中引入Blimpl時Dhx38受到抑制；(d)通過ChIP分析發現在Myc-Blimpl轉染的EC (P19) 細胞中Dhx38基因座上H4R3me2s水平增加；使用抗Myc或抗H4R3me2s抗體免疫沉澱來自 P19細胞的細胞提取物；A、B、C、D是指如圖4所示的Dhx38基因座中包含Blimpl結合位點 的區域。圖7 顯示(a)由圖1所示E7. 5期PCR表達篩選所得候選SET/TO域基因的免疫 螢光分析，其中使用抗特異性組蛋白甲基轉移酶的特異性抗體對從E8. 5期胚胎分離的細 胞進行免疫染色，使用生殖細胞特異性抗體(抗0ct4或抗Stella/PGC7抗體)檢測生殖細 胞；(b)使用相應抗體在E8. 5期PGC中免疫共染色Blimpl和Prmt5，通過組織非特異性鹼性磷酸酶(AP)的表達標記生殖細胞；與DAPI染色的DNA圖像一起形成複合圖像；比例尺 10ym(各圖的比例相同)。圖8 顯示抗H4R3me2s抗體的特徵描述；可以使用單甲基基團(a)，對稱排列的雙 甲基基團(b)或不稱排列的雙甲基基團(c)修飾精氨酸；先使用帶有對稱脫甲基化R3的 H4合成肽產生抗H4R3me2s抗體(Abeam )，然後進行Western印跡分析測定其特異性；(d) 所述抗體針對有或沒有與Blimpl-Myc免疫沉澱物(即Myc-Blimpl或Myc)溫育的小牛胸 腺組蛋白(H4、H3、H2A、H2B)進行的Western印跡，和(e)在與包含未經修飾的、R3me2s和 R3me2a的H4多肽進行競爭性試驗後，所述抗體仍能高效識別對稱二甲基化的肽。
具體實施方案在詳細闡明本發明之前，提供有助於理解本發明的多個定義。本文引用的所有文 獻通過參考方式全文併入本文。除非另有定義，否則本文使用的科技術語具有本發明所屬 領域普通技術人員通常理解的含義。本文所用術語「重編程」是指改變或除去細胞核中表觀遺傳修飾的步驟。重編程 有利於降低細胞命運定型，並以此降低細胞整體並尤其是細胞核的分化狀態。大體而言， 重編程包括使分化的或定型的體細胞核回復到胚胎細胞、生殖細胞或幹細胞具有的基因表 達、表觀遺傳和功能狀態。體細胞核的重編程是如SCNT等程序優選的第一步驟，其對於控 制細胞分化狀態(潛能)的其它程序也很重要。本文所用術語「癌」是指位於腫瘤內的或具有與腫瘤相關的性質的組織或細胞。腫 瘤通常具有區別於正常組織和正常細胞的特徵。這些特徵包括但不限於退變程度、細胞形 態改變、形狀的不規則性、細胞粘附性的降低、轉移能力、血管新生水平的升高、細胞侵襲性 的增加、細胞凋亡水平的下降和細胞惡性化的普遍增加。與「癌(cancer) 」相關且通常具有 相同含義的術語包括肉瘤、惡性腫瘤(carcinoma)、瘤(tumor)、上皮瘤、白血病、淋巴瘤、息 肉、轉化、腫瘤和類似術語。術語「表觀遺傳修飾」是指基因組的化學標記。表觀遺傳標記可包括DNA甲基化 (印記)以及與DNA相連蛋白質(例如，組蛋白)的甲基化和乙醯化。由於表觀遺傳修飾， 經常在哺乳動物中觀察到親源特異性基因的表達(來自母系或父系染色體)。在親本種系 中，表觀遺傳修飾可導致穩定的基因沉默或活化。「生物加工」是指使用活細胞或其組分生產所需終產物的技術。在本發明中，可 通過細胞的表觀遺傳修飾增強這些細胞用於生物加工的能力。典型的生物加工技術包括 SCNT。本文所用術語DNA結合域和/或精氨酸甲基轉移酶的「衍生物或同源物」是指分 別與本發明分子具有基本相似的序列同一性的mRNA和多肽。認為衍生物和同源物包含來 自其它物種所述序列的直系物以及仍具有高水平等價功能的突變體。所述「基本相似的序 列同一性」是指序列相似性水平為約50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %至約99 %的同一性。 可以使用常規方法(Henikoff and Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. USA1992 ；89 10915 ； andAltschul et al.，Nucleic Acids Res. 1997 ；25 :3389_3402)測定序列同一性百分比。 或者，本發明多肽的同源物可以是能夠在高、中或低嚴格條件下具有與本文所述序列雜交 能力的那些序列。
所用術語「表達載體」是指可將合適大小的另一 DNA序列片段整合到其內部的線 性或環狀DNA分子。此類DNA片段可包括用於所述DNA序列片段編碼基因轉錄的其它片 段。所述其它片段可包括但不限於啟動子、轉錄終止子、增強子、內核糖體進入位點、非翻 譯區、多聚腺苷酸信號、選擇性標記、複製起點等類似物。表達載體通常衍生自質粒、粘粒、 病毒載體和酵母人工染色體，載體通常是包含多個來源的DNA序列的重組分子。在用於如表達載體等的DNA序列時，術語「可操作性連接」是指對序列進行排列使 其合作發揮功能，從而達到其預期目的，即啟動子序列可啟動轉錄並通過所連接的編碼序 列直至終止信號。「多核苷酸」是指單鏈或雙鏈的共價連接的核苷酸序列，其中通過磷酸二酯鍵連接 各個核苷酸的3'和5'末端。所述多核苷酸可由脫氧核糖核酸鹼基或核糖核酸鹼基組成。 多核苷酸包括DNA和RNA，並且可通過體外合成或由天然來源分離製備。多核苷酸的大小通 常表示為雙鏈多核苷酸中鹼基對(bp)的數目，或在單鏈多核苷酸的情況下，表示為核苷酸 (nt)的數目。lOOObp或lOOOnt等於1千個鹼基(kb)。長度小於約40個核苷酸的多核苷 酸通常被稱為「寡核苷酸」。本文所用術語「啟動子」是指基因中可與轉錄因子和/或RNA聚合酶結合以控制 相關編碼序列表達的區域。啟動子通常但不總位於基因的5'-非編碼區和翻譯起始密碼 子的上遊。基因的啟動子區域可包含一個或多個共有序列，其作為DNA結合蛋白的序列特 異性DNA結合域的可識別結合位點。此外，此類結合位點也可位於啟動子外的區域，例如位 於內含子中的增強子區域或位於編碼序列的下遊。應用於多肽或多肽複合物時，術語「分離」是指從其天然起源的生物體中移出的多 肽。優選的分離多肽基本不含有其起源生物體蛋白質組中固有的其它多肽。最優選的分離 多肽為至少95%純度的形態，更優選大於99%的純度。在本文中，術語「分離」意在包括處 於不同物理形態的相同多肽，無論所述多肽是天然形態、變性形態、二聚/多聚、糖基化、結 晶化或衍生的形態。而本文提及使用的「複合物」包括第一和第二多肽域包含在單個多肽 鏈中的情況，以及第一和第二域包含在彼此非共價結合的分別的多肽鏈中的情況，還有形 成翻譯後共價鍵以將單獨的域連接起來從而形成結合功能單位的情況。在本發明的一個實施方案中，提供了 Blimpl和Prmt5的新型複合物，所述新型復 合物能夠通過表觀遺傳控制機制調控哺乳動物細胞中的基因表達。體細胞通常沿分化途徑由較低特化度發育成較高特化度或定型狀態。較低特化度 的體細胞可顯示出作為始祖幹細胞產生多種不同細胞類型的能力。以特定幹細胞作為祖細 胞產生這些不同細胞類型的量通常被稱為這種幹細胞的「潛能」。因此，多能幹細胞可作為 很多不同分化細胞類型的祖細胞。如果一種細胞可分化成體內的所有細胞，則是全能細胞。 如果一種細胞可分化成大多數細胞類型，則是多能細胞。因為能夠產生除胚外組織(即滋 養外胚層)之外哺乳動物的大多數細胞類型，所以胚胎幹細胞通常被稱為多能細胞。本發 明提供了在基因表達控制水平控制細胞命運決定的方法。本發明的蛋白質複合物在表達或 引入哺乳動物細胞時，可使細胞命運決定遠離多能性。相反地，在幹細胞中抑制本發明蛋 白質複合物的活性或僅抑制Blimpl組分的活性可使細胞命運決定傾向於多能性和自我更 新。本發明可應用的另一個相關領域是癌症治療。即使不是全部也是大多數癌症都發
10生表觀遺傳變化，其包括腫瘤抑制基因的顯著下調和沉默以及致癌基因的上調。腫瘤抑制 基因的重新活化由於能夠下調致癌基因從而可改善癌症表型。因此，控制體內基因表達和 細胞命運決定的方法是一種很有前景的癌症治療途徑。B淋巴細胞誘導的成熟蛋白(Blimpl)Blimpl是包含5個DNA結合鋅指基序的lOOkDa蛋白質(GENBANK登錄 號NM_007548)。Blimpl的人類同源物被稱為PRDI-BF1或PRDM1 (GENBANK登錄號 NM_000198)。最初，通過細胞因子IL-2和IL-5處理後B細胞淋巴細胞系(BCL1)的消減篩選 來分離Blimpl cDNA。Blimpl的異常表達足以導致BCL:細胞的終末分化。Blimpl被認為是 終末 B 細胞發育的「總調節因子」 (Yu J.et al. (2000)Mol. Cell. Biol. 20(7) :2592_2603)。在人體中，小鼠Blimpl的人直系物PRDI-BF1能夠與H3賴氨酸甲基轉移酶G9a形 成複合物。現已證明這種複合物能夠通過染色質介導的機制在基因的啟動子區域沉默人幹 擾素 3 (IFN-3 )基因(Gyory I. et al. (2004)Nat. Imm. 5 :299_308)。現已發現Blimpl與參與表觀遺傳修飾的因子形成複合物。包含Blimpl和組蛋白 脫乙醯化酶(HDAC)的複合物被認為通過組蛋白末端賴氨酸殘基的脫乙醯化來改變核小體 結構並抑制基因轉錄。由於賴氨酸殘基的乙醯化可有效中和其正電荷，因而脫乙醯化會恢 復其帶電性，並且由於硬脂酸和其它作用會導致核小體結構的修飾。Blimpl 的已知靶標包括 c-Myc、IFN-3、CD23、CD22、II 類 MHC、BSAP (Pax5)、早期 B細胞因子和CIITA。所有這些基因均被Blimpl轉錄抑制。B細胞分化期間c-Myc基因的 轉錄被Blimpl抑制，c-Myc基因是BCQ淋巴細胞中Blimpl的重要靶標。Blimpl對c_Myc 啟動子的抑制需要Blimpl分子中的多個區域，包括N-末端酸性區和第99位與第464位氨 基酸之間的區域(Yu J. et al.，見上文)。致癌蛋白c-Myc對於生長控制、凋亡和/或分化的調節至關重要，並且其失調還是 多種腫瘤的起因。B細胞中c-Myc的表達失調常常是致瘤的。c-Myc基因至Ig基因座的染 色體易位出現於大多數的人類Burkitt淋巴瘤和鼠漿細胞瘤中(Lin K. I. et al. , (2000) Mol. Cell Biol. (20)23:8684-8695)。可以通過LIF/STAT3依賴性信號維持小鼠ES細胞作為多能性、自我更新群。現已 證明STAT3調控Myc轉錄因子的表達。還認為成體幹細胞需要Myc的活化。RT-PCR分析 表明ES細胞中Myc的轉錄提高。ES細胞通常需要包含LIF的培養基，否則ES細胞會傾向 於分化而不是自我更新。現已發現從培養條件中除去LIF後，ES細胞中的Myc水平迅速下 降，說明LIF可能是ES細胞分化的必要條件。實驗表明與LIF相當水平的Myc獨自能維持 ES細胞的狀態(即，多能表型)，並且在Myc失活時，幹細胞群減少(CartwrightP. et al., (2005) Development 132:885—896)。蛋白質精氨酸甲基轉移酶5(Prmt5)已知有兩類組蛋白甲基轉移酶(HMTase)，其包含主要發現於具有賴氨酸特異性甲 基化酶活性的蛋白質中的SET(Suvar3-9，Enhancer of Zeste, Trithorax)域，或發現於 PRMT的精氨酸特異性甲基化酶催化域。PRMT可被分成I型和II型1型PRMT催化精氨酸殘 基的單甲基化和不對稱的脫甲基化，而II型PRMT催化形成單甲基化和對稱二甲基化的精 氨酸。在六種已知的PRMT中，只有PRMT5 (GENBANK登錄號NM_006109 (人)；NM_013768(小 鼠))表現為可以靶向組蛋白的II型PRMT。特別地，現已發現PRMT5靶向H3和H4N-末端
11的特定精氨酸殘基。PRMT5可結合基於BRG1和hBRM的hSWI/SNF染色質重塑複合體。在此類複合體中， PRMT5具有通過甲基化組蛋白H3中第8位精氨酸殘基(H3R8)刺激細胞生長和非錨定依賴 性生長的能力，並以此降低如ST7和匪23等已知具有腫瘤抑制作用的基因的表達(Richard S. et al.，(2005)Biochem. J. 388 :379_386)。現已發現 PRMT5 還參與 CYCLINE 和 CAD 的轉 錄抑制。Blimpl/Prmt5 複合物因為尚未發現Blimpl本身具有特異的組蛋白甲基轉移酶活性，因此本發明人著 手鑑定BlimplSET/ra域可能具有的活性。發明人現已證明Blimpl能夠與PRMT5形成新型 複合物，在體內所述複合物持續存在於小鼠生殖細胞譜系中直至PGC進入生殖脊，這表明 Blimpl在哺乳動物早期生殖細胞譜系中具有持續的作用。下文更詳細的描述進一步分析表 明新型Blimpl/Prmt5複合物通過甲基化組蛋白H2A和H4產生獨特的表觀遺傳特徵。可以 相信，這個證據首次證明組蛋白H2A末端甲基化是表觀遺傳調節的機制。此外，下文更詳細 描述的實驗證明多能EG和ES細胞中存在Prmt5而不存在Blimpl。Blimpl在多能EC細胞系P19中的表達導致對已知在多能細胞中高水平表達的基 因的抑制。該實驗表明Blimpl/Prmt5複合物是重要的基因表達調控因子，並且可對細胞命 運選擇產生顯著影響，特別是多能性和分化方面。因此，發明的一個實施方案提供了在利用 生物活性(如Blimpl/Prmt5複合物在體外和體內的生物活性)的基礎上進行基因控制的 機制。儘管不希望受理論的束縛，發明人相信由於具有5個鋅指DNA結合域，Blimpl可以 在所述複合物中提供基因靶向功能。Prmt5在定位到DNA時可作為HMTase提供精氨酸甲基 轉移酶活性，從而導致基因表達的抑制。已知Blimpl的人類直系物可結合到人IFN-3啟 動子區域的 PRDI 位點上(Keller A. D. & Maniatis T. (1991)Genes Dev. 5 :868_879)。如上 所述，也發現Blimpl能夠抑制c-Myc的表達。依照本發明，現已鑑定出作為Blimpl/Prmt5 複合物特異性靶標的新基因亞群，這些基因的表達可受到所述新型複合物的調控。此亞群 包括具有不同功能的基因，而這些基因被認為在調節細胞潛能、細胞周期、分化、細胞粘附、 表觀遺傳重編程以及可能的腫瘤抑制方面起重要作用。根據本發明，Blimpl/Prmt5抑制複合物的存在與生殖細胞中高水平的H2A/ H4R3me2s相關。然而，在B細胞向漿細胞分化的期間，Blimpl靶向G9a依賴性H3K9me2。 因此，Blimpl能夠通過結合不同的結合伴侶指導多種細胞命運的決定和性質，而染色質重 塑可能是這些過程的核心。Blimpl除在小鼠生殖細胞特化早期中具有明顯重要作用之外， 本發明證明如在PGC特化後生殖細胞中所觀察到的那樣，Blimpl還參與染色質獨特表觀遺 傳特徵的形成。然而，E10. 5期後，當在生殖細胞中檢測到大量的基因組範圍內的編程時， Blimpl/Prmt5脫離PGC細胞核進入細胞質。因此，對Blimpl/Prmt5複合物、H2A/H4第3 位精氨酸的對稱性二甲基化以及隨後生殖細胞中大量基因組範圍內的重編程三者之間關 系的認識，使得對此關鍵過程的潛在機制以及如何在細胞內控制核重編程有了更深入的了 解。本發明還使得對Blimpl/Prmt5在多能胚胎生殖腺(EG)細胞中的功能有了更深入 的了解，其中由PGC向EG細胞的演變過程與Blimpl的缺失明顯相關。本發明提供了直接證據證明，Blimpl對抑制新生和使PGC遠離獲得明顯的多能幹細胞樣表型是至關重要的。 因此，Blimpl/Prmt5活性的激動劑和拮抗劑可分別在調節細胞命運決定遠離或傾向於多能 性表型的方面起重要作用。此外，細胞內的Blimpl表達提供了一種機制以削減Prmt5的核 內精氨酸甲基轉移酶活性並使其遠離潛在的細胞質底物。此種作用在幹細胞分化期間以及 所需細胞或細胞系的一般細胞周期進程中是有利的。本發明中作為Blimpl和/或Prmt5抑制劑使用的特定核酸小分子是被稱為小幹 擾RNA(siRNA)的小片段雙鏈RNA。此類幹擾RNA (RNAi)技術可在體內選擇性地使基因功能 失活。在本發明中，可使用RNAi敲除細胞內Blimpl和/或Prmt5的表達。在此方法中，雙 鏈mRNA被RNA酶dicer識別並切割，從而產生長度為21-23個核苷酸的RNAi片段。這些 RNAi可與RNA誘導的沉默複合物(RISC)結合，並被RISC解旋。隨後，反義單鏈引導RISC接 近包含互補序列的mRNA，從而對所述mRNA進行核酸內切酶切割(Elbashir et al.，(2001) Nature 411 ;494_498)。因此，此技術提供了在體細胞中靶向降解Blimpl和/或Prmt5 mRNA 的方法，所述體細胞將應用於生物加工或需要提高其自我更新的多能性表型中。本領域中 已有關於產生靶向Prmt5的siRNA技術的描述(Richard S.，見上文)。靶向人PRMT5的合 適siRNA序列的實例包括5' -CTCATTTGCTGACAATGAA-3『 [SEQ ID NO 1]5' -GGACCTGAGAGATGATATA-3『 [SEQ ID NO 2]5' -GTTTCAAGAGGGAGTTCAT-3『 [SEQ ID NO 3]本發明的Blimpl/Prmt5複合物也可用於鑑定與其在細胞環境中相互作用的其它 蛋白質和多肽。可使用鑑定蛋白質間相互作用的常規方法(例如，酵母雙雜交篩選)來鑑 定Blimpl/Prmt5複合物相互作用活性的潛在激動劑和拮抗劑。鑑定抑制Blimpl與Prmt5 結合的小分子也在本發明的範圍之內，例如，通過掩蔽或破壞與Blimpl中已知直接與其它 蛋白質相互作用的那些域之間的相互作用來抑制Blimpl與Prmt5結合的小分子(Yu J. et al.，見上文)。可使用如BIAcore 等技術研究blimpl、Prmt5和/或Blimpl/Prmt5複合 物蛋白質與蛋白質間的相互作用或蛋白質與小分子間的相互作用，其中BIAcore 使用表 面等離子共振檢測分子間相互作用(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ 另參見www, biacore. com)。可通過自動化高通量篩選方法來篩選與Blimpl/Prmt5複合物結合的分子和蛋白 質。因此，本發明提供了通過檢測Blimpl/Prmt5複合物和靶分子之間陽性結合相互作用來 鑑定與Blimpl/Prmt5複合物相互作用的分子的方法。可使用進一步的篩選步驟測定所鑑 定的陽性結合相互作用是否具有藥理學重要性，即靶分子是否能夠調節Blimpl、Prmt5和/ 或Blimpl/Prmt5複合物的生物學活性或功能。如果鑑定出具有正調控作用的分子，則將此 分子列為「命中」，並隨後將其作為潛在的候選藥物進行評定。此時或之前可考慮其它因素， 例如所述分子的吸收、分布、代謝和排洩(ADME)、生物利用度和毒性特徵。如果潛在的藥物 分子滿足藥理學需要，則可被認為是藥學上相容的。可配製合適的組合物以依照本領域已 知的標準方法測試其體外和體內活性。實施例方法和試劑胚胎分離從遠系小鼠MF1不同發育階段的胚胎中分離原始生殖細胞。將陰栓形成的當天記為 E0. 5。由先前公布的文獻(Saitou, M.，Barton, S. C. &Surani, M. A. (2002) Nature 418，293-300)建立單細胞 cDNA 文庫。免疫染色使用胰蛋白酶處理切好的包含生殖細胞的胚胎片以製備單細胞懸浮 液。隨後，將細胞放置在包被有聚(L-賴氨酸)的載玻片上，用2%PFA固定並用PBS清 洗3次，以進行下一步處理。將E11.5期的完整胚胎生殖脊切下，用PBS清洗，用4% PFA 在4°C下固定2小時，用PBS清洗，並在4°C下於20%蔗糖中放置過夜。將所得物包埋在 0. C. T(BDH)中並冷凍切片。使用IF緩衝劑(PBS ；0. 1 % Triton ； 10mg/mL BSA)對單細 胞或切片進行滲透處理。在4°C下與一抗溫育過夜，隨後用IF緩衝劑清洗3次，並與二 抗(Alexa564、Alexa 488，Molecular Probes)在室溫下溫育2小時，並用PBS清洗。隨 後在含 DAPI 的 Vectashields (Vector laboratories)中封固(mount)載玻片。使用 BioRad Radiance 2000共聚焦顯微鏡觀察免疫螢光。使用了以下抗體和稀釋液PGC7 (T. Nakano 產；1:2500)、0ct4(BD Transduction Laboratories ；1:200)、TGI (小鼠生殖細胞 特異性抗 SSEA1 單克隆抗體；1:1)、Blimpl(K. Calame 產；1:10)、Prmt5 (Upstate ；1:250)、 Prmtl (Upstate ； 1 200)、H4R3me2s (Abeam ； 1 1000)、Dhx38/Prpl6 (Proteintech Group ；
1 200)、Ezh2 (Upstate ； 1 50)、G9a (Abeam ； 1 100)、Pfml (Abeam ； 1 50)、Setl (得自 ff. Herr ； 1 200)免疫沉澱試驗和核提取物的製備通過RT-PCR擴增小鼠Blimpl的編碼區，並 將產物克隆到pcDNA3-MycHisA中以獲得pCMV-MycBlimpl構建物。使用PBS清洗轉染有 原始載體(稱為pCMV-Myc)和pCMV-MycBlimpl的293T或P19細胞，並在IP緩衝液(包 含 150mMNaCl、l % NP40.0. 1 % Triton,50mM Tris(pH 8. 0)和完全蛋白酶抑制劑混合 物(Roche))中裂解所述細胞。通常免疫沉澱反應使用2xl07個細胞。將全細胞提取物與
2ii g的Myc抗體(New England Biolabs) 一同溫育。或者使用抗Prmt5或抗Prmtl抗體 (Upstate)在4°C下溫育過夜。隨後，加入30y L蛋白A/G的瓊脂糖微珠，在4°C反應2小 時。用IP緩衝劑清洗所述微珠5次。通過在Laemli樣品緩衝劑中煮沸以洗脫被結合的蛋 白。根據廠商的使用說明(細胞核提取試劑盒；Active Motif)製備ES、EG或P19細胞的 核提取物，每次上樣使用25 u g核部分。體外甲基轉移酶檢測將從轉染有pCMV-Myc或pCMV-MycBlimpl的293T細胞免疫 沉澱試驗中獲得的微珠用HMTase緩衝劑(25mM NaCl,25mMTris, pH 8.8)再次清洗兩次， 並用於稍作改良的如文獻16所述的HMTase檢測。簡要而言，將1 P g的H3或H2A (Roche) 或重組H2A(A.Brehm惠贈)作為底物，2yCi的S-腺苷_L_[甲基-3H]蛋氨酸([3H]SAM； AmershamBiosciences)作為甲基供體，兩者在20 ii L的HMTase緩衝液混合物中於37°C 溫育3小時。將蛋白溶解於18% SDS-PAGE凝膠中，轉移到PDVF膜上，並通過麗春紅染色 和螢光顯影得到可視化。通過連續Edman降解法(Protein andNucleic acid Chemistry Facility, Cambridge University,UK)在體外對甲基化rH2A進行微測序，隨後通過閃爍計 數法測定單個胺基酸中3H的摻入。為了檢測H2A/H4特異性甲基化，在存在有免疫沉澱的 Blimpl複合物和上述SAM的條件下，將H4、H3、H2A和H2B (Roche)溫育，並使用抗H4R3me2s 抗體(Abcam ，Cambridge, UK)進行Western印跡分析，其中檢測H4R3me2s抗體的特異性 已經通過競爭試驗得到檢測(參見所附數據圖8)。染色質免疫沉澱(ChIP)克隆和ChIP 在室溫下將單細胞懸液在1 %甲醛中交聯10分鐘。隨後將這些細胞破碎，並在50mM Tris(pH8. 0)、lOmMEDTA、1 % SDS中裂解細胞核， 隨後進行超聲破碎。如上文所述，對所述提取物進行免疫沉澱，同時加入純化的IgG(Santa Cruz)作為陰性對照。隨後，微珠在50mM NaHC03>l% SDS中洗脫兩次，所得上清在65°C下用 蛋白酶K處理5小時，然後進行苯酚/氯仿純化和乙醇沉澱。隨後，使用以下引物(正向引物 1 ccaggaggggtttcatcaactg(SEQ ID No. 4)禾口反向弓丨物 1 :tgttaccgtctcacttggtgtttg(SEQ ID No. 5)；正向弓| 物 2 :acctcacaactgctgggattac(SEQ ID No. 6)禾口 反向弓| 物 2 ttcgttttctgcgtccgtg(SEQ ID No. 7)；正向弓丨物 3 :tttgtcgcagtgtcttatcgtaac(SEQ ID No. 8)和反向引物 3 :taggaaggtgttggggaggg(SEQ ID No. 9)；正向引物 4: atgaggtttgagaagtgtggc (SEQ ID No. 10)禾口 J^ 向弓 L 4 :atcagcggtggtggtgacagc (SEQ ID No. 11))，通過標準的 PCR 反應分析 PRMT5(Upstate)或 H4R3m32 (Abeam )的 ChIP 樣品。當 用於ChIP克隆試驗時，使用抗Myc抗體進行連續兩輪免疫沉澱。之後，DNA沉澱經T4DNA聚 合酶平端化，然後連接到退火的JW102和JW10325上。隨後，使用JW102通過PCR擴增所述連 接產物(55°C 2min、72°C 5min、94°C 2min 的 1 個循環，94°C 30s、55°C 30s、72°C lmin 的 20個循環，和72°C 5min的最後一個循環)。將PCR產物克隆到pGEM_T (Promega)中，通過 PCR檢測菌落的插入物，並通過標準方法對產物進行測序。隨後，使用如Ensembl (http:// www, ensembl. org)的在線生物信息資源進行BLAST檢索。實施例1 :Blimpl活性的鑑定小鼠PGC特化後馬上發生顯著的表觀遺傳修飾，包括分別通過甲基轉移酶 (HMTase)和乙醯轉移酶(HAT)對組蛋白末端進行甲基化和乙醯化。在可能對PGC中這 些表觀遺傳變化進行調控的候選基因中有屬於保守性SET/TO域蛋白質家族的HMTase。 在E7. 5PGC和周邊體細胞中對25個含有SET/TO域的候選基因進行了表達分析，並發現 Blimpl、G9a、Setl、Ezh2和Pfml在包含PGC的胚胎區域中表達(圖lb和圖7)。然而，只 有Blimpl的表達被限定於E7. 5期PGC，其後在生殖細胞中持續表達。為了研究Blimpl SET/TO域的活性，首先要確定使用抗Myc抗體可以使293T細胞 中瞬時表達的帶Myc標記小鼠Blimpl被有效地免疫沉澱(圖2a)。隨後，利用免疫沉澱物 對組蛋白H3進行標準放射性組蛋白甲基轉移酶試驗(Rea，S. et al. , (2000) Nature406, 593-9)。在H3的對應位置觀察到相對較弱的信號，但令人驚訝的是，在組蛋白H2A和H4的 對應位置還檢測到顯著條帶(圖2b)，通過Western印跡(數據未出示)確定後者是H3制 備物中存在的低水平汙染。推斷體外H3位置的微弱信號可能是由先前在B細胞中報導的 Blimpl相關G9a造成的(Gyory et al.，見上文)。然而，生殖細胞並不顯現出顯著的組蛋 白H3第9位賴氨酸的二甲基化(H3K9me2 ；這是G9a造成的初級修飾)，也未發現G9a功能 損失在可檢測的程度上影響PGC的特化。因此，決定將重點落在觀察到的免疫沉澱Blimpl 對組蛋白H2A和H4的活性上。基於H2A末端甲基化的新發現，決定首先檢測免疫沉澱物對小牛胸腺和重組H2A 製備物的甲基轉移酶活性，並發現所述免疫沉澱物對這種組蛋白具有強烈的甲基化活性 (圖2b)。對甲基轉移酶試驗的放射性標記重組蛋白產物進行連續Edman降解，以測定H2A 末端的胺基酸殘基靶標。由釋放胺基酸片段的閃爍計數法檢測rH2A R3的放射性標記(圖 2c)。使用小牛胸腺和重組H4製備物獲得了相同的結果(數據未出示)。考慮到組蛋白H2A 和H4的N-末端起始幾個殘基間的胺基酸序列保守性(圖2d)，這一發現是一致的。已知，
15H4 R3甲基化在轉錄調節中起重要作用。然而，這些結果預示著存在對組蛋白H2A上R3的 其它新型甲基化。實施例2 :Blimpl/Prmt5複合物的鑑定由於SET/TO域與僅在賴氨酸殘基上的組蛋白甲基轉移酶活性相關，可以推定上 述檢測到的精氨酸甲基轉移酶活性可能不歸於Blimpl，並且必然暗示免疫沉澱物中存在 其它HMTase。先前已有報導稱兩種蛋白質精氨酸甲基轉移酶Prmtl和Prmt5介導組蛋白 H4 R3的甲基化。Prmtl是在不同類型底物上產生NG-單甲基精氨酸(Rmel)和不對稱NG， N' G- 二甲基精氨酸(Rme2a)的I型精氨酸甲基轉移酶。如上所述，Prmt5屬於II型精氨 酸甲基轉移酶，負責精氨酸的單甲基化(Rmel)和對稱性NG，N' G-二甲基化(Rme2S)(圖 8)2°。使用上述單細胞cDNA文庫分析新生PGC和周邊體細胞中這些蛋白的表達，以檢測這 些蛋白之一是否能在體內與Blimpl結合。發現E7. 5期PGC中不存在Prmtl，而Prmt5則 出現在PGC和體細胞內(數據未出示)。但在蛋白質水平上，Prmt5顯示出核染色，並且與 從E8. 5期起的體細胞相比高度富集於PGC中(圖3a、圖3b;圖Sib並參考下文)。另一方 面，檢測到Prmtl主要在這些階段的生殖細胞的細胞質中。接著，決定研究與Blimpl相互作用的是否是Prmt5或Prmtl。實際上，發現Myc標 記的Blimpl能夠有效地在免疫共沉澱293T細胞中的內源性Prmt5(圖3d)。反之，Prmt5也 可以沉澱Myc標記的Blimpl (圖3d)。相反，對Myc標記的Blimpl和內源Prmtl的檢測未 發現兩者之間的任何相互作用(圖3e)。這些試驗確認在293T細胞中Blimpl和Prmt5能 夠形成複合物。考慮到這些蛋白在PGC中的重疊表達(圖3a、圖3b ；圖Sib)，可推定Blimpl 和Prmt5是PGC中同一蛋白質複合物的一部分，並且所述複合物也可在發育過程中出現在 其它部位或成體的正常組織和腫瘤組織中。實施例3 :Blimpl/Prmt5複合物在體內的活性測試針對H4R3me2s產生的抗體的特異性，結果顯示所述抗體可高效識別來自小 牛胸腺的組蛋白H2A和H4(圖8b左側；H2A和H4也作為汙染物出現在H3和H2B製備物 中)。在競爭試驗中，此抗體被包含R3me2s的H4(1_9C)多肽有效地滴定(圖S2c)。此外， 此抗體還識別H4和H2A的Blimpl/Prmt5HMTase試驗產物(圖S2b右側)，因此進一步證明 這是由所述複合物造成的Prmt5的對稱性二甲基化活性而不是Prmtl的不對稱二甲基化活 性。使用H2/H4R3me2s修飾的特異性抗體通過免疫細胞化學方法分析從早期胚胎分 離的PGC。在E8. 5期的PGC和體細胞中均可見明顯的H2A/H4R3me2s(圖3f)，但是E10. 5 期，主要在生殖細胞中觀察到較多的H2A/H4R3me2s積累(圖3f)。然而，在使用識別單甲基 化和/或不對稱二甲基化的H4R3 (H4R3mel和H4R3me2a)的抗體時，發現PGC中的此類修飾 發生在E8.5期而不是E10.5期(數據未出示)。將兩種抗體所得的數據組合可見，從E8. 5 期至E10. 5期，PGC中趨向於H2A/H4R3me2s的發展。這些結果說明生殖細胞發育期間存在 特異染色質特徵，認為這是由於Prmt5和Blimpl同時存在的結果。重要的是注意到，有多 種其它的組蛋白末端修飾對生殖細胞的特異染色質狀態起作用。現已發現，Blimpl的功能 損失導致停止增殖的起始PGC樣細胞異常發育(Ohinata, Y. et al. , (2005) Nature 5，5)。實施例4 :Blimpl/Prmt5複合物體內靶標的鑑定如上所述，Blimpl可通過將相互作用因子招募到特定位點來引導細胞分化期間的基因調控。採用染色質免疫沉澱克隆法鑑定推定的Blimpl靶標，其中首先在293T細胞中 過表達Myc標記的Blimpl。隨後，使用抗Myc抗體免疫沉澱來自這些293T細胞的核提取 物，提取免疫沉澱的DNA並純化，由連接接頭平滑化，經PCR擴增並克隆。選擇多個克隆，並 通過測序進行分析，隨後通過BLAST分析對克隆插入物進行定位。在32個克隆中，有11個 克隆與已知基因的可能調控序列之內或其附近的區域相對應(參見表1)。表 1 實施例5 :Blimpl/Prmt5複合物對Dhx38基因表達控制的特徵描述在被鑑定的Blimpl推定靶標之中，選擇Dhx38進行進一步的研究。Dhx38是編碼 含有RNA解旋酶的DEAH盒的保守基因(也稱為Prpl6)，在線蟲(C. elegans)精子向卵母細 胞轉化期間其對性別決定基因的翻譯後調控至關重要(Graham，P. L. & Kimble，J. (1993). Genetics 133,919—31)。在仔細檢查Dhx38基因座時發現其包含與Blimpl共有結合位點對應的4個 GGGAAAG基序；其中兩個位於5'-區域，另兩個位於轉錄起始位點的下遊(圖4a)。雖然 現有的抗Blimpl抗體在免疫染色過程中有效，但其不能有效免疫沉澱Blimpl (數據未出 示)。因此，使用Prmt5確定Dhx38是否是Blimpl/Prmt5在生殖細胞內的靶標。使用抗 Prmt5抗體對E10. 5期胚胎生殖脊細胞懸液中包含的PGC進行ChIP試驗，其中E10. 5期是 Blimpl和Prmt5在生殖細胞核中共表達的時期(見上文)。實際上確實發現抗Prmt5抗體 能夠沉澱所選的+7152至+7541位核苷酸序列，該序列包含Dhx38基因的、包含Blimpl共 有結合位點的第11個外顯子(圖4b)。在本ChIP試驗中，其它3個推定的結合位點不與所 述抗Prmt5抗體結合。這些結果說明Prmt5被招募到如Dhx38的Blimpl靶標，並由此說明 Blimpl/Prmt5複合物調控生殖細胞中此類靶基因的表達。基於Dhx38是Blimpl/Prmt5複合物在生殖細胞中的靶標的證據，對PGC中Dhx38 的表達/抑制進行了研究。發現在E10.5和E11.5期檢查不到Dhx38(圖5a)。然而，在 E12. 5期雌性和雄性PGC中Dhx38均被上調(圖5a)，這明顯地伴隨著E11. 5期生殖細胞 中Prmt5和Blimpl從細胞核到細胞質的重新定位而發生(圖5b)。在E12. 5期，Prmt5和 Blimpl均不存在於PGC細胞核中(數據未出示)。雌性和雄性生殖細胞中緊隨Dhx38上調 之後分別是減數分裂和有絲分裂阻滯。因此，Blimpl/Prmt5和Dhx38的表達之間具有反向 關係。這些結果說明Blimpl和Prmt5可在生殖細胞中對如Dhx38等靶基因起到轉錄抑制的 作用。這種抑制作用在生殖細胞進入生殖脊且Blimpl和Prmt5完成細胞核至細胞質的轉移
17後開始減弱。應注意到組蛋白精氨酸甲基化主要與轉錄激活相關，雖然最近發現Prmt5相 關的H3R8me活性與基因表達下降有關(Pal S. et al.，見上文)。此外，據先前報導Blimpl 和Prmt5都是轉錄抑制因子，因此，本文所述生殖細胞中Blimpl/Prmt5複合物相關的對稱 性精氨酸二甲基化可能會促進基因抑制。實施例6 多能幹細胞中的Blimpl_Prmt5複合物決定檢查多能胚胎生殖細胞(EG)以進一步了解Blimpl/Prmt5的作用。EG細胞 可衍生自體外的分離PGC，因此被認為是等價於PGC的最接近的細胞系。已發現EG細胞也 是Prmt5陽性，但與PGC不同，其缺乏Blimpl (圖6a和圖6b)。與此觀測結果一致的是發現 EG細胞也是Dhx38陽性，這表明Dhx38基因的表達可能歸因於Blimpl的缺失(圖6a和圖 6b)。在EG細胞中過表達Myc標記的Blimpl以重建Blimpl/Prmt5抑制複合物。然而，此 類嘗試在細胞轉染僅12小時後即導致強烈的細胞毒性，而由pCMV-Myc轉染的對照EG細胞 的細胞存活能力則沒有受到影響(數據未出示)。在多能胚胎幹細胞(ES)中也獲得了類似 的結果(數據未出示)。隨後，選擇具有類似於EG和ES細胞的多能性特徵的多能小鼠胚胎癌(EC)細胞系 P19。與ES/EG類似，P19細胞的確顯示出Prmt5和Dhx38的表達，但沒有表達Blimpl (圖 6b和圖6c)。然而，發現這些細胞能夠耐受Blimpl的表達，因此可用於免疫沉澱，而在所述 免疫沉澱中的確證實過表達的Myc-Blimpl與小鼠EC細胞中內源Prmt5之間存在相互作用 (圖6c)。特別地，在P19細胞中此瞬時表達的Blimpl/Prmt5複合物隨後導致了 Dhx38的 下調(圖6c)。ChIP分析證實所述Dhx38的下調伴隨著Dhx38基因座上H2A/H4R3me2s水 平的升高(圖6d)。這些觀察印證了 Blimpl/Prmt5複合物是造成如Dhx38等靶基因抑制的 觀點，這也可能在PGC中存在。雖然本文詳細公開了本發明的具體實施方案，但這些以實施例方式的公開僅出於 說明的目的。上述實施方案並非有意限制以下權利要求書的範圍。發明人認為對本發明進 行的多種替換、變更和改進均不脫離權利要求書規定的本發明的精神和範圍。
權利要求
一種分離多肽複合物，其包含至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一域和至少一個具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋白H2A末端區域的精氨酸殘基。
2.如權利要求1所述的多肽複合物，其中所述第二域具有精氨酸甲基轉移酶活性，提 供精氨酸殘基的對稱性NG，N' G-二甲基化。
3.如權利要求1和2任一項所述的多肽複合物，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋 白H2A末端區域中第3位點的精氨酸殘基(H2AR3)。
4.如以上權利要求中任一項所述的多肽複合物，其中所述第二域還能夠甲基化位於組 蛋白H4末端區域的精氨酸殘基。
5.如權利要求4所述的多肽複合物，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋白H4末端區 域第3位點的精氨酸殘基(H4R3)。
6.如以上權利要求中任一項所述的多肽複合物，其中所述精氨酸甲基轉移酶活性歸屬 於Prmt5精氨酸甲基轉移酶域或其衍生物或其同源物。
7.如以上權利要求中任一項所述的多肽複合物，其中所述第一域特異性地靶向結合於 哺乳動物基因組DNA中參與基因表達控制的一個或多個共有序列。
8.如權利要求7所述的多肽複合物，其中所述第一域特異性地結合於PRDI/Blimpl型 共有結合位點。
9.如以上權利要求中任一項所述的多肽複合物，其中所述第一域包含PRDI/Blimpl多 肽、PRDI/Blimpl多肽的DNA結合部分、或其衍生物。
10.一種分離多肽，其包含具有位點特異性DNA結合活性的第一域和至少一個具有精 氨酸甲基轉移酶活性的第二域，其中所述第一域特異性地靶向結合於哺乳動物基因組DNA 中參與基因表達控制的一個或多個共有序列，並且所述第二域具有精氨酸甲基轉移酶活 性，其提供精氨酸殘基的對稱性NG，N' G- 二甲基化。
11.如權利要求10所述的分離多肽，其中所述第一域特異性地結合於PRDI/Blimpl型 共有結合位點。
12.如權利要求10或11所述的分離多肽，其中所述精氨酸甲基轉移酶活性歸屬於 Prmt5精氨酸甲基轉移酶域或其衍生物或其同源物。
13.適於誘導哺乳動物細胞中多肽複合物表達的核酸表達載體構建物，所述載體包含可操作性地連接於啟動子序列的一個或多個編碼序列，其中，所述一個或多個編碼序 列編碼至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一多肽域和至少一個具有精氨酸甲基 轉移酶活性的第二多肽域，其中所述第一域特異性地靶向結合於哺乳動物基因組DNA中參 與基因表達控制的一個或多個共有序列，而所述第二域具有精氨酸甲基轉移酶活性，向位 於多肽底物中的精氨酸殘基提供對稱性NG，N' G- 二甲基化。
14.如權利要求13所述的表達載體，其中所述多肽底物是組蛋白。
15.如權利要求13和14任一項所述的表達載體，其中所述第二多肽域能夠甲基化位於 組蛋白H2A末端區域中第3位點的精氨酸殘基(H2AR3)。
16.如權利要求13-15中任一項所述的表達載體，其中所述第二多肽域還能夠甲基化 位於組蛋白H4末端區域的精氨酸殘基。
17.如權利要求16所述的表達載體，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋白H4末端區 域第3位點的精氨酸殘基(H4R3)。
18.如權利要求13-17中任一項所述的表達載體，其中所述精氨酸甲基轉移酶活性歸 屬於Prmt5精氨酸甲基轉移酶域或其衍生物或其同源物。
19.如權利要求13-18中任一項所述的表達載體，其中所述第一域特異性地靶向結合 於哺乳動物基因組DNA中參與基因表達控制的一個或多個共有序列。
20.如權利要求19所述的表達載體，其中所述第一域特異性地結合於PRDI/Blimpl型 共有結合位點。
21.如權利要求20所述的表達載體，其中所述第一域包含PRDI/Blimpl多肽、PRDI/ Blimpl多肽的DNA結合部分、或其衍生物。
22.如權利要求13-21中任一項所述的表達載體，其中所述啟動子是誘導型啟動子。
23.如權利要求13-21中任一項所述的表達載體，其中所述啟動子是組成型活性啟動子。
24.如權利要求13-23中任一項所述的表達載體，其中所述載體包含表達盒，在所述表 達盒中第一編碼序列編碼第一多肽域，第二編碼序列表達第二多肽域。
25.如權利要求24所述的表達載體，其中所述第一編碼序列編碼PRDI/Blimpl多肽，所 述第二編碼序列編碼Prmt5多肽。
26.如權利要求13-24中任一項所述的表達載體，其中所述第一編碼序列和第二編碼 序列通過一個或多個插入序列分隔。
27.如權利要求26所述的表達載體，其中所述一個或多個插入序列包含至少一個內部 核糖體進入序列(IRES)。
28.如權利要求13-27中任一項所述的表達載體，其還包含一個或多個核酸序列，所述 核酸序列編碼選自選擇標記、抗生素抗性標記和報告子的多肽。
29.控制哺乳動物細胞中基因表達的方法，其包括在所述細胞中誘導多肽複合物的形 成，其中所述多肽複合物包含至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一域和至少一個 具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二域，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋白H2A末端區 域的精氨酸殘基。
30.如權利要求29所述的方法，其中通過在細胞中誘導PRDI/Blimpl多肽或其同源物 或其衍生物的表達來誘導細胞中所述多肽複合物的形成。
31.如權利要求30所述的方法，其中通過使用編碼Blimpl多肽或其衍生物或其同源物 的表達載體轉染細胞，從而在所述細胞中誘導PRDI/Blimpl多肽的表達。
32.如權利要求30所述的方法，其中通過使用如權利要求13-28中任一項所述的表達 載體轉染細胞，從而在所述細胞中誘導PRDI/Blimpl多肽的表達。
33.如權利要求29-32中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是人類細胞。
34.如權利要求29-33中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是腫瘤細胞或癌 細胞。
35.如權利要求29-34中任一項所述的方法，其中所述方法在體外進行。
36.如權利要求29-34中任一項所述的方法，其中所述方法在體內進行。
37.如權利要求29-36中任一項所述的方法，其中所述基因表達控制導致對選自於c-Myc、Dhx38、Pcdh7、Q8C9T7、Xyltl、DnaHl、Baip2、Nek7、Dusp2、ENSMUSG0000002704U Sirt4和Blimpl的一個或多個基因的表達控制。
38.如權利要求37所述的方法，其中細胞中多肽複合物的誘導導致權利要求37中列出 的一個或多個基因表達的下降。
39.促進幹細胞自我更新並抑制其分化的方法，其包含抑制所述幹細胞中Blimpl/ Prmt5複合物的形成。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述幹細胞是哺乳動物幹細胞。
41.如權利要求39和40中任一項所述的方法，其中所述幹細胞是人幹細胞。
42.如權利要求39-41中任一項所述的方法，其中所述幹細胞選自成體幹細胞、始祖幹 細胞和多能幹細胞組成的組。
43.如權利要求39-42中任一項所述的方法，其中通過使所述幹細胞接觸Blimpl抑制 劑化合物、Prmt5抑制劑化合物和/或Blimpl/Prmt5複合物抑制劑化合物來抑制所述幹細 胞中Blimpl/Prmt5複合物的形成。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述抑制劑化合物選自以下組成的組小分子抑 製劑、與Blimpl或Prmt5mRNA結合的siRNA分子、與Blimpl或Prmt5mRNA結合的反義寡核 苷酸以及Blimpl或Prmt5多肽的負顯性形式。
45.控制細胞中Prmt5定位的方法，其包括誘導細胞中Blimpl多肽的表達，從而誘導細 胞中Blimpl/Prmt5複合物的形成。
46.如權利要求45所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物幹細胞。
47.權利要求1-12中任一項所述的分離多肽複合物在癌症治療中的應用。
48.權利要求1-12中任一項所述的分離多肽複合物在製備癌症治療藥物中的應用。
49.細胞，其包含權利要求13-28中任一項所述的表達載體。
50.如權利要求49所述的細胞，其為哺乳動物細胞。
51.如權利要求50所述的細胞，其為人類細胞。
全文摘要
一種包含至少一個具有位點特異性DNA結合活性的第一域和至少一個具有精氨酸甲基轉移酶活性的第二域的表觀遺傳調控多肽複合物，其中所述第二域能夠甲基化位於組蛋白H2A末端區域的精氨酸殘基。所述複合物能夠調控細胞內基因表達，特別是通過控制組蛋白H2A和H4末端區域中R3的甲基化調控哺乳動物幹細胞中的基因表達。所述複合物的實例包括具有Blimp1的DNA結合活性和Prmt5的精氨酸甲基轉移酶活性的多肽複合物。
文檔編號C07K14/47GK101855343SQ200780021848
公開日2010年10月6日 申請日期2007年5月8日 優先權日2006年5月5日
發明者烏爾麗克·朗格, 卡蒂婭·安瑟蘭, 彼得拉·哈伊科娃, 阿齊姆·蘇拉尼 申請人:劍橋實業有限公司