附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法及所用生物膜取樣裝置的製作方法

2023-05-02 06:04:11

專利名稱：附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法及所用生物膜取樣裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種硫酸鹽還原菌定量檢測方法及該方法中專用的生物膜取 樣裝置。
背景技術：
目前，硫酸鹽還原菌(SRB)的檢測方法主要集中在三個層面 一是傳統
的檢測方法，包括培養法以及顯微鏡直接計數法，前者是通過選擇性培養基， 在適宜的培養條件下對樣品中的細菌進行培養進行活細菌的計數，主要包括平
板菌落計數法、最可機率計數法(most probable number (MPN)，亦稱為倍比 稀釋法)等；而顯微鏡直接計數法是適時、快速、準確地測定細菌總量，主要 包括光學顯微鏡、螢光顯微鏡等技術，混濁度(比濁)計數法、電阻抗法以及 流式細胞儀測定法等；二是基因層面，基於SRB種屬的16S rDNA序列的定性 檢測，如基因晶片以及FISH技術對SRB的定量和定性檢測，APS還原酶基因 和異化型亞硫酸鹽還原酶基因進行定性檢測；三是蛋白層面，主要是通過免疫 吸附的原理得以實現，如基於APS還原酶的SRB的快速檢測試劑盒。上述現有 的檢測方法不適於附著型硫酸鹽還原菌的定量檢測。
油田系統中硫酸鹽還原菌的計數主要是針對的汙水流動相中的硫酸鹽還 原菌一非附著型硫酸鹽還原菌。目前對於非附著型的油田系統內硫酸鹽還原菌 (SRB)的計數主要執行中國石油天然氣行業標準"油田注入水細菌分析方法 ——絕跡稀釋法"(部頒標準)、SY-T0532-93。上述方法存在的問題是檢測 需要十四天的時間，由於檢測周期較長，不能有效、即時地指導生產實踐，在 實際操作過程中有些嚴格的厭氧SRB菌無法生存，導致SRB菌的記數結果不準 確，不能真實的反映生產實際情況，同時檢測費用較高。
授權公告號為CN 100348731C、授權公告日為2007年11月4日的發明專 利提出了一種油田水質硫酸鹽還原菌的定量檢測方法;授權公告號為CN 1003了2943C、授權公告日為2008年3月5日的發明專利$#出了一種硫酸鹽還 原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法；上述現有技術中均沒有提到附著型硫酸鹽還原菌的定量檢測方法。因非附著型的油田系統內硫酸鹽還原菌(SRB) 的定量檢測方法存在檢測周期較長致使記數結果不準確等問題而無法適於附 著型硫酸鹽還原菌的定量檢測，現有技術中又沒有專門提出對附著型硫酸鹽還 原菌的定量檢測方法，因此針對罐壁和管壁上的硫酸鹽還原菌一附著型硫酸鹽 還原菌的檢測還沒有開展。然而在實際的生產中附著型的硫酸鹽還原菌是造成 油田腐蝕和硫化物產生的重要原因。因此，對附著型硫酸鹽還原菌的檢測更加 具有重要的意義。

發明內容
本發明為了解決現有的硫酸鹽還原菌檢測方法無法實現附著型硫酸鹽還 原菌的快速、較準確的定量檢測，且現有的硫酸鹽還原菌檢測方法費用較高的 問題；而提供了一種附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法及所用生物膜取樣裝 置。
本發明解決技術問題所採用的技術方案是附著型硫酸鹽還原菌定量檢測 方法是按照以下步驟實現的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內壁 上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側壁上打通 L，再將 生物膜取樣裝置安裝在所述通孔處，並使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管 體的內側壁平齊，並保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充 分成膜後即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體製備將所述探頭上 的生物膜剝離至配製的溶液中製成菌體；步驟三、將步驟二中製備好的菌體進 行倍比稀釋；步驟四、進行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴增儀上的擴增； 步驟六、擴增產物於質量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測；步驟七、結果觀察， 查表記數。
前面所述方法的實現必須藉助生物膜取樣裝置才能實現，該取樣裝置包括 主體、探頭壓緊總成、固定件和控制閥，所述取樣裝置還包括探頭，所述探頭 的上端設有臺肩，壓緊總成位於主體的上端，探頭依次穿過探頭壓緊總成、主 體，探頭通過固定件固裝在主體的上端面上，探頭上端的臺肩搭接在探頭壓緊 總成的上端面上，探頭壓緊總成安裝在主體上設有定位臺肩上，控制閥安裝在 主體的下端側壁上。
本發明具有以下有益效果本發明實現了附著型硫酸鹽還原菌的快速、較準確的定量檢測。本發明的方法記數更加準確，可以精確到一個菌體，有效地 縮短了計數時間，整個發明從做樣到出結果只需要四個小時，遠遠小於十四天
的記數時間，真實的表證了水樣的實際的SRB菌的數量，準確的反應了當時生 產實際情況、可以直接有效的指導生產，同時還降低了檢測費用。運用本發 明裝置可有效取得罐壁和管壁的附著生物膜，本發明裝置還具有結構簡單的優 點。本發明適於油田水系統中常規汙水、含聚汙水、地面工藝的水處理過程中 管壁、罐壁等附著型硫酸鹽還原菌(SRB)的快速定量檢測，也可以用於各種 生物膜、結構物中等含有附著型硫酸鹽還原菌的環境樣本的檢測。


圖1為本發明所述生物膜取樣裝置的結構示意圖，圖2是本發明所述生物 膜取樣裝置的探頭從管道取出後的結構示意圖，圖3是探頭的結構示意圖，圖 4是本發明的具體實施例的現場工藝流程框圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法是 按照以下步驟實現的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內壁上附著 的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側壁上打通孔，再將生物膜 取樣裝置安裝在所述通孔處，並使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內 側壁平齊，並保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜 後即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體製備將所述探頭上的生物 膜剝離至配製的溶液中製成菌體；步驟三、將步驟二中製備好的菌體進行倍比 稀釋；步驟四、進行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴增儀上的擴增；步驟 六、擴增產物於質量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測；步驟七、結果觀察，查 表記數。本實施方式所述的步驟二至步驟七為現有技術，授權公告號為CN 100372943C、授權公告日為2008年3月5日的發明專利提出了一種"硫酸鹽 還原菌直接倍比稀釋PCR快速定量檢測方法"，在該專利中對步驟二至步驟七 的內容均有披露。
具體實施方式
二本實施方式所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法是
按照以下步驟實現的
步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內壁上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側壁上打通孔，再將生物膜取樣裝置安裝在所 述通孔處使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內側壁平齊，並保持在線 安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜後即可取下生物膜；
步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體製備將所述探頭上的生物膜剝離至配製的 溶液中製成菌體；具體包括以下步驟a、將取下的生物膜放入裝有lmL去離 子水且經滅菌的1.5mL的離心管中；b、將離心管在震蕩器上充分震蕩5min， 13000r/min離心lmin，從管中輕輕的棄上清液0. 9mL; c、在剩餘的0. lmL中 加入"菌體前處理緩衝液"(DNA前處理緩衝液)0.9mL，在震蕩器上充分震蕩 5min; d、 13000r/min離心2min，棄上清液0. 98mL (剩餘20 u 1)，充分震蕩 2 min，製備完畢短時間內(0 1天)在4'C條件下保存即可，長時間(大於 1天)不用在-2(TC條件下保存；所述"菌體前處理緩衝液"的母液成分為 70gNaCi、 2gKci、 12g Na2HP04、 2g KH2P0" 1%。 SDS;將母液稀釋10倍成為 菌體前處理緩衝液；控制工作液的pH為7.5，在12rC條件下滅菌15 30min 後即可。
步驟三、將步驟二中製備好的菌體進行倍比稀釋吸取2ul步驟二中得 到的菌體加入用於倍比稀釋的管中，加入18ul的去離子水，然後在從中取2 P1進行下一步的稀釋，依次從上管中取樣1加入下一個用於倍比稀釋的 管中，加入18 y 1的去離子水，直到選擇稀釋的倍數(或最終水樣被稀釋十倍)；
步驟四、進行冰上的PCR操作所述進行冰上的PCR操作過程中的PCR 反應體系為20lil:包括Buffer (10X) 2ul、 0. 3咖o1 L-1的dNTP 2 u 1、 濃度為0. 1 " mol L/1的正向弓l物SRBF 1 u 1、濃度為0.1 u mol U1的反向引 物SRBR lul， rTaq酶0.3U，其餘加去離子水11. 7 y 1 ，然後加2ul的樣品 (步驟二中得到的菌體)；所述正向引物SRBF的硫酸鹽還原菌特意性探針的鹼 基組成為5， -CCTGACGCAGCGACGCCG-3，，共18bp;反向引物SRBR的硫酸鹽 還原菌特意性探針的鹼基組成為5， -CTACCAGGGTATCTAATCC-3，，共19bp;
步驟五、PCR在擴增儀上的擴增擴增程序為94。C預熱5min， 94。C變性 30s， 58.8。C復性45s， 72。C延伸90s，循環30次，最後72。C延伸10min，整 個擴增程序需要2個小時16分鐘；
步驟六、擴增產物於質量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳檢測，需要一個小時;
步驟七、結果觀察，查表記數。
具體實施方式
三本實施方式在步驟一中所述生物膜取樣裝置保持在線安 裝在罐體或管體的側壁上15天。其它步驟與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式在進行冰上的PCR操作過程中採用三管或五
管平行法，每個梯度3個或5個樣。本發明的方法試驗結果表明，三管平行法
記錄的結果無論在水樣低濃度或高濃度的情況下，數量級上與五管平行法無差
別。重要在於五管平行法記錄的結果更加準確，置信度大於99%。五管平行法 SRB-MPN-PCR法記數的結果與用硫酸鹽還原菌細菌檢測試劑瓶(北京華興化學 試劑廠)14天的記數結果相比數量級上平均大102，更能反應水樣中實際的SRB 菌的數量。其它步驟與具體實施方式
一、二或三相同。授權公告號為CN 100348731C、授權公告日為2007年11月4日的發明專利提出了一種"油田水 質硫酸鹽還原菌的定量檢測方法"；授權公告號為CN 100372943C、授權公告 日為2008年3月5日的發明專利提出了一種"硫酸鹽^S原菌直接倍比稀釋PCR 快速定量檢測方法"；上述兩件專利均披露了三管或五管平行法的技術方案。
具體實施方式
五如圖1 3所示，本實施方式的生物膜取樣裝置包括主 體4、探頭壓緊總成5、固定件2和控制閥3 (帶螺旋扣的水閘)，所述取樣裝 置還包括探頭1，所述探頭1的上端設有臺肩1-1，壓緊總成5位於主體4的 上端，探頭1依次穿過探頭壓緊總成5、主體4，探頭1通過固定件2固裝在 主體4的上端面上，探頭1上端的臺肩1-1搭接在探頭壓緊總成5的上端面上， 探頭壓緊總成5安裝在主體4上設有定位臺肩4-1上，控制閥3安裝在主體4 的下端側壁上。探頭壓緊總成5的作用是防止探頭1被罐體或管體6內的液體 的壓力將探頭l頂出。在使用時，先在罐體或管體6的側壁上打通孔，再將生 物膜取樣裝置安裝在所述通孔處使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的 內側壁平齊，並保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成 膜後即可取下生物膜。把探頭上的菌膜剝離至配製的溶液中，震蕩後保存。生 物膜取樣裝置是附著型硫酸鹽還原菌快速定量檢測得以實現關鍵所在，它解決 了附著型硫酸鹽還原菌無法取樣的難題，是後續檢測的前提條件。
具體實施例
試驗以採油三廠北三三脫水站地面處理系統為測試點，開展了管壁和罐壁 附著型SRB含量測定研究。現場將測試組件(包括生物膜取樣裝置)分別安裝在北三三脫水站沉降罐出口和入口、北三一三沉出口和入口、北三一外輸水匯
管出口和入口上，現場工藝流程參見圖4，測試結果見表l。採用改良後的SRB 培養基進行記數。
根據生長結果計算菌膜中的SRB含量，現場附著型SRB含量測定結果， 由表1可見，管壁上有大量的SRB菌附著生長，在一定程度上表明，同一管道 中管壁SRB菌的數量相對大於汙水中的數量，通過安裝在管壁上的檢測裝置與 絕跡稀釋法(MPN)聯用，實現了管壁和罐壁上的附著型SRB菌的定量檢測，該 技術在生產中已經得到應用。同行也是目前細菌記數中只監測汙水中、流動相 中的附著型SRB，並沒有監測附著型SRB，現場附著SRB含量測定結果顯示， 系統的管壁上有大量的SRB附著生長，這一研究結果也證實了室內SRB菌群種 類及生長特性研究的結論，即油田地面系統中存在附著生長的SRB和非附著生 長的SRB。對於指定硫酸鹽還原菌的系統控制方法，具有非常重要的意義，改 變了以往的"殺菌方案"治標不治本的問題。
_表l採油三廠附著型SRB含量測試結果_
測試部位 管壁 汙水 測試部位 管壁 汙水
_(個/cm2)(個/mL)_(個/cm2)(個/niL)
脫水站罐入口 1.0X 1061.5X 103脫水站罐出口2.5X106 2.0X103
沉降罐入口 4. 8X106 4. 5X 103 沉降罐出口 6.0X106 7.5X103 外輸水匯管入口 1.0X 106 1.25X 103外輸水匯管出口1.3X106 1.5X10權利要求
1、一種附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法，其特徵在於它是按照以下步驟實現的步驟一、用生物膜取樣裝置取下罐體或管體內壁上附著的含有硫酸鹽還原菌的生物膜先在罐體或管體的側壁上打通孔，再將生物膜取樣裝置安裝在所述通孔處，並使生物膜取樣裝置上的探頭與罐體或管體的內側壁平齊，並保持在線安裝10-20天，待硫酸鹽還原菌在所述探頭上充分成膜後即可取下生物膜；步驟二、硫酸鹽還原菌的菌體製備將所述探頭上的生物膜剝離至配製的溶液中製成菌體；步驟三、將步驟二中製備好的菌體進行倍比稀釋；步驟四、進行冰上的PCR操作；步驟五、PCR在擴增儀上的擴增；步驟六、擴增產物於質量濃度為1.0％的瓊脂糖電泳檢測；步驟七、結果觀察，查表記數。
2、 根據權利要求1所述的附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法，其特徵在 於在步驟一中所述生物膜取樣裝置保持在線安裝在罐體或管體的側壁上15天。
3、 實現權利要求1所述方法中的生物膜取樣裝置，其特徵在於所述取樣 裝置包括主體(4)、探頭壓緊總成(5)、固定件(2)和控制閥(3)，其特徵 在於所述取樣裝置還包括探頭(1)，所述探頭(1)的上端設有臺肩(1-1)， 壓緊總成(5)位於主體(4)的上端，探頭(1)依次穿過探頭壓緊總成(5)、 主體(4)，探頭(1)通過固定件(2)固裝在主體(4)的上端面上，探頭(1) 上端的臺肩(1-1)搭接在探頭壓緊總成(5)的上端面上，探頭壓緊總成(5) 安裝在主體(4)上設有定位臺肩(4-1)上，控制閥(3)安裝在主體(4)的 下端側壁上。
全文摘要
附著型硫酸鹽還原菌定量檢測方法及所用生物膜取樣裝置，它涉及一種硫酸鹽還原菌的定量檢測方法及該方法中專用的生物膜取樣裝置。本發明解決了現有的檢測方法無法實現附著型硫酸鹽還原菌的快速、較準確的定量檢測問題。本方法主要步驟為用生物膜取樣裝置取下生物膜、菌體製備、倍比稀釋、PCR操作、擴增、電泳檢測、查表記數。所述探頭(1)依次穿過探頭壓緊總成(5)、主體(4)，探頭(1)通過固定件(2)固裝在主體(4)的上端面上，探頭(1)上端的臺肩(1-1)搭接在探頭壓緊總成(5)的上端面上，控制閥(3)安裝在主體(4)的下端側壁上。本發明方法記數更加準確、縮短計數時間，運用本發明裝置可有效取得罐壁和管壁的附著生物膜。
文檔編號C12Q1/06GK101302557SQ20081006490
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月11日 優先權日2008年7月11日
發明者寧 侯, 李大鵬, 楊基先, 珊 邱, 放 馬, 利 魏 申請人:哈爾濱工業大學