一種用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒的製作方法
2023-05-01 22:46:21
本發明涉及一種用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒，屬於檢驗技術領域。
背景技術：
正常機體受到外界病原微生物等的刺激後，通過一系列固有免疫和適應性免疫反應抵抗感染、行使免疫防禦功能。其中，固有免疫是機體先天獲得的第一道防線，出現早且反應迅速，在機體清除病原體的過程中發揮重要作用。中性粒細胞是固有免疫系統的重要組成部分。中性粒細胞在吞噬病原體過程中產生超氧陰離子和其他反應性氧複合物，即「呼吸爆發」，參與機體非特異性的抗感染過程。中性粒細胞呼吸爆發功能缺陷常見於臨床上的慢性肉芽腫患者，以及其他生理病理或藥物作用導致中性粒細胞功能缺陷的患者。慢性肉芽腫一種罕見的原發性免疫缺陷病，患者由於還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶複合物組分缺陷，不能產生活性氧中間體(reactive oxygen intermediates，ROI)，因此臨床表現反覆細菌和真菌感染，嚴重者可危及生命。目前已發現慢性肉芽腫有2種不同的遺傳方式，即X染色體隱性遺傳(CYBB基因缺陷導致)和常染色體隱性遺傳(CYBA、NCF1、NCF2和NCF4基因缺陷導致)兩種方式。由於該病的臨床表現與其他免疫缺陷類疾病以及感染類疾病十分類似，因此僅通過臨床表現並不能將其與其他病種區分開來。因此，慢性肉芽腫病臨床上主要是基於體外檢測中性粒細胞刺激後消耗氧和產生氧代謝物是否缺陷來診斷的。然而目前，國內僅有北京和上海少數幾家兒童專科醫院能夠行中性粒細胞呼吸爆發功能檢測實驗，絕大多數醫院不具備檢測技術和條件。大部分疑似病例需要從外地趕至北京上海進行相關檢測，成本高且不易操作。另外，由於各家醫院檢測手段不完全相同，沒有統一的判斷標準。尤其針對常染色隱性遺傳的患者來說，由於其中性粒細胞呼吸爆發功能並非完全喪失，因此實驗偏差很容易影響到臨床醫師最後的診斷結果。另外，國內市場上僅有一家公司在售相關試劑盒，但未排除內源性過氧化氫酶對於實驗結果的影響，這將會導致實驗結果的不穩定性。因此，研發、製備穩定的中性粒細胞呼吸爆發功能檢測試劑盒將極大地促進慢性肉芽腫病的診斷，並可促進中性粒細胞呼吸爆發功能相關的臨床診斷和基礎研究。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種穩定的用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒。本發明的試劑盒用於檢測中性粒細胞產生活性氧的能力，尤其適用於臨床篩查慢性肉芽腫患者，亦可用於其他各種生理病理條件，以及藥物作用對於中性粒細胞呼吸爆發功能的影響。本試劑盒不僅限於人類樣本的檢測，還可用於其他物種，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、豬等。
為實現上述目的，本發明中，我們提供一種用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能試劑盒。該試劑盒主要基於二氫羅丹明123(Dihydrorhodamine 123,DHR123)流式細胞分析法，利用少量的周血全血即可完成檢測。其原理為：首先在測試樣本中加入過氧化氫酶以分解內源性的過氧化氫，消除樣本間差異，然後加入DHR123。DHR123是一種小分子化合物，可自由進入細胞。再加入佛波酯(Phorbol Myristate Acetate,PMA)溶液，中性粒細胞在PMA的刺激下可產生過氧化氫等活性氧。DHR123在過氧化氫和超氧陰離子等活性氧的作用下DHR123可生成羅丹明123(rhodamine123,R123)，產生綠色螢光。通過流式細胞術檢測綠色螢光的表達情況即可判斷中性粒細胞產生活性氧的能力。本發明的技術方案具體介紹如下。
一種用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒，該試劑盒包括如下組分：PMA溶液、DHR123溶液、過氧化氫酶溶液、平衡液、洗滌液、紅細胞裂解液和稀釋液。
本發明中，PMA溶液的濃度是20μg/ml；DHR123溶液的濃度是90μg/ml；過氧化氫酶溶液的濃度是20U/μl。
本發明中，平衡液為生理鹽水；洗滌液為PBS溶液；稀釋液為PBS溶液。
本發明中，試劑盒用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的方法如下：
第一步，取受試樣本，置於流式細胞管底部，檢測分別為靜息組、對照組和實驗組，每管50μl；如果受試樣本為血液樣本，則每管加入1ml 1x紅細胞裂解液，室溫避光孵育8～15分鐘；然後離心，去除上清，並用洗滌液清洗1-2次，每管加入50μl稀釋液；如果受試樣本為細胞樣本，則洗滌後直接加入50μl稀釋液；
第二步，向靜息組、對照組及實驗組中分別加入5μl過氧化氫酶；後向靜息組中加入50μl平衡液，對照組及實驗組中分別加入50μl DHR123溶液，37℃孵育5分鐘；
第三步，向靜息組及對照組中分別加入50μl平衡液，實驗組中加入50μl PMA溶液，37℃孵育15分鐘後立即進行流式細胞術檢測；
第四步，將上述靜息組、對照組和實驗組分別利用流式細胞術檢測，圈出中性粒細胞，檢測綠色螢光的表達情況，記錄每組的平均幾何螢光強度；
第五步，計算刺激指數SI，可利用如下公式：SI＝實驗組平均幾何螢光強度/對照組平均幾何螢光強度；
第六步，判斷受試樣本中性粒細胞呼吸爆發功能強弱，分為如下3種情況：
1)利用對於人類慢性肉芽腫患者的臨床檢驗，SI的正常參考值如下：
a.正常值：85.2-264.6；
b.X連鎖慢性肉芽腫病：0.9-3.2，部分可>4.5；
c.常染色體慢性肉芽腫病：3.5-52.1；根據正常參考值判定受試者中性粒呼吸爆發功能缺陷與否。
利用本發明的試劑盒用於臨床篩查慢性肉芽腫患者的結果分為如下幾種：
①在正常健康人中，中性細胞受PMA刺激後可產生活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成具有綠色螢光的羅丹明123，流式細胞術檢測可見幾乎全部的中性粒細胞均帶有綠色螢光，中性粒細胞峰值明顯右移；
②在X染色隱性遺傳CYBB基因突變導致的慢性肉芽腫患者中，中性粒細胞產生活性氧的能力完全喪失，DHR123無法轉化成羅丹明123，因此中性粒細胞峰值無位移；
③在X染色隱性遺傳CYBB基因突變攜帶者中，由於只有一條染色體基因缺陷，另一條染色基因正常，因此檢測結果會出現雙峰，即一部分中性粒細胞峰值有明顯位移，而另一部分中性粒細胞峰值無位移；
④在常染色隱性遺傳基因突變導致的慢性肉芽腫患者中,中性粒細胞產生活性氧的能力缺陷，DHR123無法或只能部分轉化成R123，因此中性粒細胞峰值無位移或者僅有較少位移。
2)對於其他各種生理病理條件，以及藥物作用下中性粒細胞呼吸爆發功能改變的實驗室檢測，可對比對照組的SI值進行判斷。
3)對於其他物種中性粒細胞呼吸爆發功能的檢測，可參照對照組SI值進行判斷。
本發明的試劑盒是用於檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的試劑盒，具有如下優點：
1)需血量少。利用本試劑盒檢測中性粒細胞呼吸爆發功能，僅需少量樣本即可完成檢測過程。
2)操作簡單，僅需按照產品說明書進行簡單操作即可。無需特別的實驗技巧，可操作性強。按照產品說明進行操作，僅需1小時即可完成整個檢測過程。
3)成本低，推廣性強。因本試劑盒內包含的試劑造價低，因此試劑盒成本低，適用於各經濟階層的患者使用。
4)重複性好。流式檢測法可直觀真實地反應中性粒細胞受到刺激後產生活性氧的情況，不受操作者主觀判斷影響，結果可重複性強。
5)去除樣本間差異，實驗結果更為精確。本試劑盒加入過氧化氫酶去除樣本內源性過氧化氫對於實驗結果的影響，去除了樣本間的差異，使實驗結果更為精確。
6)檢測結果清晰、特異性強，易於分析。能夠對中性粒細胞產生活性氧的能力進行定性和定量分析。對於慢性肉嚴重患兒的臨床診斷，可大致區分其的不同遺傳類型。
本試劑盒可用於檢測受試者中性粒細胞呼吸爆發功能，尤其用於慢性肉芽腫病的臨床篩查；亦可用於其他生理病理條件或藥物作用下中性粒細胞呼吸爆發功能改變的實驗室檢測。除人類樣本外，還可用於其他物種中性粒細胞呼吸爆發功能的檢測。
附圖說明
圖1為本發明基於DHR123流式細胞分析法檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的原理圖示。
圖2為本試劑盒操作說明示意圖。
圖3是慢性肉芽腫病篩查的檢測結果圖示，即DHR123流式峰圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施例不構成對本發明的限定。
實施例1
圖1為本發明基於DHR123流式細胞分析法檢測中性粒細胞呼吸爆發功能的原理圖示。
通過本試劑盒可對於檢測受試者中性粒細胞呼吸爆發功能進行檢測，以此判定受試者是否為慢性肉芽腫患者。通常需要獲取待診患兒的外周血全血作為實驗組，其父母的外周血全血作為對照組進行檢測。
患者發生突變的X染色體通常是由母親的1條X染色體遺傳而來，少數為新發突變。患兒的父親因只有1條X染色體，如果其父親沒有慢性肉芽腫病相關的臨床症狀，則默認其為健康對照。如果待查患兒中興細胞呼吸爆發功能缺如或僅餘少量功能，刺激指數遠低於正常值；且其母親中性粒細胞流式圖顯示雙峰，則可判定患兒為X染色體隱性遺傳慢性肉芽腫病。可繼續行基因檢測CYBB基因突變進一步明確致病基因突變。
如果患兒中性粒細胞呼吸爆發功能完全缺如或僅餘少量功能，刺激指數遠低於正常值；而其母親中性粒細胞呼吸爆發功能正常，通過本實驗只可判斷患者是否患慢性肉芽腫，而無法判定其遺傳方式為X染色體隱性遺傳或者常染色體隱性遺傳慢性肉芽腫病。需行基因檢測相關致病基因突變進一步明確其類型。
圖2為實施例1的具體操作示意圖，具體步驟如下：
第一步，裂解紅細胞，製備樣本。取就診患兒及對照組外周血全血置於流式細胞管底部，每人分3管，分別為靜息組、對照組和實驗組，每組50μl。分別向每管中加入1ml 1x紅細胞裂解液，室溫避光孵育10分鐘。然後離心，去除上清，並用洗滌液清洗1-2次。每管加入50μl稀釋液。
第二步，加入過氧化氫酶分解內源性過氧化氫。再加入DHR123，使其擴散進入中性粒細胞內。取就診患兒及對照組外周血全血置於流式細胞管底部，每人分3管，分別為靜息組、對照組和實驗組，每組50μl。向每管中分別加入5μl過氧化氫酶，以分解樣本內源性過氧化氫酶，消除樣本間差異。再向靜息組加入50μl平衡液，對照組及實驗組中分別加入50μl DHR123溶液，37度孵育5分鐘，使DHR123自由擴散進入細胞內。
第三步，PMA刺激中性粒細胞產生過氧化氫等活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成R123。向靜息組及對照組中分別加入50μl平衡液，實驗組中加入50μl PMA溶液，37度孵育15分鐘。健康人中性粒細胞在PMA的刺激下可產生大量活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成帶有綠色螢光的R123；而慢性肉芽腫患者不能產生或較少產生活性氧，因此不能將DHR123轉化成R123，或者僅能將少量的DHR123轉化成R123。
第四步，流式細胞術檢測R123的轉化率。將上述靜息組、對照組和實驗組分別利用流式細胞術檢測。圈出中性粒細胞，檢測綠色螢光的表達情況，記錄每組的平均幾何螢光強度。
第五步，計算刺激指數SI，判斷中性粒細胞呼吸爆發功能強弱，指導慢性肉芽腫的臨床診斷。利用如下公式進行計算：SI＝實驗組平均幾何螢光強度/對照組平均幾何螢光強度。可根據如下SI的正常參考值指導慢性肉芽腫的診斷：1)正常值：85.2-264.6；2)X連鎖慢性肉芽腫病：0.9-3.2，部分>4.5；3)常染色體慢性肉芽腫病：3.5-52.1。根據正常參考值判定受試者中性粒呼吸爆發功能缺陷與否。
圖2是實施例1的試劑盒操作說明示意圖。圖3為檢測結果圖示DHR123流式峰圖。通常情況下，慢性肉芽腫患者外周全血經PMA刺激後，中性粒細胞柱狀圖沒有向右偏移或者僅有少量偏移；健康對照中性粒細胞柱狀圖明顯向右偏移；CYBB基因突變攜帶者，即患兒母親中性粒細胞柱狀圖有兩個峰值，其中一個峰值沒有向右或僅有少量偏移，另一個峰值明顯向右偏移。