利用hva1基因的半定量pcr法鑑定青稞抗旱性的方法
2023-05-23 01:30:16
專利名稱：利用hva1基因的半定量pcr法鑑定青稞抗旱性的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種利用HVAl基因的半定量PCR法鑑定青稞抗旱性的方法。
背景技術：
高等植物胚胎發育晚期豐富蛋白(late embryogenesi s abundant proteins,LEA proteins)是種子發育後期產生的一類小分子特異多肽，這類蛋白與植物耐脫水性密切相關，受植物的發育階段、ABA和脫水信號的調節(Sun et al.，2003 ;Ramanjulu，2002)。自1981年首次在胚胎發育後期的棉花子葉中分離到了一組豐富表達的mRNA，命名為IeamRNA,同時還分離到其表達產物，即LEA蛋白(Dure et al.,1981),目前已從各種植物中發現了許多新的LEA蛋白。根據蛋白中胺基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，可將LEA蛋白分為6組(Bray, 1993 ；ffise et al.，2004 ;張改娜等，2005)。在LEA蛋白基因中LEA2蛋白基因和LEA3蛋白基因是麥穀類作物中研究最多的2類與抗旱和抗鹽有關的基因(Riedand Walker-Simmons, 1993 ；Suprunova et al.,2004)。來自普通大麥(Hordeum vu IgareL.)的HVAl基因編碼大麥類群第3組LEA蛋白(LEA3蛋白)，通常含有多拷貝的11個胺基酸構成的保守基元序列(TAQAAKEKAGE)，該基元序列可形成兼性α-螺旋結構，在植物細胞脫水時提供疏水區的親水表面(Dure，1993 ;俞嘉寧，2002 ;Choi，1999)。大量研究表明，LEA蛋白在植物耐受乾旱和鹽脅迫過程中發揮著重要的功能。Xu(1996)和Sivamani (2000)等通過轉基因分析表明，來源於大麥的L EA類基因HVAl過表達後可以顯著提高轉基因水稻和小麥的抗旱及耐 鹽能力，這項研究為支持LEA蛋白在植物抗水分和鹽脅迫時起保護作用的假說提供了直接的證據。餘嘉寧(2005)等從小麥中克隆了 L EA3基因，轉入酵母系統表達後與對照相比，其抵抗乾旱和低溫脅迫能力顯著增強。該基因的抗旱、耐鹽功能在菸草(李楠，2007)和桑樹(Lai S et al，2008)中也得到了實驗證實。但也有相反報導，如:從耐脫水復活植物Craterostigma Plantagineum分離出一個第3組LEA基因，PcC3_06,將其轉到菸草中高效表達，但轉基因菸草在抗旱性方面並沒有得到提高(Bimei et al.，1992)。因此對於第3組LEA蛋白基因的在青稞細胞中的表達及其與與抗旱性的關係還有待進一步的深入研究。目前抗旱性鑑定多採用生理生化的方法，這種方法比較繁瑣，僅靠一兩個生理指標很難鑑定植物的抗旱性，因而耗時比較長，而且沒有固定的生理生化指標可以確定植物的抗旱性。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種利用HVAl基因的半定量PCR法鑑定青稞抗旱性的方法。本發明的技術方案如下:利用HVAl基因的半定量PCR法鑑定青稞抗旱性的方法，包括以下步驟:
(I)青稞兩葉期時開始用0-30%的PEG脅迫處理4天；(2)採用上海生工總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒對葉片進行總RNA的提取及逆轉錄；(3)以大麥肌動蛋白(β-Actin)基因為內參基因對目標基因HVAl的擴增，引物如下:
權利要求
1.一種利用HVAl基因的半定量PCR法鑑定青稞抗旱性的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)青稞兩葉期時開始用0-30%的PEG脅迫處理4天； (2)採用上海生工總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒對葉片進行總RNA的提取及逆轉錄; (3)以大麥肌動蛋白(β-Actin)基因為內參基因對目標基因HVAl的擴增；引物如下:
全文摘要
本發明公開了一種利用HVA1基因的半定量PCR法鑑定青稞抗旱性的方法，包括以下步驟(1)青稞兩葉期時開始用0-30％的PEG脅迫處理4天；(2)採用上海生工總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒對葉片進行總RNA的提取及逆轉錄；(3)以大麥肌動蛋白(β-Actin)基因為內參基因對目標基因HVA1的擴增；(4)採用Gel-pro軟體對所得HVA1基因相對表達量圖進行二次函數的擬合；(5)根據擬合曲線計算HVA1基因的相對最高表達量或者對應的PEG濃度，其數值大者為抗旱性強的青稞品種。
文檔編號C12Q1/68GK103184284SQ20131009132
公開日2013年7月3日 申請日期2013年3月8日 優先權日2013年3月8日
發明者姚曉華, 吳崑崙, 蔣禮玲, 王顯萍, 任又成 申請人:青海省農林科學院