一株海洋微小鏈黴菌及其在群體感應抑制方面的應用的製作方法

2023-05-21 14:20:21 1

一株海洋微小鏈黴菌及其在群體感應抑制方面的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一株海洋微小鏈黴菌及其在群體感應抑制方面的應用。所述海洋微小鏈黴菌（Streptomyces?parvulus）是HY026，它的保藏編號是CGMCC?No.8493。本發明的微小鏈黴菌具有高效低毒的群體感應抑制活性及顯著的抗腫瘤活性，其中一個活性組分在濃度為50μg/片時即有顯著的群體感應抑制作用，在12.5μg/mL時對指示菌Chromobacterium.Violaceum12472紫色菌素的產生有顯著抑制作用，其抑制率達64.9%，優於目前已報導的許多群體感應抑制活性物質或粗提物。該菌株活性成分的產量較大。有望應用於以群體感應系統為靶點的新型抗菌物質的開發。
【專利說明】一株海洋微小鏈黴菌及其在群體感應抑制方面的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一株海洋微小鏈黴菌及其在群體感應抑制方面的應用。
【背景技術】
[0002]群體感應(quorum-sensing, QS)是由Fuqua等在1994首先提出的,是細菌根據自身細胞密度變化進行自我調節的一種群體行為。
[0003]許多細菌能產生並釋放一種被稱為自誘導物(Auto Inducer, Al)的信號分子，隨著細菌密度的增加，信號分子積累到一定濃度時則會與胞漿受體蛋白結合，調控細菌相關基因的表達，使細菌形成一種群體行為來有效地抵禦環境壓力、攻擊宿主等(Antimicrobial Agents Chemotherapy, 2000, 44:640-646;MolecularMicrobiology, 2004, 53:755-769)。在一些機會致病菌(如銅綠假單胞菌、聚團腸桿菌、粘質沙雷氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌等)中，群體感應系統調控相關致病因子的產生，如促進毒素的產生、黏附、生物膜的形成等。大量文獻表明，缺失了群體感應系統的菌株其致病能力大大降低。
[0004]細菌耐藥性問題日趨 嚴重，傳統的抗菌藥物容易使病原菌產生抗藥性，要從根本上去除細菌的致病性還是要通過阻斷或改變其致病過程中必須的通路，使致病基因無法表達，這樣不僅消除了細菌的致病性，還確保了不會產生耐藥性問題。對群體感應系統具有抑制作用的物質並不幹擾細菌的蛋白質合成、細胞壁合成、DNA超螺旋形成等重要的生命過程，不會直接殺死病原菌，可作為抗感染藥物研發的新靶標。通過研究細菌的群體感應體系，建立科學的篩選模型，找到具有抑制細菌群體感應活性的天然產物，是開發新型抗菌物質的有效途徑。
[0005]海洋生境的特殊性，使生活於其中的海洋生物具有與陸生生物不同的生理性狀和生理功能，並產生許多結構新穎、作用特殊的活性物質。有的具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒或降壓降脂等醫藥活性功能，有的含有可用於工業用途的極端酶類(如耐高溫酶、高壓酶、低溫酶、耐酸鹼酶等)等等(Advance in Applied Microbiology, 1997, 43, 57-90;Journal of Coastal Development，2004，7:109—118;Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2009, 75:1838-1844。所以海洋生物成為陸地生物之後的一個最重要、最巨大的寶庫，是目前功能生物開發、餌料開發、食品開發、藥物開發、活性化合物開發、保健品開發等眾多行業的重要資源。海洋微生物因其具有種類繁多，生長快速，易於規模發酵培養，代謝產物多樣且活性代謝產物結構相對簡單，易於化學合成等優勢，使其極具醫藥、工業和軍事價值。因此，從海洋微生物資源中尋找新型天然活性產物已成為目前國際上該領域的研究熱點。
[0006]申請號為201010295829.0的中國專利申請公開了一種海洋中的鏈黴菌屬菌株及其在群體感應抑制活性方面的，但該專利申請中沒有報導具體的活性化合物。
【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一株群體感應抑制活性更高的海洋鏈黴菌菌株。
[0008]本發明從採自連雲港海域海水樣品中分離海洋放線菌，採用紫色桿菌模型對分離到的菌株進行群體感應抑制活性的篩選，找到一株具有高效群體感應抑制活性的菌株，濾紙片法初篩顯示其發酵液粗提物在250 μ g/片時對指示菌有顯著地抑制作用。通過16SrDNA序列分析結合形態特徵將其鑑定為(Streptomyces parvulus).HY026,其與genbank中一株鏈黴菌同源性達99.3%。對該菌株進行大量發酵並對發酵產物提取物作減壓柱粗分離，發現其中一個活性組分在50 μ g/片時即有顯著的群體感應抑制作用，在12.5 μ g/mL時對指示菌紫色素的產生有顯著抑制作用，但在該濃度下對指示菌生長沒有明顯抑制作用。經LC-MS，NMR等方法初步鑑定該活性組分是以一個已知抗腫瘤活性化合物為主的混合物。該已知化合物尚無群體感應抑制活性方面的報導。採用MTT法檢測該菌的抗腫瘤活性顯示該菌提取物對人宮頸癌HeLa細胞的生長也具有顯著的抑制活性。
[0009]本發明所述的微小鏈黴菌菌株，是HY026，它的保藏號是CGMCC N0.8493。
[0010]本研究中分離得到的微小鏈黴菌具有高效低毒的群體感應抑制活性及顯著的抗腫瘤活性，其中一個活性組分在濃度為50 μ g/片時即有顯著的群體感應抑制作用，在12.5 μ g/mL時對指不菌Chromobacterium.Violaceuml2472紫色菌素的產生有顯著抑制作用，其抑制率達64.9%，優於目前已報導的許多群體感應抑制活性物質或粗提物。該菌株活性成分的產量較大，約40mg/L。有望應用於以群體感應系統為靶點的新型抗菌物質的開發。
[0011]與已有技術相比，本發明分離篩選到的活性鏈黴菌菌株與其不同，該菌株所產生的活性物質的群體感應抑制活性更高。申請號為201010295829.0的中國專利申請中所公開的一株海洋鏈黴菌Streptomycetes sp.HH-1的提取物在濃度為50mg/mL, 100mg/mL,150mg/mL,200mg/mL時對紫色`桿菌CV026紫色菌素的抑制率分別為25%，47%，65%和82%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1.活性菌株HY026的系統發育樹。
[0013]圖2粗分純樣品F1-4在不同濃度下對紫色桿菌產紫色素的抑制情況。F25為陽性對照25 μ g/mL的呋喃酮。
[0014]圖3粗分純樣品F1-4對紫色桿菌生長的影響。測試濃度為6.25和12.5，F25為陽性對照25 μ g/mL的呋喃酮，Control是溶劑對照DMS0。
[0015]本發明菌株HY026於2013年11月21日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為微小鏈黴菌Streptomyces parvulus,保藏編號為CGMCC N0.8493。
【具體實施方式】
[0016]實施例中涉及到的紫色桿菌Chromobacterium.Violaceuml2472(Proceedings ofthe National Acadamy of Science USA.2003, 100 (20): 11660 - 11665)由香港科技大學錢
培元教授實驗室提供。
[0017]樣品採集:2011年10月從連雲港海域採集上層海水和底泥樣品，存放於無菌瓶中。[0018]菌株HY026的分離與培養:將海水樣品在55°C下水浴處理lh，梯度稀釋後塗布接種到高氏一號固體培養基中，30°C培養，從第二天起每天觀察菌落長出情況，挑取新長出的放線菌接種到新鮮的高氏一號固體培養基上純化。將分離到的菌株46株菌株分別接種到高氏一號液體培養基中，30°C，140rpm振蕩培養5天。離心去菌體，發酵液用等體積乙酸乙酯萃取2次。有機相經旋轉蒸發儀濃縮，得到各菌株粗提物樣品、稱重，待測。
[0019]群體感應抑制活性篩選(濾紙片法):將過夜液體培養後的指示菌紫色桿菌Chromobacterium.Violaceuml2472 (能由於自身群體感應效應產生色素)塗布到固體培養基上，將250 μ g待測樣品(上述46株菌株的各菌株粗提物)分別加入到無菌濾紙片上，待溶劑揮發後，將濾紙片反扣貼放於已塗布接種指示菌的因體培養基上。30°C培養I天后觀察抑菌圈的形態。如果是透明的抑菌圈表明測試菌對報告菌的生長有抑制，如果是白色的抑菌圈則表明測試菌能抑制指示菌QS效應控制的色素產生，但不影響指示菌的生長。挑取少許白色抑菌圈內的瓊脂接種到液體培養基中，振蕩培養，觀察指示菌是否可以生長並產紫色。若可以生長但不產紫色則表明白色抑菌圈內的細菌存活但不可逆的失去了產紫色素的能力，若能產紫色則表明該群體感應抑制效果為可逆的。濾紙片法初篩顯示一菌株發酵液粗提物在250 μ g/片時對指示菌產紫色素有顯著地抑制作用，抑制圈直徑達11_，該菌株命名為HY026。
[0020]菌株HY026的鑑定:SDS-CTAB法對菌株HY026的基因組DNA進行提取，交由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序分析。測定了菌株6S rDNA序列的有效長度為1472bpl，將序列提交BLAST，與GenBank中其它菌株的16S rDNA序列進行同源性比對，應用MEGA軟體，分析並構建系統進化樹(見圖1)，發現菌株HY026與Streptomycesparvulus (T) ;NBRC13193 (AB184326)的相似性達99.3%，結合菌落形態，將其鑑定為微小鏈黴菌 Streptomyces parvulus HY026。
[0021]菌株HY026活性樣品的粗提取:對菌株HY026進行大批量發酵，共45L，發酵液經乙酸乙酯-丙酮萃取，得到粗提物5.0lg。採用固體上樣，正相減壓柱分離，氯仿甲醇梯度洗脫(30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，0:100)，氯仿甲醇30:1洗脫出來的組分Fl經再次正相減壓柱分離，氯仿甲醇梯度洗脫(100:0，80:1，60:1，40:1，30:1，20:1，15:1，0:100)。活性組分主要在F1-4中。
[0022]組分F1-4群體感應抑制活性的測試:採用色素抑制法對組分F1-4進行活性測試。具體方法為:將過夜培養的紫色桿菌菌液用牛肉膏蛋白腖培養基稀釋至0D570=0.10，吸取ImL菌液到指形管中，同時加入經培養基適當稀釋的原溶於DMSO中的組分F1-4，使其的終濃度為分別為6.25，12.5，25，50，100μ g/mL，以終濃度25 μ g/mL的呋喃酮為陽性對照，不加樣品僅加相應體積培養基和DMSO的為陰性對照，28°C、140rpm搖床培養24h後，將培養液HOOOrpm離心30min，去除上清液，加入0.5mL 二甲基亞碸(DMS0)，渦旋使菌體中的色素充分溶解其中，14000rpm再次離心IOmin,沉澱菌體及碎屑。測定上清液0D57(I。根據公式計算
抑制率。
【權利要求】
1.一株海洋微小鏈黴菌(Streptomyces parvulus) HY026，它的保藏編號是CGMCCN0.8493。
2.海洋微 小鏈黴菌(Streptomycesparvulus) HY026在群體感應抑制方面的應用。
【文檔編號】C12R1/465GK103695358SQ201310723024
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】繆莉, 董昆明, 姜芸, 周惠茹, 翟有朋, 周曉見 申請人:揚州大學