一種產表活菌的螢光定量pcr檢測方法

2023-05-21 13:04:16 3

一種產表活菌的螢光定量pcr檢測方法
【專利摘要】一種產表活菌的螢光定量PCR檢測方法，涉及油田的微生物檢測【技術領域】，先從產出液樣品中提取微生物DNA，並將微生物DNA溶於無菌水中得到DNA溶液；採用引物對樣品中的DNA進行螢光定量PCR擴增，讀取螢光定量PCR擴增反應初始循環數的檢測值CT；將CT值帶入公式CT=-3.925lgN+40.92，就可計算出產出液樣品中HDR菌濃度值N。本發明採用特異性引物結合螢光定量PCR擴增目標產表活菌DNA，獲得培養樣品產表活菌的含量。本發明具有快速檢測、特異性強、操作便捷、檢測準確的優點。
【專利說明】-種產表活菌的螢光定量PCR檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及油田的微生物檢測【技術領域】，尤其是涉及產表活菌的快速定量檢測方 法。

【背景技術】
[0002] 在原油採出的過程中，原油通過近井地帶向井筒運移，溫度逐漸下降，會造成石蠟 結晶，石蠟從原油中析出，析出蠟聚集在近井地帶，造成井筒的堵塞，這是引起油井減產的 主要原因。為保證高含蠟油井能夠正常生產，微生物清防蠟技術是利用解烴菌降解石蠟等 長鏈烷烴的作用，或利用微生物產生的表面活性劑清洗井筒原油，從而達到清蠟的目的。
[0003] 產表活菌在定量分析方面，目前只能通過分子生物學方法確定其在樣品中的相對 含量(根據不同微生物克隆數)，並結合樣品總菌濃(如生物顯微鏡計數等）進行計算獲得， 由於待測樣品（油井產出液等環境樣品）一般包含種類繁多、組成複雜的微生物，而且不同 微生物的豐度相差巨大。在採用傳統方法分析時，一方面，生物顯微鏡計數誤差較大，且不 能做低濃度檢測；另一方面，對於豐度低的微生物，在DNA提取分析過程中可能會出現漏 檢；對於不同生理特性的微生物，往往因為培養條件不適也會造成漏檢，同時，傳統方法存 在著耗時、過程繁雜等一系列缺陷。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種針對性強、操作快捷 簡便的產表活菌的檢測方法。
[0005] 本發明技術方案包括以下步驟： 1) 從IOOmL產出液樣品中提取微生物DNA，並將微生物DNA溶於無菌水中得到100 μ L 的DNA溶液； 2) 採用引物BS983(F)和BS1315(R)對樣品中的DNA進行螢光定量PCR擴增，讀取螢光 定量PCR擴增反應初始循環數的檢測值C t ; 3) 將Ct值帶入公式Ct = -3. 9251g N + 40. 92,計算出產出液樣品中HDR菌濃度值N ; 所述引物序列為： BS983(F) ：TAGGACGTCCCCTTCGGGG ； BS1315(R) : CCGACTTCGGGTGTTACAAA。
[0006] 本發明針對現有技術不足設計了特異性的一對引物，採用特異性引物結合螢光定 量PCR擴增目標產表活菌DNA，獲得培養樣品產表活菌的含量。本發明具有快速檢測、特 異性強、操作便捷、檢測準確的優點，對現場油井微生物防蠟技術的推廣應用更具有指導意 義。
[0007] 另外，本發明所述螢光定量PCR擴增反應體系為：9. 5μ L無菌水、12. 5μ L SYBR Green預混液、正向引物和反向引物組成各0.5 μ L，及2 μ L產出液樣品DNA。
[0008] 所述突光定量PCR擴增反應的反應程序是： 1) 95°C保溫 5 min ; 2) 94°C保溫 30 s ; 3) 64°C保溫 30 s ; 4) 72 °C保溫 45 s ; 5) 重複執行2)?4)步驟50次； 6) 從65°C開始每5s增加0. 5°C，直至達到95°C為止； 7) 讀取螢光定量PCR擴增反應初始循環數的檢測值CT。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1為產表活菌樣品的Ct值與IgN的擬合曲線圖。
[0010]

【具體實施方式】
[0011] 一、製作標準曲線： 1、從100 mL菌濃為1.59X 109 cells/mL的產表活菌樣品中提取DNA，將DNA溶於適量 無菌水中製備得到100 μ L DNA溶液，然後做10倍梯度稀釋，得到不同稀釋度的DNA溶液 樣品。
[0012] 2、設計出產表活單菌的特異性引物對，其序列為： 正向引物：BS983(F): TAGGACGTCCCCTTCGGGG ;
[0013] 3、採用特異性引物BS983 (F)和BS1315 (R)對獲得標準樣品DNA進行螢光定量PCR 擴增，反應體系和反應程序如下： 螢光定量PCR擴增反應體系：9.5 yL無菌水、12.5 yL Universal SYBRGreen Master Mix (SYBR Green預混液)、12·5 μΜ的正向和反向引物各0.5 yL，以及2 yL樣 品 DNA。
[0014] 螢光定量PCR擴增的反應步驟：a) 95°C保溫5min ;b) 94°C保溫30s ;c) 64°C保溫 30s ;d)72°C保溫45s ;e)循環重複執行步驟b)?d)50次；f )從65°C開始每5s增加0. 5°C 至達到95°C為止；g)讀取螢光定量PCR擴增反應初始循環數。
[0015] 4、表1為以上試驗取得的數據： 表1

【權利要求】
1. 一種產表活菌的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於包括以下步驟： 1) 從IOOmL產出液樣品中提取微生物DNA，並將微生物DNA溶於無菌水中得到100 ii L 的DNA溶液； 2) 採用引物BS983 (F)和BS1315 (R)對產出液樣品中的DNA進行螢光定量PCR擴增，讀 取螢光定量PCR擴增反應初始循環數的檢測值Ct ; 3) 將Ct值帶入公式Ct= -3. 9251g N + 40. 92,計算出產出液樣品中HDR菌濃度值N ; 所述引物序列為： BS983(F) ：TAGGACGTCCCCTTCGGGG ； BS1315(R) : CCGACTTCGGGTGTTACAAA。
2. 根據權利要求1所述PCR檢測方法，其特徵在於所述螢光定量PCR擴增反應體系為： 9.5111無菌水、12.51113￥81?6代611預混液、正向引物和反向引物組成各0.5 111，及2 111 產出液樣品DNA。
3. 根據權利要求1或2所述PCR檢測方法，其特徵在於所述螢光定量PCR擴增反應的 反應程序是： 1) 95°C 保溫 5 min ; 2) 94°C保溫 30 s ; 3) 64°C保溫 30 s ; 4) 72 °C保溫 45 s ; 5) 重複執行2)?4)步驟50次； 6) 從65°C開始每5s增加0. 5°C，直至達到95°C為止； 7) 讀取螢光定量PCR擴增反應初始循環數的檢測值CT。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313178SQ201410691028
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月27日 優先權日:2014年11月27日
【發明者】楊帆, 時維才, 孟章進, 王彪, 吳偉林, 雷世華 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司江蘇油田分公司