從白刺種子中提取分離l-色氨酸的方法
2023-07-14 15:03:56
從白刺種子中提取分離l-色氨酸的方法
【專利摘要】本發明研究發現，從白刺種子中提取分離L-色氨酸的方法，它包括如下操作步驟：(1)取白刺種子，以乙醇或含水乙醇為溶劑進行提取，合併提取液，回收乙醇，濃縮，以石油醚萃取，收集水層；(2)取步驟(1)的萃取液，過大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，收集水洗脫液，濃縮，乾燥，即得L-色氨酸粗品；(3)取L-色氨酸粗品，純化，即得L-色氨酸純品。本發明研究發現，以白刺種子為原料，對大孔樹脂直接進行水洗後，就分離提取得到了高純度的L-色氨酸粗品和L-色氨酸純品。本發明使用的洗脫部位與現有專利技術完全不同，其洗脫工藝僅需要水洗液，其操作更簡便，成本更為低廉，同時也為白刺種子的開發利用提供了新的選擇。
【專利說明】從白刺種子中提取分離L-色氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及L-色氨酸的分離提取方法。
【背景技術】
[0002]唐古特白刺(NitrariaTangutorum Bobr)為蔡藜科(Zygophyllaceae)白刺屬植物，是一種藥食兩用的植物，主要生長在荒漠或半荒漠地區。唐古特白刺所具有的耐乾旱、耐鹽鹼、抗沙埋等特性使得其成為防風固沙、保持水土、改良土壤等不可多得的灌木品種。唐古特白刺在《中藥大辭典》中被稱為卡密，以果熟時採收，曬乾入藥，具有健脾胃。滋補強壯、調經活血的功能，主治身體瘦弱、氣血兩虧、脾胃不和、消化不良、月經不調、虛寒腰痛等症。《本草綱目》中記述，白刺「氣味辛、寒、無毒。主治心絞痛、癰腫潰膿，止痛。療丈夫虛損，陽瘻精自出，補腎氣，益精髓等」。在民間唐古特白刺的果實還被於哺乳期婦女的日常飲食中，促進泌乳。研究表明白刺果實中含花色苷、總多酚、多糖、胺基酸、維生素、黃酮、生物鹼、礦物質元素等成分，具有顯著的降血糖、降血脂、調節免疫、抗疲勞、耐寒冷、抗氧化、延緩衰老、保肝作用、抗腫瘤抗癌等生物活性。
[0003]為了深度開發利用白刺，中國專利201010298758.x公開了一種從白刺果實中提取分離色氨酸的方法，它是將白刺果實壓榨後，去除籽皮，取果汁過陶瓷膜除雜後，上大孔吸附樹脂柱，依次用水、40%?100%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，超濾後即可得到色氨酸。該方法中棄去了種子和水洗脫液。
[0004]目前還未見採用大孔吸附樹脂從白刺種子中提取分離L-色氨酸的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種從白刺種子中分離提取L-色氨酸的方法。
[0006]本發明研究發現，從白刺種子中提取分離L-色氨酸的方法，它包括如下操作步驟:
[0007](I)取白刺種子，以乙醇或含水乙醇為溶劑進行提取，合併提取液，回收乙醇，濃縮，以石油醚萃取，收集水層；
[0008](2)取步驟⑴收集的水層，過大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，收集水洗脫液，濃縮，乾燥，即得L-色氨酸粗品；
[0009](3)取L-色氨酸粗品，純化，即得L-色氨酸純品。
[0010]進一步地，步驟(I)中，所述含水乙醇濃度為60%?90%。
[0011]更進一步地，步驟(I)中，所述含水乙醇濃度為70%?80%，優選為75%。
[0012]進一步地，步驟(I)中，提取溫度為50?80°C，優選為60°C。
[0013]進一步地，步驟(2)中，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂或弱極性大孔吸附樹脂。
[0014]更近一步地，步驟(2)中，所述非極性大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂，HPD100, HPD300, HP-10, X-5 ;所述弱極性大孔吸附樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0015]進一步地，水洗脫的具體操作為:用水洗脫19個柱體積，收集第7?19個柱體積的水洗脫液。本發明研究發現，採用上述洗脫方式，即可得到純度90%以上的L-色氨酸。
[0016]本發明一個【具體實施方式】中，大孔樹脂柱規格為:直徑5釐米，柱高1.2米。
[0017]進一步地，步驟(3)中，所述純化採用製備液相色譜法或半製備液相色譜法。
[0018]其中，所述半製備液相色譜法中，檢測波長為254nm，以甲醇-水為流動相，梯度條件如下:0-10min, 10% 甲醇；10-20min, 10% -15% 甲醇；20-30min, 15% 甲醇；30-50min,15% -20% 甲醇；50-55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇。
[0019]進一步地，所述半製備液相色譜法中，色譜柱為20*250mm的C18柱。
[0020]中國專利201010298758.X中，雖然是以白刺果汁為原料進行了色氨酸的提取，然而，其大孔樹脂純化步驟中收集的是40%?100%乙醇洗脫部位，水洗部位被棄去了 ；令人意想不到的是，本發明研究發現，以白刺種子為原料，對大孔樹脂直接進行水洗後，就分離提取得到了高純度的L-色氨酸粗品和L-色氨酸純品。由此可見，本發明使用的洗脫部位與現有專利技術完全不同，其洗脫工藝僅需要水洗液，其操作更簡便，成本更為低廉，同時也為白刺種子的開發利用提供了新的選擇。
[0021]另外，相比目前其他色氨酸矽膠、凝膠柱層析工藝而言，本發明僅僅只使用大孔樹月旨，操作簡便，並且洗脫液無需使用有機溶劑，工藝更為環保，安全性更高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1大孔樹脂直接洗脫產物的液相色譜圖，液相條件:0-30minl0% -45% B，流動相A:水B:甲醇(分析時所用檢測波長是254nm)
[0023]圖2半製備液相色譜圖，主峰為L-色氨酸(製備色譜中所用檢測波長是254nm)
[0024]圖3純化後L-色氨酸的液相色譜圖，色譜條件如圖1
【具體實施方式】
[0025]實施例1:L_色氨酸分離提取方法
[0026](I)取5kg的白刺種子粉碎後加入75%的乙醇在煎藥機中進行熱提取，提取溫度60°C，提取時間2小時，共提取三次。第一次料液比為1: 15，第二次料液比為1: 12，第三次料液比為1: 10。合併提取液並減壓濃縮250mL後石油醚萃取5次，石油醚萃取比例為250mL粗提液加入750mL石油醚。
[0027](2)大孔樹脂柱規格:直徑5釐米，柱高1.2米
[0028]上柱:取1.5kg DlOl大孔吸附樹脂，裝入層析柱，吸附三天後進行解吸附處理，用水衝柱每一個柱體積接樣後檢測(柱體積約為2L)，當衝柱到第7個柱體積後上HPLC檢測其組成主要為化合物I。後續繼續衝柱，一共衝了 19個柱體積後將7-19合併後在旋轉蒸發儀上濃縮得到6.32g樣品，即為L-色氨酸粗品，其含量佔整個水衝物質含量的90%以上(見圖1)
[0029](3)將6.32g樣品復溶到200mL蒸餾水中，上半製備液相色譜進行進一步純化與精製，每次上樣20mL，樣品經半製備純化後HPLC檢測其純度達到了 99.7%，共得到5.88g高純度樣品。
[0030]半製備條件:
[0031]半製備柱:Dubhe C18柱(20*250mm)漢邦科技有限公司。檢測器:NU 3000SERIALSUV/VIS DetecTor，漢邦科技有限公司。泵:NP 7000SERIALS PUMP，漢邦科技有限公司。
[0032]半製備梯度條件:0-10min，10%甲醇；10_20min，10% -15% 甲醇；20_30min，15%甲醇；30-50min，15% -20% 甲醇；50_55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇(若採用製備色譜，可以採用同樣的流動相條件)
[0033]經NMR鑑定，該化合物為L-色氨酸。
[0034]NMR 數據為:13C NMR(DMS0-d6) δ 124.1 (d, C-2)，109.5 (s, C-3)，118.4(d, C_4)，118.3 (d, C-5)，120.9 (d, 6_C)，127.3 (s, C_3a)，136.3 (s, C_7a)，27.1 (t, CH2)，54.7 (d, CH)，170.3 (s, CO)
[0035]1H NMR(DMS0-d6) δ 10.94 (1H, s』 NH), 7.21 (1H, s，2_H)，7.56 (1H，d, J = 8.0Hz,4-H), 6.97(lH，d，J = 8.0Hz，5_H)，7.04(lH，t，J = 8.0Hz，6_H)，7.33(1H, J = 8.0Hz，7_H)，3.32 (1H, dd, J = 3.0，15.0HzjCH2)，2.95 (1H, dd, J = 9.0，15.0HzjCH2)，3.46 (1H, J = 5.0，8.0Hz，CH)
[0036]實施例2:L-色氨酸分離提取方法
[0037](I)取5kg的白刺種子粉碎後加入75%的乙醇在煎藥機中進行熱提取，提取溫度60°C，提取時間3小時，共提取三次。第一次料液比為1: 12，第二次料液比為1: 10，第三次料液比為1: 8。取液並減壓濃縮200mL後石油醚萃取5次，石油醚萃取比例為200mL粗提液加入700mL石油醚。
[0038](2)大孔樹脂柱規格:直徑5釐米，柱高1.2米
[0039]上柱:取1.5kg DlOl大孔吸附樹脂，裝入層析柱，吸附三天後進行解吸附處理，用水衝柱每一個柱體積接樣後檢測(柱體積約為2L)，當衝柱到第7個柱體積後上HPLC檢測其組成主要為化合物I。後續繼續衝柱，一共衝了 19個柱體積後將7-19合併後在旋轉蒸發儀上濃縮得到L-色氨酸粗品；
[0040](3)將粗品復溶到200mL蒸餾水中，上半製備液相色譜進行進一步純化與精製，每次上樣20mL，樣品經半製備純化後HPLC檢測其純度達到了 99.7%。
[0041]半製備條件:
[0042]半製備柱:Dubhe C18柱(20*250mm)漢邦科技有限公司。檢測器:NU 3000SERIALSUV/VIS DetecTor，漢邦科技有限公司。泵:NP 7000SERIALS PUMP，漢邦科技有限公司。
[0043]半製備梯度條件:0-10min，10%甲醇；10_20min，10% -15% 甲醇；20_30min，15%甲醇；30-50min，15% -20% 甲醇；50_55min，20% -95% 甲醇；55_65min，95% 甲醇(若採用製備色譜，可以採用同樣的流動相條件)。
【權利要求】
1.從白刺種子中提取分離L-色氨酸的方法，其特徵在於:它包括如下操作步驟: (1)取白刺種子，以乙醇或含水乙醇為溶劑進行提取，合併提取液，回收乙醇，濃縮，以石油醚萃取，收集水層； (2)取步驟(I)收集的水層，過大孔吸附樹脂柱，以水洗脫，收集水洗脫液，濃縮，乾燥，即得L-色氨酸粗品； (3)取L-色氨酸粗品，純化，即得L-色氨酸純品。
2.根據權利要求1所述的乙醇提取方法，其特徵在於:步驟(I)中，所述含水乙醇濃度為 60%?90% v/vo
3.根據權利要求2所述的乙醇提取方法，其特徵在於:步驟(I)中，所述含水乙醇濃度為 70% ?80% v/v，優選為 75% v/v0
4.根據權利要求1所述的乙醇提取方法，其特徵在於:步驟⑴中，提取溫度為50?80°C，優選為 60°C。
5.根據權利要求1所述的大孔樹脂柱分離方法，其特徵在於:步驟(2)中，所述大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂或弱極性大孔吸附樹脂。
6.根據權利要求5所述的大孔樹脂柱分離方法，其特徵在於:步驟(2)中，所述非極性大孔吸附樹脂為DlOl型大孔吸附樹脂，HPD100，HPD 300，HP-10，X_5 ;所述弱極性大孔吸附樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
7.根據權利要求1、5或6所述的大孔樹脂柱分離方法，其特徵在於:水洗脫的具體操作為:用水洗脫19個柱體積，收集第7?19個柱體積的水洗脫液。
8.根據權利要求1所述的純化方法，其特徵在於:步驟(3)中，所述純化採用製備液相色譜法或半製備液相色譜法。
9.根據權利要求8所述的純化方法，其特徵在於:所述半製備液相色譜法中，檢測波長為254nm，以甲醇-水為流動相，梯度條件如下:0_10min，10%甲醇；10-20min, 10 % -15%甲醇；20-30min，15 % 甲醇；30_50min，15 % -20 % 甲醇；50_55min，20 % -95 % 甲醇；55-65min，95% 甲醇。
10.根據權利要求9所述的純化方法，其特徵在於:所述半製備液相色譜法中，色譜柱為 20*250_ 的 C18 柱。
【文檔編號】C07D209/20GK104262231SQ201410542537
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月29日 優先權日:2014年9月29日
【發明者】索有瑞, 胡娜, 周武 申請人:中國科學院西北高原生物研究所, 青海大學