一種提取鐵皮石斛rna的方法
2023-05-21 19:56:16 2
一種提取鐵皮石斛rna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種鐵皮石斛RNA的提取方法，包括下述過程：鐵皮石斛幼嫩葉片低溫研磨，利用CTAB提取緩衝液進行細胞裂解、離心分離過程，其特徵在於：所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經離心後的上清液，以等量的10MLiCl混合，靜置後再離心分離、沉澱，再用Trizol法提取RNA的過程。由於本發明通過對現有的CTAB法進行改良，加入CTAB提取液充分裂解後直接利用等體積高濃度LiCl進行RNA沉澱，並同時利用高濃度LiCl去掉分離液中的多糖，不僅最大程度保留了RNA，同時也去除了大部分多糖，提高了RNA純度。
【專利說明】—種提取鐵皮石斛RNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種RNA的提取方法，尤其涉及到一種利用改良CTAB法與Trizol法相結合提取鐵皮石斛RNA的方法，屬於生物工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，2010年版《中國藥典》單獨收載，具有獨特的藥用價值，為石斛之極品。在研究鐵皮石斛遺傳學基礎中，RNA的提取是一項基礎性的工作。目前國內外提取RNA通常採用CTAB法進行:提取材料中加入CTAB提取液後充分裂解，離心之後，取其上清液先用氯仿異戊醇抽提21次，去除蛋白及一些色素及雜質；然後取上清液，加入四分之一體積10 M LiCl 4°〇過夜沉澱，沉澱完之後用SSTE溶解，然後再用無水乙醇沉澱最終得到RNA。由於鐵皮石斛多糖含量很高，普通的CTAB法中，少量的LiCl不能充分沉澱RNA，另外氯仿異戊醇主要作用是去蛋白，而鐵皮石斛蛋白含量很低，在加入CTAB提取液充分裂解後加入氯仿異戊醇抽提2~3次不僅沒有必要，而且可造成RNA的大量損失。因此，用現有的CTAB法提取鐵皮石斛RNA效率比較低，且所獲得的RNA的純度也不高。
【發明內容】
[0003]本發明提供的是一種高效提取鐵皮石斛的RNA的方法，將改良的CTAB法與Trizol法結合，可以提取高質量的鐵皮石斛RNA，然後進行轉錄組測序，以便於鐵皮石斛在分子領域中的後續研究。
[0004]本發明是通過下述方式實現的:一種提取鐵皮石斛RNA的方法，包括下述過程: 用液氮冷卻研缽將鐵皮石斛幼嫩葉片研磨，充分研磨後，立即加入到預熱好的CTAB提`取緩衝液中，均勻搖動；
將鐵皮石斛組織與提取液混合物置於65°C水浴條件下20 min後，冷卻至室溫，4 V，12000 rpm 離心 10 min ；
其特徵在於:所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經離心後的上清液，以等量的10 MLiCl混合，溶液在4 °C條件靜置8-12小時，4 °C條件下，12000 rpm離心20 min ；
棄上清液，用75%乙醇清洗沉澱,在4 °C條件下，12000 rpm離心5 min,棄上清液；
用SSTE溶解沉澱,然後加入Trizol,搖勻後加入氯仿,4 O條件下，12000 rpm離心10
min ；
取上清液，加入與上清液等體積氯仿與異戊醇的混合液，其中氯仿:異戊醇按24:1比例配合，在4 °C條件下，12000 rpm離心10 min ；
取上清液，加與上清液等體積異丙醇，-20 1:沉澱至少20 min, 4 1:條件下，12000rpm 離心 10 min ；
棄上清液，用75%乙醇清洗沉澱，連續洗滌兩次，乾燥沉澱，得純鐵皮石斛RNA。
[0005]由於本發明通過對現有的CTAB法進行改良，加入CTAB提取液充分裂解後直接利用等體積高濃度LiCl進行RNA沉澱，並同時利用高濃度LiCl去掉分離液中的多糖，不僅最大程度保留了 RNA，同時也去除了大部分多糖，提高了 RNA純度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]圖1為本發明的工藝流程圖
圖2為樣本78X72用本發明方法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖3為樣本78X72以用CTAB法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖4為樣本A39用本發明方法提取總RNA凝膠電泳圖；
圖5為樣本A39用CTAB法提取總RNA凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0007]實施例:
一、材料準備:
試驗所用的鐵皮石斛種植於浙江農林大學遺傳學科實驗基地，本實驗選用兩種種質:78X72 (多糖含量較高)和A39 (多糖含量較低)，採集其幼嫩葉片，於液氮中快速冷凍後保存於_70°C的超低溫冰箱備用.CTAB 溶液:2% CTAB，2% PVP，100 mmol.L-1 Tris-HCL(PH 8.0),25 mmol.L-1 EDTA, 2.0mol*L 1 NaCl0
[0008]SSTE:1.0 mol.!/1 NaCl, 0.5% SDS, I mmol.!/1 EDTA(PH 8.0),10 mmol.!/1Tris-HCl (PH 8.0)。TrizoKRNAiso Plus(D9108B))為 Takara 公司產品，瓊脂糖為 Promega公司產品，其他試劑均為分析純。
[0009]二、總RNA提取，具體提取步驟如下(見圖1):
1.將Iml CTAB提取液、20 uLP-巰基乙醇於2 mL離心管中，65°C水浴20 min ；
2.用液氮冷卻研缽，取100mg左右鐵皮石斛幼嫩葉片(嫩葉提取效果最佳)，迅速置於研缽中，不時加入液氮以防止研磨過程中葉片融化，充分研磨後，立即加入到預熱好的提取緩衝液中，均勻搖動；
3.65°C水浴20 min後冷卻至室溫,4 °C 12000 rpm離心10 min ；
4.取上清，加入等體積的10M的LiCl混合，4°〇溶液過夜，然後4 °C 12000 rpm離心20 min ；
5.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉澱，4 V 12000 rpm離心5 min，棄上清；
6.用500uL的SSTE溶解沉澱，然後加800 mL的trizol，搖勻後加200 mL氯仿，4°C 12000 rpm 離心 10 min ；
7.取上清，加入等體積氯仿:異戍醇(24:1),潤旋混勻。4 °C, 12000 rpm離心10 min ；
8.取上清,加等體積異丙醇，-20。(!'沉澱至少20min, 4 °C, 12000 rpm離心10 min ；
9.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉澱，連續洗滌兩次，乾燥沉澱，得純鐵皮石斛
RNA。
[0010]三、結果與分析
1、對鐵皮石斛種質78X72和A39用本發明方法提取的總RNA進行OD值檢測。結果見表1。
【權利要求】
1.一種提取鐵皮石斛RNA的方法，其特徵在於包括下述過程: 用液氮冷卻研缽將鐵皮石斛幼嫩葉片研磨，充分研磨後，立即加入到預熱好的CTAB提取緩衝液中，均勻搖動；將鐵皮石斛組織與提取液混合物置於65°C水浴條件下20 min後，冷卻至室溫，4 °C, 12000 rpm離心10 min,其特徵在於:它還包括下述步驟: a.所述的鐵皮石斛組織與提取液混合物經離心後的上清液，以等量的10M LiCl混合，溶液在4 1:條件靜置8-12小時，4 1:條件下，12000 rpm離心20 min ； b.上清液,用75%乙醇清洗沉澱,在4°C條件下，12000 rpm離心5 min,棄上清液； c.SSTE溶解沉澱,然後加入trizol,搖勻後加入氯仿,4 O條件下，12000 rpm離心10min ； d.上清液，加入與上清液等體積氯仿與異戊醇的混合液，其中氯仿:異戊醇按24:1比例配合，在4 1:條件下，12000 rpm離心10 min ； e.取上清液，加與上清液等體積異丙醇，-201:沉澱至少20 min, 4 1:條件下，12000rpm 離心 10 min ； f.棄上清，用500uL的75%乙醇清洗沉澱，連續洗滌兩次，乾燥沉澱，得純鐵皮石斛RNA。
【文檔編號】C12N15/10GK103484448SQ201310103040
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年3月28日 優先權日:2013年3月28日
【發明者】李聰, 斯金平, 朱玉球, 高燕會 申請人:浙江農林大學