一種控制草莓試管苗玻璃化的組織培養方法與流程
2023-05-22 01:21:11 3
本發明涉及一種草莓組織培養方法，特別指一種控制草莓試管苗玻璃化的組織培養方法。
背景技術：
：目前，植物組織培養技術被公認為解決草莓病毒病、快速繁殖草莓脫毒苗最有效的方法。草莓組織培養分為外植體處理、初代培養、繼代增殖培養、生根培養、馴化移栽等過程，採用的外植體類型有莖尖、花葯、根、葉及葉柄等草莓組織。但是，在草莓繼代增殖培養中，玻璃化問題是急需解決的一大難題。發生玻璃化的試管苗，其組織結構和生理功能異常，分化增殖能力低且生根困難，嚴重影響草莓試管苗的規模化生產。玻璃化現象的發生與培養基中的激素濃度、瓊脂濃度、添加劑和離子濃度配比等均有關係。李勝在《植物試管苗玻璃化現象研究進展》（甘肅農業大學學報2003，3（1）：1-16）中分析認為高濃度6-BA對玻璃化的產生有一定的促進作用，通過降低培養基中6-BA濃度達到減少玻璃化發生。但採用低濃度6-BA的培養基進行草莓繼代增殖培養，草莓不定芽的增殖係數較低。同時隨著繼代數的增加，持續多代使用相同濃度6-BA的培養基，在實際生產過程中還是會存在較高的玻璃化現象。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種控制草莓試管苗玻璃化的組織培養方法，這是一種可提高草莓試管苗增殖係數、有效控制草莓增殖培養過程中發生玻璃化的組織培養方法。本發明是通過以下步驟的技術方案來實現的：1）莖尖消毒接種，在誘導培養基上進行分化誘導培養，獲得再生小植株；2）在添加不同濃度6-BA的繼代培養基上進行三次繼代增殖培養；3）在生根培養基上，對繼代增殖培養形成的植株進行誘導生根。本發明還包括以下技術方案：所述步驟1）中接種選取的莖尖半圓球形頂端分生組織大小為0.3mm~0.4mm。所述步驟1）中誘導培養基配方為：MS基本培養基+1.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+10g·L-1瓊脂+30g·L-1蔗糖，培養基PH值5.5~6.0。所述步驟1）中誘導培養時間為35～40d。所述步驟2）中進行繼代增殖培養的試管苗為分化形成的未出現玻璃化的小植株。所述步驟2）中第一、二、三次繼代增殖培養所用MS基本培養基中添加的6-BA濃度不一樣，其他成分一樣，其他成分包含有瓊脂10g·L-1+蔗糖30g·L-1+0.1mg·L-1NAA,培養基PH值5.5~6.0，在第一、二、三次繼代增殖培養中添加的6-BA濃度分別為1.0mg·L-1、0.8mg·L-1、0.6mg·L-1。所述步驟2）中每次繼代增殖培養時間為25～30d。所述步驟3）生根培養基配方為：1/2MS基本培養基+10g·L-1瓊脂+20g·L-1蔗糖。所述步驟1）、所述步驟2）、所述步驟3）中組織培養條件為：在培養室內培養，培養溫度16℃~22℃，光照強度為1500lx~2000lx，每天光照時間12h。本發明具體步驟如下：（1）將經過消毒的草莓莖尖在解剖鏡下由外向內逐層剝去幼葉，直至露出半圓球形頂端分生組織，切取0.3mm~0.4mm左右大小莖尖接種於含有1.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1NAA、10g·L-1瓊脂、30g·L-1蔗糖的MS培養基上進行分化誘導培養，培養基PH值5.5~6.0。在培養室內培養，培養溫度16℃~22℃，光照強度為1500lx~2000lx，每天光照時間12h。（2）35～40d後將分化形成的未出現玻璃化的小植株開始進行繼代增殖培養，每隔25d～30d繼代增殖培養一次，培養基為MS基本培養基，每次繼代增殖培養除添加的6-BA濃度不一樣外，其他成分均一樣，其他成分包含有0.1mg·L-1NAA、10g·L-1瓊脂、30g·L-1蔗糖，培養基PH值5.5~6.0。在第一、二、三次繼代增殖培養中添加的6-BA濃度分別為1.0mg·L-1、0.8mg·L-1、0.6mg·L-1。（3）將繼代增殖培養中已形成完整植株，且植株高度達到2cm以上的試管苗接種到1/2MS培養基上誘導生根。培養基其他成分包含有10g·L-1瓊脂、20g·L-1蔗糖。本發明的有益效果是：在草莓試管苗第一、二、三次繼代增殖培養過程中逐代降低培養基質中的6-BA濃度，在保證草莓試管苗較高的增殖係數的前提下，可控制草莓組培苗玻璃化，前三次繼代增殖培養中草莓試管苗增殖係數均值達到6.01，玻璃化率均值控制在26.25%。附圖說明圖1為本發明的工藝流程圖。具體實施方式以下結合具體實施例對本發明進行詳細介紹。實施例：在3-5月選取生長健壯的「紅顏」草莓母株上新長出的匍匐莖頂端3～4cm長的頂芽，用含少量洗潔精的自來水浸泡30min，再用自來水衝洗30min，最後用無菌水衝洗3次，然後轉至超淨工作檯進行滅菌處理。具體滅菌處理方法為：先用75%乙醇處理30s，無菌水衝洗3次後用0.1%HgCl2處理7min，最後用無菌水衝洗5～6次。滅菌後在超淨工作檯上進行接種。在解剖鏡下由外向內逐層剝去幼葉，直至露出半圓球形頂端分生組織，切取0.3mm~0.4mm左右大小莖尖接種於裝有誘導培養基的三角瓶（50ml）內進行培養，每瓶接種4個莖尖。誘導培養基的成分為MS+1.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+10g·L-1瓊脂+30g·L-1蔗糖，培養基PH值5.5~6.0，15～20d後更換一次誘導培養基。培養條件為光照1500lx~2000lx，12h/d，溫度16℃~22℃。在接種35～40d後將分化形成的小植株開始進行繼代增殖培養，第一、二、三次繼代增殖培養所用MS基本培養基中添加的6-BA濃度不一樣，其他成分一樣，其他成分包含有10g·L-1瓊脂+30g·L-1蔗糖+0.1mg·L-1NAA,培養基PH值5.5~6.0。繼代增殖培養的接種材料均選用未出現玻璃化現象的小植株，每次繼代培養時間均為25d～30d。培養條件為光照1500lx~2000lx，12h/d，溫度16℃~22℃。在MS培養基中添加不同濃度6-BA的繼代培養基的具體組成和繼代培養效果如表1所示。由試驗結果可知，從保持草莓試管苗高水平的增殖係數，同時又能控制試管苗玻璃化的發生率角度來看，處理1的試驗效果是最好的。處理2和處理3雖然試管苗的玻璃化率更低，但試管苗的增殖係數不高，不利於試管苗的擴繁。表1不同濃度6-BA對各繼代培養的草莓試管苗增殖和玻璃化影響 繼代次數處理編號6-BA濃度增殖係數玻璃化率/%第一次繼代CK1.5mg·L-16.95a7.06a11.0mg·L-16.21b0b20.8mg·L-15.10c0b30.6mg·L-13.77d0b第二次繼代CK1.5mg·L-16.24ab56.84a10.8mg·L-16.75a48.08b20.6mg·L-15.10bc40.79c30.4mg·L-14.39c27.98d第三次繼代CK1.5mg·L-15.72a41.32a10.6mg·L-15.06b30.66b20.4mg·L-14.52b29.27b 30.2mg·L-13.29c14.43c前三次繼代培養的均值比較CK6.30a35.07a16.01a26.25b24.91b23.35c33.82c14.14d註：小寫英文字母表示不同處理差異，代表Duncan分析中差異達到0.05顯著水平。將繼代增殖培養中已形成完整植株，且植株高度達到2cm以上的試管苗接種到1/2MS培養基上誘導生根。15d～20d後，當試管苗根長至2cm以上，生根數達2根以上，苗高5cm以上時進行馴化移栽。當前第1頁1 2 3