PML-RARα融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物和試劑盒的製作方法

2023-05-21 15:13:26

PML-RARα融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物和試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種PML-RARα融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物和試劑盒；解決以往白血病微小殘留病檢測中易出現假陽性、檢測成本高、操作複雜、檢測時間長的問題，根據PML-RARα基因序列，利用PrimerExplorer V4軟體設計多組引物，篩選到一對特異性內引物F3、B3和一對特異性外引物FIP、BIP，並且建立了急性早幼粒白血病微小殘留病PML-RARα基因檢測的試劑盒。本試劑盒擴增效率高、特異性好、對儀器設備要求低，只需要恆溫水浴鍋即可，臨床上容易做到，檢測時間不超過1個小時，比常規PCR節約一半以上時間。
【專利說明】PML-RAR α融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物和 試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因的快速檢測方法，尤其涉及一種PML-RARa融合基因的環介導等 溫擴增檢測方法的引物和試劑盒。

【背景技術】
[0002] 急性早幼粒細胞白血病（APL)是臨床上最兇險的一類非淋巴細胞白血病，由於誘 導分化劑全反式維甲酸和三氧化二砷的應用，APL完全緩解率已達到80%以上。但白血病 復發一直是困擾臨床進行緩解後鞏固、維持治療及影響患者總生存期的主要障礙，而復發 的根源主要是來自體內殘留白血病細胞,即急性白血病微小殘留病（MRD)。緩解後的白血病 患者需要定期檢測微小殘留細胞以預防復發，簡便而準確的快速檢測將會極大方便患者復 查，提高複查率，及時就醫，提高存活率。染色體t (15 ; 17) (q22 ;q21)易位，形成PML-RARa 融合基因是APL的特異性標誌，陽性率約佔98%。檢測PML-RARa融合基因表達，可以了解 白血病細胞在治療中的消減情況，對監測MRD具有重要意義。
[0003] 目前檢查PML-RAR a基因主要通過PCR或實時螢光定量PCR。PCR耗時長、靈敏度 和特異性低、儀器要求高。實時螢光定量PCR方法雖然特異性和靈敏度有所提高，但是需要 產生螢光的引物和探針，還需要昂貴的檢測設備，而且需要2-3個小時。
[0004] 環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 2000 年開發的一種新穎的恆溫核酸擴增方法，與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循 環、電泳及紫外觀察等過程，具有簡單、快速、特異性強的特點，可以不依賴任何專門的儀器 設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低於螢光定量PCR，該方法推廣期主要面對微 生物檢測，現在已經廣泛應用於微生物檢測領域，並有很多相關專利獲得授權，但因研究人 員了解不足，而且人體基因比微生物更複雜，目前國內外均未見使用LAMP方法檢測白血病 PML-RARa基因的報導。
[0005] 針對同一段基因序列設計的LAMP引物存在擴增效率和特異性等多方面差異， LAMP引物可以通過軟體自動生成，但是否能從眾多引物組中篩選到快速、特異的引物是 LAMP法檢測基因的關鍵。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種PML-RAR a融合基因的環介導等 溫擴增檢測方法的引物和試劑盒。
[0007] 為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
[0008] -種PML-RARa融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物，由內引物F3:其核 苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；內引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；外引物FIP : 其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；外引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0009] 上述引物在檢測急性白血病微小殘留病中的應用。
[0010] 一種PML-RARa融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的試劑盒，內含LAMP反應 液、陽性對照、陰性對照，所述LAMP反應液的成分為：0. 04 μ mol/ μ L pH 8. 8的Tris-HCl， 0. 02 μ mol/ μ L KC 1,0. 016ymol / μ L MgSO4, 0. 02 μ mol/ μ L (HN4) 2S〇4? 〇· 〇〇2 μ 1/ μ L Tween2tl, 6 μ mol/μ L 甜菜鹼，0· 0028 μ mol/μ LX 4 種 dNTPs，IOU/μ L 逆轉錄酶，8U/μ L Bst DNA 聚合酶，0· 00005 μ mol/ μ L I丐黃綠素，0· 2pmol/ μ L F3,0· 2pmol/ μ L Β3,1. 6pmol/ μ L FIP, I. 6pmol/y L BIP ；
[0011] 所述陽性對照為：反應時在反應液中加入PML-RARa RNA表達陽性的ΝΒ4細胞的基 因組RNA ;
[0012] 陰性對照為：反應時在反應液中加入超純水。
[0013] PML-RAR a融合基因 mRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0014] 上述試劑盒中LAMP反應液為1ml、陽性對照50 μ L、陰性對照1ml。
[0015] 上述試劑盒還包括：反應管50個，10 μ L移液器頭100個。
[0016] 上述試劑盒的使用方法：取20 μ L反應液置於反應管中，將5 μ L待檢RNA加入反 應液內，用移液器吹打混勻，蓋好反應管的蓋子，將反應管置於水浴鍋中進行擴增，擴增條 件為：60-65°C水浴恆溫反應25-30min ;用戶在初次使用時需要設置陰性對照和陽性對照。
[0017] 本發明的有益效果：
[0018] 為了解決以往白血病微小殘留病檢測中易出現假陽性、檢測成本高、操作複雜、檢 測時間長的問題，本發明篩選到用LAMP法檢測PML-RARa基因的引物，建立了急性早幼粒 白血病微小殘留病PML-RARa基因檢測的基因及試劑盒。反應液中預先加有逆轉錄酶，逆 轉錄和基因擴增一步完成，而不需要預先將RNA逆轉錄成cDNA再進行DNA擴增，簡化了操 作步驟。
[0019] 本試劑盒擴增效率高、特異性好、對儀器設備要求低，只需要恆溫水浴鍋即可，臨 床上容易做到，檢測時間不超過1個小時，比常規PCR節約一半以上時間，而且PCR結束之 後需要通過電泳判斷結果，電泳所用DNA染料EB有劇毒。相比之下，採用本試劑盒，實現了 基因擴增和結果判定一步完成，操作簡單、結果準確直觀、特異性與敏感性高、對人體安全、 不汙染環境，適合於各級醫院快速診斷M2型急性白血病微小殘留病，排除了基層醫院難以 開展此類檢查的障礙，患者可以就近檢查，而不用再長途奔波到條件好的大醫院，方便了患 者，節省了費用，為救治生命節約了寶貴時間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為裸眼目視觀察反應結果，其中，1號管為檢測管，2號管為陽性對照，3號管為 陰性對照；
[0021] 圖2為靈敏度檢測，其中，1-6號管中加入的為倍比稀釋的RNA，濃度依次為2000、 200、20、2、0. 2、0. 02ng/y 1，1-4 號為陽性，5-6 號為陰性；
[0022] 圖3為目視檢測試劑盒特異性結果，1-5號管為白血病患者樣本，6號管為NB4細 胞，7-11號管為正常人樣本；1-6號為陽性，7-11為陰性。

【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0024] 實施例1
[0025] 1.材料與方法
[0026] I. 1樣本：用培養的NB4細胞的基因組總RNA作為標準品用於本方法的建立，臨床 樣本採用抗凝外周血或骨髓〇. 2-1. 0ml。
[0027] 1. 2基因組總RNA提取：利用商品化的RNA提取試劑盒（購自北京天恩澤生物技 術有限公司，型號為3701-50)抽提總RNA，室溫操作。
[0028] 抽提總RNA具體操作步驟：
[0029] (1)將0· 2-1. 5mL抗凝全血13000g離心3分鐘，棄上清；
[0030] ⑵將ImL溶液A加入到血液細胞沉澱中，用移液槍吹打沉澱使細胞裂解；
[0031] (3)將〇· 3mL的溶液B和0· 2mL氯仿加入離心管，劇烈震蕩30秒，13000g離心5 分鐘，將上清液轉移到另一乾淨離心管中；
[0032] (4)加入0· 5mL的溶液C和0· 2mL的氯仿到上清液中，劇烈搖晃30秒，13000g室 溫離心3分鐘，將上清液轉移到另一乾淨離心管中；
[0033] (5)在上清液中加入體積為其1/2的溶液D，劇烈搖晃30秒，13000g離心5分鐘， 移棄上清液；
[0034] (6)在離心管中加入ImL體積分數為75%的乙醇，振蕩器上振蕩混均30秒，離心 13000g 1分鐘，吸棄上清液；
[0035] (7)室溫放置2分鐘，加入10-30 μ L無 RNase水使RNA沉澱溶解，即為總RNA。
[0036] 1.3引物設計及篩選
[0037] 根據 PML-RARa 基因序列，利用 Primer Explorer V4 軟體（https:// primerexplorer. jp)設計多組引物，每引物組包括一對特異性內引物F3、B3和一對特異性 外引物FIP、BIP，根據反應時間及特異性對不同引物的反應進程和結果進行監測、篩選，確 定反應快、特異性高的最佳引物。篩選到的引物序列見表1。
[0038] 表1篩選到的PML-RAR a融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的最佳引物名稱與 序列
[0039]

【權利要求】
1. 一種PML-RARa融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的引物，其特徵在於，由內引 物F3:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；內引物B3:其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 外引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；外引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示。
2. -種PML-RARa融合基因的環介導等溫擴增檢測方法的試劑盒，其特徵在於， 內含LAMP反應液、陽性對照、陰性對照，所述LAMP反應液的成分為：0. 04 ii mol/ii L pH 8.8 的 Tris-HCl，0.01iimol/iiL KCl，0.016iimol/iiL MgS04,0.01iimol/iiL(HN4)2S04， 0? 04 ii 1/20 ii L Tween2(l，1. 6 ii mol/ ii L 甜菜鹼，0? 056 ii mol/ ii L x 4 種 dNTPs，200U/ ii L 逆 轉錄酶，160U/ ii L Bst DNA 聚合酶，50pmol/ ii L 鈣黃綠素，1. 6pmol/ ii L 引物 F3,1. 6pmol/ U L 引物 B3,0. 2pmol/ii L 引物 FIP，0. 2pmol/ii L 引物 BIP ; 所述陽性對照為：反應時在反應液中加入PML-RARa表達陽性的NB4細胞基因組總 RNA ;陰性對照為：反應時在反應液中加入超純水。
3. 如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，LAMP反應液為lml、陽性對照50 ii L、陰性 對照lml。
4. 如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，上述試劑盒還包括：反應管50個，10 y L 移液器頭100個。
5. 如權利要求3-4任一所述的試劑盒的使用方法，其特徵在於，取20 y L反應液置於反 應管中，將5 ii L待檢RNA加入反應液內，用移液器吹打混勻，蓋好反應管的蓋子，將反應管 置於水浴鍋中進行擴增，擴增條件為：60_65°C水浴恆溫反應25-30min。
6. 如權利要求5所述的使用方法，其特徵在於，初次使用本試劑盒時設置陰性對照和 陽性對照。
【文檔編號】C12N15/11GK104328211SQ201410682429
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月24日 優先權日:2014年11月24日
【發明者】姜國勝, 李奉京 申請人:山東省醫學科學院基礎醫學研究所, 北京藍譜生物技術開發有限公司