一種同時鑑別食品中四種肉類成分的多重pcr方法
2023-05-21 20:45:01
專利名稱：一種同時鑑別食品中四種肉類成分的多重pcr方法
技術領域：
本發明屬於食品質量安全檢測技術領域，具體涉及應用通用引物多重PCR法對食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的同時快速檢測方法及其應用。
二.
背景技術：
肉和肉製品摻雜摻假是我國食品質量控制面臨的重要挑戰之一。不法企業在利益的驅使下使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類原料，冒充牛肉、羊肉製品進行銷售，嚴重侵犯了消費者的合法權益。「牛肉膏」事件的曝光使得肉類摻假進一步成為公眾關注的焦點。傳統的依靠感官與經驗的肉類形態學鑑別手段已遠不能滿足對肉製品摻假現象進行控制與監管的需要，因此，對於我國肉製品市場佔有率較高的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉，建立科學、準確快速高通量篩選方法已十分必要。以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的技術已逐步成為了食品中肉類種屬鑑定的核心方法。許多學者根據不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現食品中特徵基因片段的指數級擴增，繼而通過電泳檢測鑑別食品中可能的物種來源。近年來， 實時螢光PCR技術的飛速發展大大提高了食品中物種鑑別的效率和靈敏度，並使得肉類含量的定量溯源成為可能。在目標基因選擇方面，動物線粒體基因組DNA序列具有高度的物種特異性，且由於拷貝數多而在食品加工過程不完全降解，因此其多態性位點是設計肉類成分定性檢測的首選靶點。目前，根據線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物，所建立的PCR與實時螢光PCR方法已見大量報導，且進入了國內權威的檢測技術標準。在實際檢測中，尤其需要對大量的食品樣本進行肉類摻假的篩選時，提高檢測效率與通量對於及時監管十分重要。以多重PCR為基礎，建立多種肉類成分同時鑑別的快速檢測技術是提高效率的有效途徑之一。然而目前，針對我國肉類摻假現狀，應用多重PCR的肉類快速同時鑑別與篩選技術尚未見報導。
三.
發明內容
本發明需要解決的問題是根據動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，利用正向引物共用、反向引物特異的策略，建立用於豬、牛、羊、雞4種肉類DNA快速檢測的通用引物多重PCR體系，通過電泳檢測擴增產物分子量大小對物種加以鑑別，可在同一反應體系中實現4種肉類成分的同時檢測。首先，通過對多種常用動物基因組DNA提取方法的比較選擇高效穩定的肉製品中總DNA提取方法；然後，基於動物線粒體細胞色素b基因的特異性位點，設計多重PCR引物；接著，進行多重PCR檢測方法優化及特異性、靈敏度考察；最後，應用此方法對80份食品盲樣進行檢測以驗證其實用價值。本發明中，基於動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，設計5條長度不同的通用引物多重PCR引物，其中雞、牛、羊、豬的產物片段分別為216bp、263bp、320bp和387bp，建立並優化多重PCR反應體系，通過電泳檢測擴增產物分子量差異實現4種肉類的快速鑑別。本發明的技術方案包括1.分別使用DNeasy組織細胞DNA提取試劑盒、SDS-蛋白酶K法及CTAB-蛋白酶K法提取生鮮的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉中的總DNA，產物測定於260nm 和280nm處的吸光度值，計算DNA濃度和純度，比較提取效率和純度，確定提取肉類中總DNA 的方法。2.設計併合成多重PCR的引物。3.多重PCR檢測反應條件及優化。4.針對提取的動物基因組總DNA進行多重PCR檢測，考察方法的特異性與靈敏度。5.對大量食品樣品進行盲樣檢測。I.分別使用DNeasy試劑盒、經典的SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法提取豬、 牛、羊、雞4種肉類的總DNA。表I列出了應用3種方法對生鮮肉提取的結果。SDS-蛋白酶 K法與DNeasy試劑盒法所提取的DNA濃度處於同一個數量級，SDS-蛋白酶K法在濃度與純度方面均略優。CTAB-蛋白酶K法由於對肌肉組織消化效果較差，因此DNA提取效率顯著偏低。相比於SDS-蛋白酶K法，DNeasy試劑盒大大節省了提取時間，且無需使用苯酚、氯仿等有毒試劑，綜合考慮提取速度與效率，後續實驗中均採用DNeasy試劑盒提取食品中的總 DNA。表I 3種DNA提取方法的比較Table I Comparison of three DNA extraction methods
權利要求
1.一種同時快速鑑別食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重PCR方法，其特徵是由以下步驟構成(1)使用DNeasy組織細胞DNA提取試劑盒提取基因組總DNA；(2)基於動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，採用正向引物共用、反向特異性引物的策略設計5條通用引物多重PCR引物，建立並優化多重PCR反應體系，通過電泳檢測擴增產物分子量差異實現4種肉類的快速同時鑑別，多重PCR的反應體系為PCR反應 50 μ L 體系反應緩衝液(10Χ ) 5μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4μ L, MgCl2 (2. 5mmol/L) 3μ L, Taq酶0.5 μ L，正向引物與4條反向引物(10 μ mol/L)各I μ L，模板2 μ L，反應條件為 940C 3min，30 個循環的 94°C >30s, 52°C >30s, 72°C >45s, 72°C >7min0
2.根據權利要求I所述同時快速鑑別食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重PCR方法，其特徵在於正向引物序列為5』-CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3』，反向特異性引物序列分別為雞 5』-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3』，牛 5』-CTAGAAAAGTGTAAGACC CGTAATATAA-3，，羊 5，-GCCTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGC-3，，豬 5，-GCTGATAGTAGATTTGTGATG ACCGTA-3』，雞、牛、羊、豬的特異性擴增產物片段分別為216bp、263bp、320bp和387bp。
3.權利要求I所述的同時快速檢測食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分的通用引物多重 PCR方法在食品質量控制和質量安全檢測中的應用。
全文摘要
本發明屬於食品質量安全檢測技術領域。具體涉及通過動物基因組DNA提取、引物設計和通用引物多重PCR方法(Universalprimers-multiplexPCR，UP-M-PCR)對食品中豬、牛、羊、雞4種肉類成分進行同時快速檢測。根據動物線粒體細胞色素b基因的差異性位點，利用正向引物共用、反向引物特異的策略，應用包含5條引物的通用引物多重PCR體系實現4種肉類成分的同時快速鑑別，結果表明，以上方法具有良好的針對該四種目標肉類成分的特異性，檢出限可達到皮克級，且反應體系各組分未見交叉幹擾。對市場上肉製品隨機抽取80份食品樣檢測驗證鑑別方法的準確性。總之，本發明建立了特異、靈敏、實用的食品中4種常見肉類成分快速篩選的多重PCR方法。
文檔編號C12Q1/68GK102605090SQ20121009965
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月31日 優先權日2012年3月31日
發明者何瑋玲, 周駿貴, 張馳, 楊軍 申請人:南京市產品質量監督檢驗院