一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法
2023-05-18 23:13:36
專利名稱：一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取菱殼中抗胃癌活性成分的方法。
背景技術：
菱角(water chestnut)原產於歐洲和亞洲的溫暖地區，為一年生蔓性水生草本植 物，在我國已有3000多年的栽培歷史。目前我國菱角的種植面積約40000公頃，年產量約 24萬噸。菱角出殼率在30%左右，據統計每年產出的鮮菱殼可達71000 72000噸。大量 菱角殼並沒有得到有效的利用，不僅汙染環境，也造成極大浪費。近年來，我國學者通過研 究發現菱殼中含有生物鹼、黃酮類物質、多糖類物質和揮髮油等功能性成分，研究表明菱殼 的水提取物具有抗癌活性。採用現代技術高效提取菱角殼中的抗癌活性成分，既能解決廢 棄菱角殼對環境的汙染，且對提高農副產品附加值、增加農民收入有非常重要的現實意義。目前關於從菱殼中提取抗胃癌活性成分的報導大多是以黃酮類、多糖類等常規的 植物性化合物作為指標物質研究，此類研究最終無非是單一活性物質的抗胃癌活性研究， 例如菱殼黃酮的抗胃癌活性。研究單一活性成分的抗胃癌作用已經有很長的歷史，但是在 抗胃癌的活性方面並沒有大的突破，且中藥講究的是配伍，通常混合物的活性最強。雖然體 外實驗證明上述單一活性物質均有體外抑癌活性，但是經過消化道的消化作用後活性情況 卻大打折扣，一般只有原有活性的30%左右。目前菱角類植物半仿生提取方法的應用未有報導，利用體外離體胃癌細胞模型作 為抗胃癌活性篩選的研究也沒有報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種提取物活性高、生產工藝簡潔的從菱殼中提 取抗胃癌活性成分的方法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法， 依次包括以下步驟1)、以菱殼粉作為原料，向原料中加入pH = 2的緩衝液以及佔原料總重 10%的胃蛋白酶，於37°C水浴靜止提取0.5 6h，然後離心，去除上清液，得濾渣；2)、在步驟1)所得濾渣中加入pH = 8的緩衝液和佔原料總重1 % 10%的胰蛋 白酶，於37°C水浴靜止提取0. 5 6h，離心，所得的上清液為具有抗胃癌活性的初提取液；3)、將步驟2)所得的上清液進行12000 14000轉/分鐘離心25 35min，離心 後所得液體經凍幹處理，得抗胃癌活性成分。作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的改進步驟3)為將所得的 上清液先於_20°C預凍0. 5小時，然後於-50 -60°C凍幹10 15小時。作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的進一步改進菱殼為南湖菱
o作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的進一步改進步驟1)中胃蛋白酶的活力為3000-3500NF U/mg，步驟2)中胰蛋白酶的活力為彡250NF U/mg。作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的進一步改進步驟1)中pH =2的緩衝液與原料的體積重量比為10 50mL pH = 2的緩衝液/g原料；3000轉/分鐘 離心lOmin。作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的進一步改進步驟2)中pH =8的緩衝液與原料的體積重量比為10 50mL pH = 8的緩衝液/g原料；3000轉/分鐘 離心lOmin。作為本發明的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法的進一步改進步驟3)中的 離心為13000轉/分鐘離心30min。在本發明的提取方法中，菱殼粉為乾燥處理後菱殼經粉碎而得，菱殼粉中的含水 率< 5% ；以菱殼粉作為原料，是為了提高提取效率。本發明中所述的南湖菱為南湖特產無 角菱。在本發明的提取方法中，步驟1)所述的pH = 2緩衝液為pH = 2的甘氨酸-鹽酸 緩衝溶液，步驟2)所述的pH = 8緩衝液為pH = 8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝溶液。 步驟1)和步驟2)中均採取了 37°C的仿生水浴條件。本發明中所使用的胃蛋白酶屬於消化系統胃的主要消化酶成分，所使用的胰蛋白 酶屬於消化系統小腸的主要消化酶成分；胃蛋白酶和胰蛋白酶均為普通市購品，例如，胃蛋 白酶可購自格源天潤生物技術有限公司，胰蛋白酶可購自格源天潤生物技術有限公司。為了檢測本發明所得的抗胃癌活性成分的性能，先將本發明所得的抗胃癌活性成 分按照0. 05g原料/ml高純水的料液比用高純水回溶，然後0. 22i!m無菌濾膜(水膜)過 濾，過濾後所得的濾液用於胃癌細胞處理，檢測提取物對胃癌細胞的抑制活性。抑癌實驗證 實，本發明所得的抗胃癌活性成分對胃癌細胞存活有顯著的抑制效果，具有開發成天然抗 胃癌藥物的潛在價值。本發明採用了將對胃癌細胞抑制活性為導向與提取方法相結合優化最佳的提取 工藝，本方法模擬了口服用藥消化道過程旨在提取經過消化道對細胞仍有抑制活性的成 分。半仿生提取是以提取物的生物活性為導向模擬口服給藥及藥物經胃腸道轉運，為 經消化道給藥的中藥製劑設計的一種新型的更有效的提取方法。將半仿生的提取方法應用 於菱角的抗胃癌活性成分的提取不僅可以保證提取物具有最佳的抗胃癌活性，而且也驗證 了提取物製成口服類藥物後經過消化道的消化作用後活性情況。現有技術關於菱殼中活性成分的提取與活性研究多採用黃酮或是多糖等位目標 物質，從某種程度上減弱了中藥中配伍的藥理，提取物的活性相對單一。採用本發明的方法 將提取物的抗胃癌活性作為提取的導向，可以保證提取結果有意義性與目標。同時，此提取 採用半仿生提取，未使用有機溶劑等，屬於安全、有效的提取方式。本發明的提取條件也比 較容易控制，所需時間僅為2 6小時，時間相對較短。因此，本發明較以往方法更易於工 業化生產，成本更低，提取效果更好。本發明所得的抗胃癌活性成分具體用法和用量如下口服，每kg體重服用5 15mg的抗胃癌活性成分。
具體實施例方式實施例1、一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，依次進行以下步驟1)、以lg菱殼粉作為原料，向原料中加入50ml的pH = 2的甘氨酸-鹽酸緩衝溶 液以及O.Olg的胃蛋白酶(活力為3000-3500NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取0. 5h，然後全 部轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，去除上清液，得濾渣。2)、在步驟1)所得濾渣中加入50mL pH = 8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝溶液 和0. 07g的胰蛋白酶(胰蛋白酶的活力為彡250NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取70min，然 後全部轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，回收上清液，上清液為具有抗胃癌活性的 初提取液。3)、將步驟2)所得的上清液分置於2mL離心管中，13000轉離心30min，離心後所 得液體經凍幹處理，具體如下將離心後所得液體分置於直徑10cm的平皿中，每個平皿5mL 離心後所得液體，於-20°C預凍半小時後，凍幹終點溫度為_54°C，凍幹時間為15小時；得作 為抗胃癌活性成分的凍乾粉。收集所有的凍乾粉，加入20ml的高純水進行回溶，即按照0. 05g菱殼粉(原料) 每毫升高純水的濃度進行回溶；得抗胃癌活性成分溶液。將上述實驗例1所得的抗胃癌活性成分溶液經0. 22 y m無菌濾膜(水膜)過濾， 所得濾液用於胃癌細胞(SGC7901)處理，用MTT法測胃癌細胞的存活率。結果該抗胃癌活 性成分對胃癌細胞的抑制率為0. 29，具有抑制胃癌細胞增殖的作用。實施例2、一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，依次進行以下步驟1)、以3g菱殼粉作為原料，向原料中加入30ml的pH = 2的甘氨酸-鹽酸緩衝溶 液以及0.06g的胃蛋白酶(活力為3000-3500NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取lh，然後全部 轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，去除上清液，得濾渣。2)、在步驟1)所得濾渣中加入30mL pH = 8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝溶液 和0. 12g的胰蛋白酶(胰蛋白酶的活力為彡250NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取70min，然 後全部轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，回收上清液，上清液為具有抗胃癌活性的 初提取液。3)、將步驟2)所得的上清液分置於2mL離心管中，13000轉離心30min，離心後所 得液體經凍幹處理，具體如下將離心後所得液體分置於直徑10cm的平皿中，每個平皿5mL 離心後所得液體，於-20°C預凍半小時後，凍幹終點溫度為_54°C，凍幹時間為15小時；得作 為抗胃癌活性成分的凍乾粉。收集所有的凍乾粉，加入60ml的高純水進行回溶，即按照0. 05g菱殼粉(原料) 每毫升高純水的濃度進行回溶；得抗胃癌活性成分溶液。將上述實驗例2所得的抗胃癌活性成分溶液經0. 22 y m無菌濾膜(水膜)過濾， 所得濾液用於胃癌細胞處理，用MTT法測胃癌細胞的存活率。結果該抗胃癌活性成分對胃 癌細胞的抑制率為0. 36，具有抑制胃癌細胞增殖的作用。實施例3、一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，依次進行以下步驟1)、以lg菱殼粉作為原料，向原料中加入40ml的pH = 2的甘氨酸-鹽酸緩衝溶 液以及0. lg的胃蛋白酶(活力為3000-3500NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取1. 5h，然後全 部轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，去除上清液，得濾渣。
2)、在步驟1)所得濾渣中加入40mL pH = 8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩衝溶液 和0.05g的胰蛋白酶(胰蛋白酶的活力為彡250NF U/mg)，於37°C水浴靜止提取lh，然後全 部轉入50mL的離心管中，3000轉離心lOmin，回收上清液，上清液為具有抗胃癌活性的初提 取液。3)、將步驟2)所得的上清液分置於2mL離心管中，13000轉離心30min，離心後所 得液體經凍幹處理，具體如下將離心後所得液體分置於直徑10cm的平皿中，每個平皿5mL 離心後所得液體，於-20°C預凍半小時後，凍幹終點溫度為_54°C，凍幹時間為15小時；得作 為抗胃癌活性成分的凍乾粉。收集所有的凍乾粉，加入20ml的高純水進行回溶，即按照0.05g菱殼粉(原料) 每毫升高純水的濃度進行回溶；得抗胃癌活性成分溶液。將上述實驗例3所得的抗胃癌活性成分溶液經0. 22 y m無菌濾膜(水膜)過濾， 所得濾液用於胃癌細胞處理，用MTT法測胃癌細胞的存活率。結果該抗胃癌活性成分對胃 癌細胞的抑制率為0. 37，具有抑制胃癌細胞增殖的作用。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是依次包括以下步驟1)、以菱殼粉作為原料，向原料中加入pH＝2的緩衝液以及佔原料總重1％～10％的胃蛋白酶，於37℃水浴靜止提取0.5～6h，然後離心，去除上清液，得濾渣；2)、在步驟1)所得濾渣中加入pH＝8的緩衝液和佔原料總重1％～10％的胰蛋白酶，於37℃水浴靜止提取0.5～6h，離心，所得的上清液為具有抗胃癌活性的初提取液；3)、將步驟2)所得的上清液進行12000～14000轉/分鐘離心25～35min，離心後所得液體經凍幹處理，得抗胃癌活性成分。
2.根據權利要求1所述從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是所述步驟3) 為將所得的上清液先於_20°C預凍0. 5小時，然後於-50 -60°C凍幹10 15小時。
3.根據權利要求2所述從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是所述菱殼為 南湖菱殼。
4.根據權利要求2或3所述的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是步驟 1)中胃蛋白酶的活力為3000-3500NF U/mg，步驟2)中胰蛋白酶的活力為彡250NF U/mg。
5.根據權利要求4所述的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是所述步驟1)中pH= 2的緩衝液與原料的體積重量比為10 50mL pH = 2的緩衝液/g原料；3000 轉/分鐘離心lOmin。
6.根據權利要求5所述的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是所述步驟2)中pH= 8的緩衝液與原料的體積重量比為10 50mL pH = 8的緩衝液/g原料；3000 轉/分鐘離心lOmin。
7.根據權利要求6所述的從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，其特徵是所述步驟3)中的離心為13000轉/分鐘離心30min。
全文摘要
本發明公開了一種從菱殼中提取抗胃癌活性成分的方法，依次包括以下步驟1)在菱殼粉中加入pH＝2的緩衝液以及胃蛋白酶，於37℃水浴靜止提取，離心；2)在步驟1)所得濾渣中加入pH＝8的緩衝液和胰蛋白酶，於37℃水浴靜止提取，離心；3)將步驟2)所得的上清液進行12000～14000轉/分鐘離心25～35min，離心後所得液體經凍幹處理，得抗胃癌活性成分。採用本發明方法所提取的抗胃癌活性成分具有活性高的特點。
文檔編號A61P1/00GK101869587SQ20101021320
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者於海寧, 寧穎, 沈生榮 申請人:浙江大學