Psmd4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用的製作方法
2023-05-19 14:38:41 1
專利名稱：Psmd4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種PSMD4蛋白的應用，具體地說，涉及PSMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用。
背景技術：
肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率長期居高不下。我國是世界上肝癌發病最多的國家，每年新發病例約佔全球50%。統計資料表明，肝癌術後高轉移復發率(5年復發率達70%，小肝癌也達50%)已成為進一步提高遠期療效的瓶頸，肝癌預後判斷指標匱乏。肝癌轉移是一個多因素參與並相互作用的複雜過程，即關乎癌細胞本身、又與癌細胞同癌周微環境及宿主免疫狀態的相互作用有關。目前至少有20餘種基因異常表達被確定與肝癌的發生發展有關，但已確定的肝癌相關基因在肝癌中異常表達率並不高，這些指標的敏感性及特異性尚難以滿足臨床預測要求。本領域迫切需要尋找能預測肝癌病情及預後的相關基因和/或蛋白，這方面的研究對臨床治療肝癌及預防腫瘤復發具有重要意義。PSMD4蛋白(蛋白酶體26S非ATP酶亞基4，GeneID:5710)。PSMD4的功能目前仍不十分清楚。有研究顯示，PSMD4可能與細胞分化和機體發育有關(參見文獻:Smalle，J.，etal., The pleiotropic role of the26S proteasome subunit RPNlOin Arabidopsisgrowth and development supports a substrate-specific function in abscisicacid signaling.Plant Cell, 2003.15(4):p.965-80.；Szlanka, T., et al., Deletion ofproteasomal subunit S5a/Rpnl0/p54causes lethality, multiple mitotic defectsand overexpression of proteasomal genes in Drosophila melanogaster.J CellSci, 2003.116(Pt6):p.1023-33.；Hamazaki, J.,et al.，RpnlO-mediated degradationof ubiquitinated proteins is essential for mouse development.Mol CellBiol, 2007.27(19):p.6629-38)目前為止，肝癌的發生的分子機制仍不清楚，有效的治療靶點和診斷標誌物也十分有限。目前尚無文獻報導PSMD4與肝癌復發或預後判定相關。
發明內容
本發明的目的在於提供PSMD4蛋白的新應用，特別是在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用。本發明人經過廣泛而深入的研究，首次發現，採用免疫組化方法檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達量，能夠判斷肝癌患者出現復發的風險及術後狀況。基於PSMD4蛋白的相對表達量與肝細胞癌的這種相關性，以該蛋白作為分子標記對其表達量進行檢測可以用於指導肝癌的預後判斷。
本發明提供了 PSMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用，該應用是指將PSMD4蛋白作為分子標記，利用PSMD4單克隆抗體或多克隆抗體， 以及免疫組化實驗試劑，分析PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達量。利用特異性抗PSMD4蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用於製備確定肝癌手術預後的製劑或試劑盒，這對於本領域技術人員來說是顯而易見的。所述的PSMD4多克隆抗體為商品化抗體，製備方法參見文獻Yokoyama, W.M.，Christensen, Μ.，Santos,G.D.and Miller, D.2006.Production of MonoclonalAntibodies.Current Protocols in Immunology.74:2.5.1 - 2.5.25。本發明還提供了使用上述試劑盒用於體外檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的表達量的方法，該方法包括以下步驟:Ca)利用本試劑盒中的免疫組化實驗試劑(二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶)標記羊抗兔IgG將肝癌組織切片進行免疫組化染色；(b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數碼照片；(c)利用生物圖像處理軟體分析腫瘤和瘤旁組織陽性信號強度，給出評分；(d)根據評分計算腫瘤組織中PSMD4蛋白分子表達量。所述的該方法具體步驟如下:(I)製備肝癌組織石蠟切`片，60°C烤箱過夜；(2)切片脫臘至水；(二甲苯① IOmin —二甲苯② IOmin —二甲苯③ IOmin — 100% 乙醇 5min — 95% 乙醇 5min — 85% 乙醇 5min — 75% 乙醇 5min —雙蒸水 5min)(3) 3%H202 甲醇液，室溫放置 20min ；(4)雙蒸水洗 5min X 3 ；(5)抗原修復:切片放入0.0IM檸檬酸鹽緩衝液(ρΗ6.0)中煮沸5min，停火lOmin，再煮沸5min ；(6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5minX3 ;(7) 1%BSA 封閉 30min，37 °C ；(8)甩去封閉液，不洗，直接加一抗(兔PSMD4多克隆抗體，購自ProteintechGroup公司，稀釋比例1:2000)。置入溼盒中30min，37°C，然後4°C冰箱過夜16小時；(9)4°〇取出，室溫復溫151^11，然後0.0謹PBS洗5minX4;(10)滴加二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，購自丹麥DAKO公司，即用型，無需稀釋)45min，37°C ；(11)0.0lM PBS 洗 5minX4，DAB 顯色 2-10min，鏡下觀察；(12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10秒；(13)分化後自來水返藍，蒸餾水浸泡；(14)脫水透明，蓋玻片覆蓋；(15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別於肝癌組織和癌旁組織各隨機選取3個視野，拍照；(16)採用Image Scope (Aperio公司)軟體對組織樣本進行掃描，掃描後採用該軟體的Algorithms (Positive Pixel Count)程序對每個樣本進行「陽性Pixel 」計算,獲得計算數據如下表:
權利要求
1.SMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用，其特徵在於，該應用是指將PSMD4蛋白作為分子標記，利用PSMD4單克隆抗體或多克隆抗體，以及免疫組化實驗試劑，分析PSMD4蛋白在肝癌組織中的相對表達量。
2.根據權利要求1所述的PSMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用，其特徵在於，其中的免疫組化實驗試劑是指二甲苯、乙醇、3%H202甲醇液、1%BSA封閉液、DAB顯色試齊U、蘇木素和辣根過氧化物酶。
3.根據權利要求1或2所述的PSMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用，其特徵在於，該應用是使用所述的試劑盒在體外檢測PSMD4蛋白在肝癌組織中的表達量，其檢測方法包括以下步驟: Ca)利用本試劑盒中的二甲苯，乙醇，3%H202甲醇液，1%BSA封閉液，DAB顯色試劑，蘇木素和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG將肝癌組織切片進行免疫組化染色； (b)利用顯微鏡和成像裝置拍攝為數碼照片； (c)利用生物圖像處理軟體分析腫瘤和瘤旁組織陽性信號強度，給出評分； Cd)根據評分計算腫瘤組織中PSMD4蛋白分子表達量。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種PSMD4蛋白的應用，具體地說，涉及PSMD4蛋白在製備肝癌預後評估試劑盒中的應用。本發明利用免疫組化技術、顯微鏡拍照和計算機圖像處理軟體測定腫瘤組織相對瘤旁組織中PSMD4蛋白相對表達量，並結合術後隨訪信息，確定PSMD4蛋白相對表達量與手術後肝細胞癌患者預後存在相關性，PSMD4蛋白能用於製備判斷肝癌患者預後的蛋白質分子標記，對於肝細胞癌病人術後監控和序貫治療也具有重要的指導意義。
文檔編號G01N33/577GK103091493SQ20131000549
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月8日 優先權日2013年1月8日
發明者王紅陽, 丁勁, 孫文, 李恆宇, 王雪, 向代民 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學