一種高通量毒品檢測的微流控晶片及應用的製作方法

2023-05-19 15:08:46 2

本發明屬違禁藥品的檢測領域，涉及一種高通量毒品檢測的微流控晶片裝置及其應用技術。

背景技術：

嗎啡(morphine)、冰毒(methamphetamine)、搖頭丸(mdma)等化學品雖然問世之初是為了治療人類疾病，緩解人類疼痛的，但因其在使用後具有嚴重的副作用，並且具有成癮性，因此也被列入了毒品名單。毒品的濫用，給人們的生活和生命安全都帶來了極大的影響和危害。

目前毒品檢測的方法主要包括前期的膠體金試紙檢測與後期法庭檢測所用的氣相色譜-質譜和液相色譜-質譜等方法。膠體金試紙檢測方法雖然可以快速現場檢測，但是單張試紙只能進行單個樣本單一毒品的檢測，且每張只能讀取單一試紙的檢測結果。同時，由於毒品種類的繁多，對於樣本的需求量也很大。

微流控晶片由於其消耗樣本少、成本低、操作簡單等優點，日益受到重視，被應用到了多種檢測當中。聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)、多聚賴氨酸、玻璃等材料的簡單易得，為毒品檢測提供了很好的方法。檢測對象只需提供少量樣本，即可實現多種毒品的檢測。同時，單張晶片上可以有多個檢測區域，並且可以同時檢測結果，大大方便了樣本的採集與檢測的進行。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種高通量毒品檢測的微流控晶片，由襯底層1、修飾層2、反應層3構成,反應層3由n(n≥1)個完全相同的反應模塊4組成，每個反應模塊4由入口5、反應通道6及出口7構成。

該發明裝置利用多層軟光刻技術製作出具有入口5，反應通道6以及出口7的反應模塊4，多個反應模塊4構成了反應層3。載玻片構成的襯底層1、多聚賴氨酸構成的修飾層2與pdms製作的反應層3組成了整個晶片裝置。

反應通道6的尺寸以及每個反應模塊4之間的距離設計時可以調節以改變反應模塊4的分布密度與總個數，實現不同數量樣本的同時檢測。反應通道6寬度優選500μm，高度優選300μm。

襯底層1使用載玻片，材料簡單易得。厚度優選1mm，長度優選77mm，寬度優選25mm。

修飾層2為多聚賴氨酸塗層。可以直接選用市面上的多聚賴氨酸載玻片，也可選擇普通載玻片自己包被多聚賴氨酸。多聚賴氨酸具有良好的生物相容性，常用作細胞培養，能夠形成親水的表面，利於待測樣本在晶片中的流動。

反應層3選用聚二甲基矽氧烷(pdms)為材料，pdms具有生物兼容性好，本身螢光背景低，加工簡單、價格低廉等優點，同時pdms具有很強的蛋白吸附作用，這一吸附作用不需要特殊的表面處理，通過預先吸附特定的抗原或抗體，即可實現對毒品的特異性檢測。反應層3的厚度可根據實際需要調節，優選3–5mm。

反應層3與塗有修飾層2的襯底層1之間封接採用等離子體處理反應層3，同時在反應層3底面塗敷甲苯與pdms的混合液的方式實現封接。

毒品對應的完全抗原首先使用移液槍從入口5加入反應通道6中。37℃烘乾超過12h。之後使用同樣的方法，在反應通道6中加入含有體積分數0.05％的tween-20的磷酸鹽緩衝液(pbst)封閉液，在溼盒中，37℃保持45min–1h30min。之後，在每個入口5添加15μlpbst封閉液，從出口7抽出，直到抽乾晶片內的液體。

本發明的另一個目的是提供所述微流控晶片在高通量毒品檢測中的應用。

晶片使用時，先將待測樣本與螢光乳膠微球溶液混合，之後添加在入口5。在出口7施加負壓，將混合溶液吸入反應通道6中。室溫下保持1h。之後從出口7把反應通道6中的液體都抽出。在每個入口5添加15μlpbst封閉液，從出口7加負壓，將晶片內液體都抽出。

將晶片放在紫外凝膠成像儀或其他有紫外光源的設備中成像，一次成像可以獲得所有反應通道6的螢光情況，分析每個通道的螢光強度與標準曲線對比即可獲得毒品的檢測結果。

本發明的特點：(1)修飾層為多聚賴氨酸，修飾後的晶片具有親水性，便於待測樣品流入晶片，同時也具有對毒品完全抗原的吸附作用；反應層材質為pdms，對毒品完全抗原具有很強的吸附能力。(2)多聚賴氨酸與pdms的配合使用，可以將多聚賴氨酸親水性的特點與pdms高蛋白吸附的特點結合起來，實現更好的檢測效果。(3)不同毒品、不同樣本的檢測發生在不同反應通道中，不會出現互相干擾的現象，降低非特異性吸附。(4)pbst封閉液的使用可以增強結果的螢光強度。(5)單張晶片上有多個反應模塊，可以在單張晶片上實現多個樣本以及多種毒品的現場同時檢測，實現高通量快速結果檢測分析。(6)反應模塊的尺寸、間隔以及個數可以根據需要調整，滿足不同的檢測需求。

附圖說明

圖1是本發明的實施例1、3、5、6的示意圖，其中1為襯底層，2為修飾層，3為反應層，4為反應模塊，5為入口，6為反應通道，7為出口。

圖2是本發明的實施例2示意圖，其中5為入口，6為反應通道，7為出口，8為陰性對照區域，9為陽性對照區域。區域10對應為3000ng/ml的冰毒檢測區，區域11對應為1000ng/ml的冰毒檢測區，區域12對應為750ng/ml的冰毒檢測區，區域13對應為500ng/ml的冰毒檢測區，區域14對應為250ng/ml的冰毒檢測區，區域15對應為100ng/ml的冰毒檢測區。

圖3是本發明的實施例2的結果圖。

圖4是本發明的實施例4的示意圖，其中5為入口，6為反應通道，7為出口，16為螢光乳膠微球連接區，17為空白對照。

圖5是本發明的實施例4的結果圖。

具體實施方式

本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。

實施例1晶片的製作

參見圖1，一種可實現高通量毒品檢測的微流控晶片，由襯底層1、修飾層2、反應層3構成，反應層3由24個完全相同的反應模塊4組成，每個反應模塊4由入口5、反應通道6及出口7構成。

襯底層1與修飾層2採用市面上售賣的已經包被了多聚賴氨酸的載玻片，優選厚度1mm，寬度25mm，長度77mm。

反應層3採用pdms為材料，採用多層軟光刻技術製作具有微通道結構的模具，在模具上澆注具有透氣性質的pdms固化脫模形成。反應層3的厚度可根據實際需要調節，優選3–5mm。

反應層3製作完成後，用直徑1mm的打孔器在入口5與出口7處打孔，之後使用甲苯與pdms的混合溶液塗在等離子處理過的反應層3底面，將其與修飾層2封接後，85℃加熱至牢固。

實施例2冰毒檢測標準曲線的製作(參見圖2)

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的磷酸緩衝液(pbs)稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進入到反應通道6中。其中陰性對照區域8內的3個反應模塊只通入pbs。晶片37℃烘乾過夜。

(2)在pbs中添加體積分數0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進入反應通道6中。晶片放入溼盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的螢光乳膠微球溶液。

(5)使用(4)中配置的混合液梯度稀釋冰毒標準品，濃度稀釋至3000ng/ml,1000ng/ml,750ng/ml,500ng/ml,250ng/ml和100ng/ml。

(6)將(5)中得到的冰毒樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應通道6中。其中陰性對照區域8與陽性對照區域9的6個反應模塊只通入帶有冰毒抗體的乳膠微球溶液。區域10通入濃度為3000ng/ml的冰毒，區域11通入濃度為1000ng/ml的冰毒，區域12通入濃度為750ng/ml的冰毒，區域13通入濃度為500ng/ml的冰毒，區域14通入濃度為250ng/ml的冰毒，區域15通入濃度為100ng/ml的冰毒。晶片放入溼盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成衝洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對晶片進行結果拍攝，之後採集每一條通道的螢光強度，分析結果。隨著冰毒含量的增加，螢光強度會減弱，從而得到標準曲線。檢測結果如圖3所示。

實施例3冰毒檢測

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進入到反應通道6中。晶片37℃烘乾過夜。

(2)在pbs中添加體積分數0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進入反應通道6中。晶片放入溼盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的螢光乳膠微球溶液。

(5)使用(4)中配置的混合液與冰毒樣本混合。

(6)將(5)中得到的冰毒樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應通道6中。晶片放入溼盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成衝洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對晶片進行結果拍攝，之後採集每一條通道的螢光強度，分析結果。沒有冰毒存在，則螢光強度會最強，而有冰毒存在，螢光強度則會減弱。通過與標準曲線對比，即可以得到檢測結果。

實施例4冰毒完全抗原對連接冰毒抗體的螢光乳膠微球的梯度濃度吸附實驗

參見圖4、圖5：

(1)將冰毒的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進入到反應通道6中。其中空白對照區域17內的3個反應模塊只通入pbs。晶片37℃烘乾過夜。

(2)在pbs中添加體積分數0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進入反應通道6中。晶片放入溼盒，37℃保持1h。

(3)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(4)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有冰毒抗體的螢光乳膠微球溶液。

(5)使用pbst梯度稀釋(4)中配置的帶有冰毒抗體的螢光乳膠微球溶液，濃度稀釋至10％,30％,50％,70％,100％。

(6)將(5)中得到的帶有冰毒抗體的螢光乳膠微球樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應通道6中。每個區域16中四個反應模塊通入相同濃度的螢光乳膠微球溶液。晶片放入溼盒中，室溫保持1h。

(7)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成衝洗。

(8)使用紫外凝膠成像儀對晶片進行結果拍攝，之後採集每一條通道的螢光強度，分析結果。螢光強度隨著螢光乳膠微球濃度的升高而增強，並且空白區域無螢光。

實施例5嗎啡檢測

(1)參考實施例2製作嗎啡檢測標準曲線。

(2)將嗎啡的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進入到反應通道6中。晶片37℃烘乾過夜。

(3)在pbs中添加體積分數0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進入反應通道6中。晶片放入溼盒，37℃保持1h。

(4)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(5)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有嗎啡抗體的螢光乳膠微球溶液。

(6)使用(4)中配置的混合液與嗎啡樣本混合。

(7)將(5)中得到的嗎啡樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應通道6中。晶片放入溼盒中，室溫保持1h。

(8)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成衝洗。

(9)使用紫外凝膠成像儀對晶片進行結果拍攝，之後採集每一條通道的螢光強度，分析結果。沒有嗎啡存在，則螢光強度會最強，而有嗎啡存在，螢光強度則會減弱。通過與標準曲線對比，即可以得到檢測結果。

實施例6搖頭丸檢測

(1)參考實施例2製作搖頭丸檢測標準曲線。

(2)將搖頭丸的完全抗原使用0.01mol/l，ph7.4的pbs稀釋至200μg/ml，使用移液槍，從每個入口5加3μl進入到反應通道6中。晶片37℃烘乾過夜。

(3)在pbs中添加體積分數0.05％的tween-20，配置成pbst包被液。將包被液用移液槍從每個入口5加3μl進入反應通道6中。晶片放入溼盒，37℃保持1h。

(4)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用具有抽拉功能的注射泵，將pbst從出口抽出。

(5)使用pbst配置2.4μg/ml的帶有搖頭丸抗體的螢光乳膠微球溶液。

(6)使用(4)中配置的混合液與搖頭丸樣本混合。

(7)將(5)中得到的搖頭丸樣本加在入口5，從出口7通過注射泵抽入反應通道6中。晶片放入溼盒中，室溫保持1h。

(8)在每個入口5添加15μlpbst，從出口7使用注射泵從出口抽出，完成衝洗。

(9)使用紫外凝膠成像儀對晶片進行結果拍攝，之後採集每一條通道的螢光強度，分析結果。沒有搖頭丸存在，則螢光強度會最強，而有搖頭丸存在，螢光強度則會減弱。通過與標準曲線對比，即可以得到檢測結果。