一種成纖維細胞生長促進劑及其應用的製作方法

2023-05-18 18:32:06 1

專利名稱：一種成纖維細胞生長促進劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種成纖維細胞生長促進劑技術領域和其應用的技術領域。
本發明所要解決的再一個技術問題是提供上述成纖維細胞生長促進劑的應用。
本發明解決上述首要技術問題所採用的技術方案為該種成纖維細胞生長促進劑，其特徵在於為具有下式結構的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
上述的海藻低聚寡糖是來自於紅藻瓊膠的降解寡聚糖，以5個瓊二糖或新瓊二糖的聚合單位以下的寡糖為主，即1≤n≤5。
本發明所要解決的再一個技術問題的技術方案是將上述成纖維細胞生長促進劑在預防紫外線造成皮膚損傷的護膚化妝品應用。
與現有技術相比，本發明的優點在於1、採用天然的海藻原料，原料廣泛；2、製備工藝簡單，無需基因工程方法或者昂貴的蛋白質純化方法；；3、單純的小分子碳水化合物，不是蛋白質，不會變性，更適合在護扶的化妝品上使用，安全可靠有效；4、成本經濟，適合其推廣使用。總之，海藻寡糖來自於純天然海藻原料，製備工藝簡單，產品安全無毒，具有明顯的成纖維細胞保護作用。根據本發明，可以將海藻寡糖作為特效生物活性成分添加到各類化妝、護膚品中，可以祛除防止紫外線輻射引起的皮膚損傷與皺紋，使皮膚彈性增強、有光澤並富於生氣。
實施例之一1.瓊膠寡糖的降解製備將瓊膠樣品配置成1.5％溶液，在50℃恆溫水浴中加入鹽酸至終濃度0.37mol/L，攪拌條件下反應4h，反應結束後以NaOH中和，加入4倍體積的乙醇，靜置過夜，減壓過濾，濾液減壓濃縮至近幹。降解產物經Sephadex G-10柱脫鹽，脫鹽後的產物冷凍乾燥，得率為35％。
2.瓊膠寡糖的組成分析(薄層色譜法)樣品溶解於50％乙醇中，在矽膠板上點樣，展開劑採用正丁醇/乙醇/水(3∶1∶1)，顯色劑採用百裡酚-硫酸，噴霧後100℃顯色5min，出現粉紅色斑點，標準寡糖樣品包括半乳糖、3，6-內醚半乳糖、新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖。斑點主要集中在新瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖以及更高分子量的寡糖斑點。
3.瓊膠寡糖對成纖維細胞生長促進活性測定本實驗在青島大學醫學院附屬醫院進行。
(1)成纖維細胞第10代體外培養的人體成纖維細胞。
(2)膠寡糖樣品將0.5g樣品溶解於2.5ml蒸餾水中，經過0.2μm濾膜過濾，4℃保存。
(3)在24孔細胞培養板上接種細胞，細胞密度為1×105個/ml，在37℃，5％CO2，飽和溼度條件下培育20h後，加入樣品溶液，然後在同樣條件下培育60min，培育結束後，在每個孔內加入5mg/ml MTT(Sigma產品)200μl，同樣條件下再培育4h，棄去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均勻，以1∶3轉移到96孔板(每孔100μl)，採用酶標儀在550nm讀取吸光度，共進行9組平行樣品測定。
(4)對成纖維細胞的生長促進作用按照下式計算生長促進率(％)＝[(A-A0)/A0]×100％]其中，A為樣品組的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。結果見表1，可以證明，瓊膠寡糖對人體成纖維細胞具有明顯的生長促進作用。
表1瓊膠寡糖對成纖維細胞的生長促進作用

實施之二1.從食品級瓊膠降解製備瓊膠寡糖採用食品級市售瓊膠配置成1％溶液，加入2216E固體培養基，經過瓊膠降解微生物降解2d，過濾後，在降解產物中加入3倍乙醇，離心後將溶液旋轉濃縮，冷凍乾燥。
2.瓊膠寡糖的分離製備將上述降解產物120mg，加入0.02％疊氮化鈉抗菌劑，上Sephadex G-25凝膠柱(900×26mm)，室溫下用恆流泵以40ml/h流速含有0.02％疊氮化鈉的水溶液洗脫，以部分收集器收集流分，每次收集6ml，用硫酸苯酚法檢測各試管中的糖濃度，結合薄層色譜檢測，得到二糖寡聚度為1-5的組分，合併洗脫液，旋轉濃縮後冷凍乾燥。
3.瓊膠寡糖對成纖維細胞紫外輻射氧化損傷的保護活性測定採用與實施例1基本相同的檢測方法同樣測定，在24孔細胞培養板上接種細胞，細胞密度為1×105個/ml，在37℃，5％CO2，飽和溼度條件下培育20h後，加入樣品溶液，然後在同樣條件下培育30min，然後用UVA輻射5s，輻射強度為1.91×10-3J/cm2，另外一組則用UVB輻射20s，輻射強度為1.176×10-4J/cm2，輻射結束後，再培育30min，然後在每個孔內加入5mg/ml MTT(Sigma產品)200μl，同樣條件下再培育4h，棄去上清夜，每孔加入DMSO 800μl，混合均勻，以1∶3轉移到96孔板，每孔100μl，採用酶標儀在550nm讀取吸光度，共進行9組平行樣品測定。採用與實施例1一樣的數據處理方式計算成纖維細胞的生長率。
結果見表2，通過對所得數據進行統計學分析可以得出結論UVA短時間照射5s，對成纖維細胞不僅沒有抑制作用，而且具有一定的生長促進作用，但是UVB確實能夠造成對成纖維細胞的損傷作用，而瓊膠寡糖樣品確實對紫外線造成的人體成纖維細胞的氧化性損傷具有明顯的保護作用，而且這種保護作用成顯著的量效關係。
表2瓊膠寡糖對紫外輻射損傷的成纖維細胞的保護與生長促進作用

作為本實施例的變更1.瓊膠的來源可以是石花菜、江蘺、紫菜等紅藻。按照藻類資源的不同，在提取瓊膠的工藝上有所不同。
2.瓊膠寡糖的製備可以採用酸水解法，也可以採用酶水解法。精製瓊膠寡糖的方法可以採用Sephadex G-25凝膠色譜，也可以採用乙醇沉澱除去多糖後再脫鹽製備，或者採用分子截留值為3000的膜超濾方法製備。
權利要求
1.一種成纖維細胞生長促進劑，其特徵在於為具有下式結構的海藻低聚寡糖， 其中n＝1-10。
2.根據權利要求1所述的成纖維細胞促進劑，其特徵在於所述的海藻低聚寡糖是來自於紅藻瓊膠的降解寡聚糖，以5個瓊二糖或新瓊二糖的聚合單位以下的寡糖為主，即1≤n≤5。
3.一種根據權利要求1所述的成纖維細胞生長促進劑，其特徵在於在預防紫外線造成皮膚損傷的護膚化妝品方面應用。
全文摘要
本發明涉及下式的海藻低聚寡糖作為成纖維細胞生長促進劑,它具有作為紫外線氧化損傷保護劑的新用途,具有下式結構的低聚寡糖,來自於紅藻瓊膠的降解產物,可以進一步開發成為作為具有成纖維細胞生長促進作用及紫外線氧化損傷保護作用的護膚化妝品,其中n=1－10。
文檔編號A61P17/16GK1387857SQ02111990
公開日2003年1月1日 申請日期2002年6月6日 優先權日2002年6月6日
發明者嚴小軍, 周成旭, 範曉 申請人:嚴小軍