一種高效擴增間充質幹細胞的新方法

2023-05-11 17:27:21 1

專利名稱：一種高效擴增間充質幹細胞的新方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學領域，具體涉及一類促使間充質幹細胞體外大量增殖的新方法及應用。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有自我更新和遷徙能力的多能成體幹細胞，能夠分化形成多種組織細胞並釋放有益於組織再生修復的細胞活性因子，連續傳代培養和冷凍保存後仍具有多向分化潛能。因其沒有倫理學的約束，並且可以分化成具有相關功能的細胞或組織，從而成為實驗和臨床研究的重點。MSCs來源於多種組織，包括骨髓、臍帶血、外周血、脂肪等，但無論哪一種來源，其取材數量都是有限的，很難滿
足臨床移植所需的細胞數量要求。雖然MSCs在臨床治療上的前景和地位已經明確，但由於人體內幹細胞來源數量有限，僅靠傳統培養的方法難以在短時間內滿足臨床移植上對細胞數量的要求。因此，MSCs的體外擴增方法的探索一直是幹細胞研究領域的熱點問題。國內外已竟相開展這方面研究工作，取得了一些進展。目前，Chen等利用旋轉式生物反應器擴增人骨髓MSCs，另外添加幹細胞因子(Stem ce 11 factor, SFC)、白細胞介素-3 (Interleukin-3, IL-3)和 IL-6,檢測發現Stro-l+Q)44+a)34-的MSCs在8d後可擴增9倍,成纖維細胞集落形成率(Colony-formingefficiency-fibroblast per day, CFE-F/day)是未用生物反應器擴增的對照組的I. 44倍，擴增後的細胞可表達間充質幹細胞早期標誌波形蛋白(Vimentin)和Endoglin(SH2),而分化細胞的標誌如II型膠原、骨鈣素(Osteocalcin，Oc)和C/EBP-α等則未檢測到，並且這些細胞可分化為成骨細胞、成軟骨細胞及成脂肪細胞。Yu等也利用生物反應器成功在體外擴增出MSCs，如利用攪拌式生物反應器培養人胎盤來源的MSCs，與用培養皿擴增的對照組細胞相比較，培養144h後攪拌式生物反應器擴增的細胞數量是培養皿的I. 73倍，並且MSCs的表型特徵不變。通過氣升式環流中空纖維膜生物反應器對兔骨髓MSCs進行三維動態培養，7d後可擴增16倍，擴增後大部分細胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，並具有較強的成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力。這些研究表明，通過生物反應器不但可使MSCs在數量上得到擴增，還能夠保證MSCs維持原本的表型和分化能力，符合臨床移植用MSCs的基本生物學特徵。除了生物反應器，科學家們還發現了其他方法也有助於實現MSCs體外擴增。研究發現通過表面抗原篩選可以提高MSCs擴增效率。一般認為間充質幹細胞的表面抗原情況與造血幹細胞相反，即 CD31、CD34 為陰性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271 等為陽性。根據這一特性，Jarocha等通過免疫磁珠分離純化CD105+CD271+的人骨髓MSCs並擴增，表達CD105和CD271的成纖維細胞集落生成單位(Colony-forming unitfibroblastic,CFU-F)是未純化細胞的3-4倍。此外，其他一些影響MSCs體外擴增的因素也陸續被報導。有研究者通過改善培養基質實現MSCs的體外擴增，Zangi等用纖維蛋白微珠可有效將MSCs從大鼠骨髓中分離並且擴增。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血眾(Thrombin-activated platelet-rich plasma)分別作為擴增用血清,對人脂肪來源的MSCs進行擴增，結果表明第6代MSCs的擴增倍數分別為66. 6± 15. 7和68. I ±6. 7，而用胎牛血清擴增的倍數僅為24. 4±0. 7。除基質材料與血清的優化外，一些生長因子也有利於MSCs的擴增。如Tamama等證實表皮細胞生長因子(Epidermal growth factor,EGF)可通過使ERK及AKT磷酸化的途徑刺激人骨髓MSCs增殖，Farre等報導成纖維細胞生長因子-4 (Fibroblast growth factor-4, FGF-4)可使MSCs的複製周期顯著縮短且不改變其多向分化潛能。最近，Zscharnack等還發現氧濃度也可影響MSCs的擴增,他們通過比較5%和20%的氧氣濃度下MSCs的擴增，發現5%的氧濃度下MSCs形成的CFU-F比20%的氧氣濃度多2倍，並且老化程度也比20%的氧氣濃度輕。

發明內容

本發明的目的旨在針對MSCs體外大量擴增，以及在擴增時出現自主分化和伴隨的衰老及遷徙能力減退等問題，提供一種利用低劑量組蛋白去乙醯化抑制劑解決MSCs體外大量擴增的新方法。為了實現上述目的，本發明公布了一種通過向MSCs培養基中添加低劑量組蛋白去乙醯化抑制劑(Largazole，TSA)，經過7天培養，可使MSCs體外增殖21倍，並保持其自我更新能力。為臨床疾病治療提供足夠數量的間充質幹細胞。本發明涉及MSCs增殖的方法，包含將適量的小分子化合物添加到MSCs的培養基中。如上所述的添加物，其化合物類型是組蛋白去乙醯化酶抑制劑(HDACi)。研究發現，低劑量的去乙醯化酶抑制劑Trichostatin A(TSA)能使神經幹細胞重新表達0ct4等乾性相關轉錄因子，並使這些細胞額外獲得了形成造血細胞的能力。低濃度去乙醯化酶抑制劑VPA(150yg/mL)可以提高造血幹細胞的自我更新和增殖能力。用組蛋白乙醯化抑制劑anacardic acid(AA)的細胞治療法，可避免由c_MYC、PcG和pl6INK4A基因引起的複製性衰老，使幹細胞保持較強的自我更新能力。從而推測幹細胞分化和相關基因核心蛋白乙醯化程度有著重要的聯繫。如上所述的添加物，其是組蛋白去乙醯化抑制劑中的Largazole、TSA、VPA、NaBu等將其應用於MSCs的培養基中。如上所述的添加物，其組蛋白去乙醯化抑制劑Largazole或TSA在培養基中的濃度範圍是lpM/ml 10nM/ml之間。如上述所述的MSCs，其特徵是優先選取人成體MSCs ；如上述所述的MSCs，其特徵是優先選取成體骨髓MSCs ；如上述所述的MSCs，其特徵是優先選取人胎盤MSCs ；如上述所述的MSCs，其特徵是優先選取人脂肪MSCs ；如上述所述的MSCs，其特徵是優先選取人臍帶間充質幹細胞。根據人臍帶間充質幹細胞(hUC-MSCs)的生物學特性，細胞衰老分為三個階段早期(10代以內)，中期(10-15代)，晚期(16代以後)細胞到晚期後，各種生物學特性發生明顯變化，多能性基因表達量下降，衰老分化基因明顯增加。


圖I是實施方法一中評價不同濃度的Largazole對細胞增殖能力的影響圖。圖2是實施方法一中評價不同濃度的TSA對細胞增殖能力的影響圖。圖3是實施方法一中進一步驗證上面兩種藥物的最佳濃度圖。圖4是實施方案二中CCK8法測定P16的各組細胞生長曲線圖。圖5是實施方案三中評價不同培養條件對細胞增殖的影響圖。圖6是實施方案四中MSCs經HDACi處理後4代相關基因表達的變化圖。圖7是實施方案四中MSCs經HDACi處理後16代相關基因表達的變化圖。
具體實施例方式實施方法一.不同藥物濃度作用於細胞後對其增殖的影響a)選取人臍帶間充質幹細胞P4，以3000個/孔種植於96孔板中(設5個副孔)每孔100 μ L培養基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青黴素，鏈黴素)，在細胞貼壁後對照組更換新鮮培養基，處理組培養基中分別含有終濃度分別為100nm/ml、IOnm/ml、1000pm/ml、100pm/ml、10pm/ml的Largazole,置於5%的C02、飽和溼度、37度培養箱中培養5d後，通過CCK8法在酶標儀上以490nm波長檢測細胞吸光度值(OD)，評價不同濃度的Largazole對細胞增殖能力的影響(圖I.)。參照圖I.可知Largazole在pm級濃度均有一定的增殖作用，且在10pm/ml附近促進細胞增殖能力最強。b)選取人臍帶間充質幹細胞P4，以3000個/孔種植於96孔板中(設5個副孔)，在細胞貼壁後對照組更換新鮮培養基，處理組培養基中分別含有終濃度分別為100nm/ml、50nm/ml、20nm/ml、10nm/ml、5nm/ml的TSA，置於5%的C02、飽和溼度、37度培養箱中培養5d後，通過CCK8法在酶標儀上以490nm波長檢測細胞吸光度值(OD)，評價不同濃度的TSA對細胞增殖能力的影響(圖2.)。參照圖2可知，TSA在10nm/ml時OD值最高，也表明在此濃度下促進細胞增殖能力最強。c)為了進一步驗證上面兩種藥物的最佳濃度，選取人臍帶間充質幹細胞P4，以
4.2X IO4個/孔種植於六孔板，貼壁後各組分別換用不同的培養基對照組普通培養基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈黴素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養基置於5%的C02、飽和溼度、37度培養箱中進行培養48h，然後將細胞用胰酶消化，用血細胞計數板進行細胞計數，評價各組細胞增殖能力的變化(圖3.)。如圖3.可知，處理組的細胞增殖率明顯高於對照組。實施方案二 . CCK8法測定P16的細胞生長曲線，取P16生長狀態良好的細胞，用0. 25 %的胰酶消化製備單細胞懸液，以2000個/孔接種於96孔板貼壁後，各組分別換用不同的培養基對照組普通培養基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈黴素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養基置於5%的C02、飽和溼度、37度培養箱中。每天各組取3孔細胞分別加入10μ LCCK8試劑，37度孵育4h，用酶標儀檢測每孔吸光度值。以時間(天)為橫坐標，OD值(代表細胞相對數量)為縱坐標，連續觀察7天，繪製各組細胞生長曲線(圖4.)。從圖4可知，生長曲線分為潛伏期、對數生長期和平臺期，潛伏期在1-2天，對數生長期在2-5天，然後進入平臺期，處理組TSA和Largazole在對數生長期細胞分別擴增了 18和21倍，明顯高於對照組。可見低劑量組蛋白乙醯化抑制劑可以在短時間內極大地增加MSCs的數量。實施方案三.評價不同培養條件對細胞增殖的影響實驗在6孔板中進行，每孔種入4. 2 X IO4個細胞，分組方法同方案2，各組均設3個平行組。細胞培養4天後進行計數，再以相同的細胞個數進行種板傳代，連續培養18代，計算CPDL (cumulative population doubling level),從而評價不同條件對細胞增殖的影響(圖5.)。在處理組，細胞的增殖潛能明顯高於對照組，隨著傳代的增加，處理組的增殖潛能依然良好。 實施方案四.MSCs經HDACi處理後相關基因方面的改變。選取人臍帶間充質幹細胞按照方案2分組對照組普通培養基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈黴素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養基將MSCs種入60mm的培養皿中，細胞貼壁後，分別換成各組藥用培養基孵育3天後，去上清液，用PBS衝洗兩遍,加入Iml的trizol,用吸管進行吹打,使細胞脫壁,然後將其移至1.5ml的EP管中，室溫靜置5min。通過氯仿，異丙醇，乙醇將細胞中的RNA提取出來，反轉錄成cDNA後進行RT-PCR和Real_timePCR實驗，檢測幹細胞相關基因CXCR4，TERT,0CT4，Nanog的表達水平的變化(圖6.圖7.)。如圖6，7所示在MSCs的早期和晚期，遷徙因子CXCR4，與衰老相關的TERT，以及與多潛能性相關的乾性基因0CT4，Nanog在處理組的表達量明顯增高。並且在細胞早期和晚期HDACi對MSCs保持自我更新和增殖能力都有著一定的作用。
權利要求
1.本發明公布了一種高效擴增間充質幹細胞(MSCs)的新方法，將適量的小分子化合物添加到MSCs的培養基中，從而使MSCs高效擴增。
2.如權利I所述的小分子化合物，其特徵是組蛋白去乙醯化抑制劑。
3.如權利I所述的小分子化合物，其特徵是將組蛋白去乙醯化抑制劑的Largazole、TSA、VPA、NaBu等添加於MSCs的培養基中。
4.如權利I所述的小分子化合物，其特徵是組蛋白去乙醯化抑制劑Largazole或TSA在培養基中的最終濃度範圍是在ΙρΜ/ml ΙΟηΜ/ml之間。
5.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取成體MSCs。
6.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取人成體MSCs。
7.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取人臍帶MSCs。
8.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取人骨髓MSCs。
9.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取人胎盤MSCs。
10.如權利I所述的MSCs，其特徵是選取人脂肪MSCs。
全文摘要
本發明屬於生物醫學領域，公開了一種高效擴增間充質幹細胞的新方法。在體外擴增中，通過向間充質幹細胞培養基中添加低劑量的組蛋白去乙醯化抑制劑，可以有效地提高間充質幹細胞的體外擴增，並保持其自身的自我更新能力。為臨床疾病治療提供足夠數量的間充質幹細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102876629SQ20121018493
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者李富榮, 齊暉, 王雲帥, 鄧春豔 申請人:深圳市人民醫院