一種修飾量子點的新型多肽配體的製作方法

2023-05-11 20:28:06 2

專利名稱：一種修飾量子點的新型多肽配體的製作方法
技術領域：
本發明涉及納米生物技術領域，具體涉及ー種修飾量子點的新型多肽配體。
背景技術：
量子點(QDs)是ー種零維半導體納米晶體，近似球形，直徑f 12nm，可分散於水或者有機溶劑中形成膠體，由於QDs的尺寸接近甚至小於相應半導體相材料的激子(電子-空穴對)Bohr半徑，受激發時產生的電子和空穴被限制在狹小的三維空間，因而表現出量子效應，與傳統的有機染料相比，QDs具有更優異的光譜性質，如激發光譜寬且連續分布，而發射光譜呈對稱分布且寬度窄，顏色可調，並且光化學穩定性高，不易光解(Marcel BJ, MarioM, Peter G, et al. Science 1998，281，2013-2016)。這些優越的性能使 QDs 在體內細胞成像和生物特定標記等方面都得到了廣泛應用，它正在並將日益成為分子細胞成像研究中非常重要的一種探針工具。因此，具有高性能的水溶性量子點的合成受到了密切關注。目前，在生物標記中應用最廣泛的是金屬有機溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點。因此，必須將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs才能進行生物標記。而將脂溶性的QDs轉化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巰基小分子(如巰基こ酸、巰基丙酸、穀胱甘肽、巰基丁ニ酸等)取代脂溶性QDs表面的配體，然後通過偶聯劑與生物分子偶聯；另ー種常用的QDs標記生物分子的方法是與含有組氨酸標籤的多肽或蛋白結合。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基的金屬親和協調作用，含有組氨酸殘基的蛋白質和多肽能夠直接接到QDs表面的Zn原子，這種方法具有很好的穩定性，已逐漸成為生物標記中ー種常用的方法。Sapsford 等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem.C2007, 111，11528-11538)系統地研究了含組氨酸多肽與QDs之間的相互作用及結合常數等，6個組氨酸序列與QDs的結合速率是約100秒，KtT1約為InM ;但其結果證實組氨酸超過6個的線性多肽序列並不能提高結合速率，這可能是因為長鏈中的組氨酸不能全部與QDs結合；同時6個組氨酸序列與QDs的結合不是非常穩定，進入生物體內有可能被其他生物分子取代。因此，我們考慮改變組氨酸的結構，設計ー種新型的多肽配體，使更多的組氨酸與QDs結合，以此提高結合速率及穩定性，從而大大提高QDs在生物標記領域中的應用。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為了克服現有多肽配體與QDs結合速度慢、穩定性差等問題，限制其在生物領域中的普及使用，為解決上述技術問題，本發明提供ー種與QDs結合速度快，而且穩定性好的新型多肽配體。本發明解決其技術問題所採用的技術方案是一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在幹包括用於結合量子點的組氨酸序列(I)、提供多肽剛性結構的序列(2)、功能序列(3)和帶負電荷的序列(4)，各序列之間以肽鍵相結合。所述的組氨酸序列(I)由Lys側鏈修飾為4個組氨酸標籤(H6)序列；所述的剛性結構的序列為9個Ρι·ο序列；所述的功能序列(3)使得量子點與多肽連接後具有生物功能，如酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽分子等；所述的帶負電荷的序列(4)使量子點保持穩定，通常為2 4個帶負電的胺基酸組成，如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D與E的任意組合。本發明所述的量子點為含有Zn的量子點，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。採用上述的技術方案後，本發明取得的有益效果是，本發明提供的修飾量子點的新型多肽配體，合成方法簡單，可重複性高，與量子點結合速度快，穩定性高，解決了現有量子點多肽配體穩定性不足而導致其在生物體內的不穩定，進一步拓展了量子點一多肽複合物作為納米螢光探針在生物中的應用。


下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。
圖I是修飾QDs的新型多肽配體(H24)的結構示意圖；圖中I是結合QDs的組氨酸序列、2是提供多肽剛性結構的序列、3是功能序列、4是帶負電荷的序列。圖2是用螢光分光光度計檢測H24-Cy5與QDs結合的速率圖，檢測波長612nm(量子點螢光發射波長為612nm)。其中a是對照實驗H6_Cy5與QDs混合後檢測QDs螢光強度變化，b是H24-Cy5與QDs混合後檢測QDs螢光強度變化。([QD] = [p^)tide]=16nM)圖3是用毛細管電泳檢測H24_Cy5與QDs結合的穩定性。電泳條件25mM硼酸緩衝液(pH 9. 3)，電壓為 18kV。H24-Cy5:QD=20:l, [QD] = O. 5 μ Μ。其中 a 是對照試驗，沒有加取代分子。b是H24-Cy5與QDs混合後加入取代小分子(40倍的GP9G2H6和40倍的H6-GFP)。檢測波長，實線為612nm檢測QDs，虛線為661nm檢測Cy5。
具體實施例方式實施例本發明將就以下實施例作進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施的限制。實施例I本發明所述的方法採用常規的固相Fmoc法，即固相樹脂上被Fmoc保護的單體胺基酸去保護後露出氨基，通過縮合反應與溶液中胺基酸的羧基形成肽鍵，從而將胺基酸連接到樹脂上，使肽鏈從C端向N端延伸。I、基本材料(I)樹脂與連接分子固相Fmoc法選擇的樹脂為RinkAinide-ChemMatrixR W
月旨。這種樹脂具有非常好的溶脹性，可以使肽鏈之間更好地進行縮合反應，且有足夠的網絡空間滿足不斷增長的肽鏈。採用HBTU和HOBt作為連接分子，將多肽分子固定到樹脂上。(2)單體合成所用單體為經化學修飾的α -胺基酸。2、反應步驟第一步，將第一個胺基酸共價連接到樹脂上加入適當的縮合劑如HBTU和HOBt，使被保護胺基酸羧基端與樹脂形成共脂以完成胺基酸的固定；第二步，去保護
採用鹼性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。第三步，激活和交聯採用活化劑HBTU和HOBt活化下一個氨基上的羧基，與樹脂上的氨基交聯，形成用鍵。第四步，重複第二步和第三步，反覆循環添加單體胺基酸，直到合成完成。3、合成後處理( 1)洗脫和脫保護用脫保護劑三氟乙酸(TFA)將肽鏈從樹枝上洗脫下來，並脫聞
保護基。(2 ) HPLC分析純化，凍幹保存。通過上述方法，合成多肽序列H24_G2P9GLVPRGSK (Cy5) DDD (H24_Cy5)，如下
權利要求
1.一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於該多肽配體包括用於結合量子點的組氨酸序列(I)、提供多肽剛性結構的序列(2)、功能序列(3)和帶負電荷的序列(4)，各序列之間以肽鍵相結合。
2.根據權利要求I所述的一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於所述的組氨酸序列(I)由賴氨酸側鏈修飾為4個組氨酸標籤H6序列。
3.根據權利要求I所述的一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於所述的提供多肽剛性結構的序列(2)為9個脯氨酸序列。
4.根據權利要求I所述的一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於所述的功能序列(3)為酶切序列LVPRGS或者具有靶向性的多肽序列。
5.根據權利要求I所述的一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於所述的帶負電荷的序列(4)為2 4個帶負電的胺基酸組成，如DD、DDD、DDDD、EE、EEE、EEEE或D與E的任意組合。
6.根據權利要求I所述的一種修飾量子點的新型多肽配體，其特徵在於所述的量子點為含有 Zn 的量子點，如 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
全文摘要
本發明公開了一種修飾量子點的新型多肽配體(H24)，屬於納米生物技術領域。本發明中的新型多肽配體包括用於結合量子點的組氨酸序列(1)、提供多肽剛性結構的序列(2)、功能序列(3)和帶負電荷的序列(4)，各序列之間以肽鍵相結合。該配體合成方法簡單，其N端通過4個組氨酸標籤序列與量子點結合，大大提高了配體與量子點的結合速率及穩定性，可以作為納米螢光探針廣泛應用於生物標記。
文檔編號C09K11/06GK102911259SQ20121035536
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者王建浩, 邱琳, 蔣鵬舉, 王車禮, 夏江 申請人:常州大學