共軛聚合物和含酯鍵的共軛聚合物及其製備方法和應用與流程

2023-04-24 05:48:41

本發明涉及蛋白組裝領域，具體涉及一種共軛聚合物，一種共軛聚合物的製備方法，一種含酯鍵的共軛聚合物，一種含酯鍵的共軛聚合物的製備方法，一種抑制和/或破壞蛋白質組裝的方法以及一種抑制蛋白寡聚體形成的方法。

背景技術：

蛋白質間的相互作用是各項生物功能的基礎。然而一旦蛋白質發生錯誤的摺疊和組裝，不僅會導致其失去正常的生物活性，還會引起多種棘手的疾病。組織中澱粉樣多肽和蛋白的形成在大概四十種神經退行性疾病和系統性疾病中扮演重要角色，例如阿爾茲海默症、帕金森症、亨廷頓氏舞蹈症、ⅱ型糖尿病等，對人類的健康造成了嚴重的威脅。

過去針對調控澱粉樣蛋白組裝的研究主要集中在通過天然產物小分子、主客體、分子鑷子、人工分子伴侶等親疏水作用來實現。然而這種相互作用力較弱，而且易受環境因素的影響。研究出更加有效的方法來抑制和破壞澱粉樣蛋白的組裝仍然是一個挑戰。

技術實現要素：

本發明的目的是為了克服現有技術存在的調控澱粉樣蛋白組裝的效果不穩定的缺陷，提供了一種含酯鍵的共軛組合物及其製備方法和應用，採用本發明的含酯鍵的共軛聚合物，能夠抑制蛋白質的組裝和寡聚，還可以破壞已經形成的蛋白質組裝體。

具體地，第一方面，本發明提供了一種共軛聚合物，該共軛聚合物的結構如式(i)所示：

其中，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c5的烷基且r1、r2、r3和r4中至少一個為h；n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數，n為10-14的整數。

第二方面，本發明還提供了一種共軛聚合物的製備方法，所述製備方法包括：在催化劑和鹼性物質存在的條件下，將結構如式(ii)所示的化合物與結構如式(iii)所示的化合物接觸，

其中，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c5的烷基且r1、r2、r3和r4中至少一個為h；x1和x2為滷素，n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數。

第三方面，本發明提供了一種含酯鍵的共軛聚合物，所述含酯鍵的共軛聚合物的結構如式(iv)所示，

其中，r5、r6和r7各自獨立地為h、c1-c5的烷基或n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數，n為6-16的整數。

第四方面，本發明還提供了一種含酯鍵的共軛聚合物的製備方法，該製備方法包括：在鹼性物質存在下，將結構如式(i)所示的共軛聚合物與4-硝基苯基氯甲酸酯接觸。

第五方面，本發明還提供了一種抑制和/或破壞蛋白質組裝的方法，該方法包括：將結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物與樣品進行接觸，所述樣品為含有蛋白質組裝體的樣品和/或能夠形成而未形成蛋白質組裝體的樣品。

第六方面，本發明還提供了一種抑制蛋白寡聚體形成的方法，該方法包括：將結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物與能夠形成蛋白寡聚體而未形成的蛋白質單體進行接觸。

本發明提供的含酯鍵的共軛聚合物能夠蛋白質發生共價相互作用，利用化學發應使聚合物和蛋白質共價結合以產生高效的抑制效果，上述方法不僅可以抑制蛋白質的組裝，還可以破壞已經形成的組裝體。進一步的，本發明還可以抑制具有更高毒性的蛋白質寡聚體的形成，明顯的降低由蛋白質組裝引起的細胞毒性，為解決澱粉樣沉積相關的疾病提供了重要思路。

附圖說明

圖1為實施例3中不同濃度aβ42與ppv-np作用的螢光光譜圖；

圖2為實施例3中不同反應時間aβ42與ppv-np作用的螢光光譜圖；

圖3為實施例3中klvff和ppv-np反應後的核磁圖；

圖4為實施例4中蛋白和ppv-np或ppv-oh在相互作用前後的圓二色光譜圖；

圖5為實施例4中aβ42組裝後的形貌圖；

圖6為實施例5中aβ42組裝體和ppv-np作用後的圓二色譜圖；

圖7為實施例6中aβ42寡聚體的斑點印跡圖；

圖8為實施例7中經不同處理的pc12細胞存活率圖；

圖9為實施例8中ppv-np對amylin和calcitonin組裝的抑制圖。

具體實施方式

在本文中所披露的範圍的端點和任何值都不限於該精確的範圍或值，這些範圍或值應當理解為包含接近這些範圍或值的值。對於數值範圍來說，各個範圍的端點值之間、各個範圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值範圍，這些數值範圍應被視為在本文中具體公開。

本發明提供了一種共軛聚合物，該共軛聚合物的結構如式(i)所示：

其中，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c5的烷基且r1、r2、r3和r4中至少一個為h；n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數，n為6-16的整數。

優選地，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c3的烷基，n1、n2、n3和n4各自獨立地為4-10的整數，更優選為4-8的整數；n為10-14的整數。

優選地，r1和r2均為h，r3和r4均為甲基，n1和n2為8，n3和n4為4，所述共軛聚合物的結構如下所示：

本發明還提供了一種共軛聚合物的製備方法，該製備方法包括：在催化劑和鹼性物質存在的條件下，將結構如式(ii)所示的化合物與結構如式(iii)所示的化合物接觸，

其中，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c5的烷基且r1、r2、r3和r4中至少一個為h；x1和x2為滷素，n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數。

優選地，r1、r2、r3和r4各自獨立地為h或c1-c3的烷基，x1和x2為i，n1、n2、n3和n4各自獨立地為4-10的整數，更優選為4-8的整數。

優選地，r1和r2均為h，r3和r4均為甲基，n1和n2為8，n3和n4為4。

在本發明中，所述結構如式(ii)所示的化合物、結構如式(iii)所示的化合物、催化劑和鹼性物質的用量比例可以在較大範圍內變動。例如，結構如式(ii)所示的化合物、結構如式(iii)所示的化合物、催化劑和鹼性物質的摩爾比可以為1:(0.8-1.2)：(0.08-0.12)：(2-3)，優選為1:(0.9-1.1)：(0.09-0.11)(2.2-2.8)。

在本發明中，所述結構如式(ii)所示的化合物和結構如式(iii)所示的化合物可以通過商購獲得，或者通過本領域常規的化學合成的方法獲得。例如，以r1和r2均為h、x1和x2均為i、n1和n2為8為例，結構如式(ii)所述的化合物的製備方法可以包括：在惰性氣氛(零族氣體或氮氣)下，將2,5-二碘-1,4-苯二酚與23-羥基-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷4-甲基苯磺酸酯進行接觸，接觸的條件可以包括：溫度為50-70℃，時間為25-40h。當r1和r2、x1和x2、n1和n2為本發明範圍內的其他種類或數值時，可以參照上述方法進行變化，具體變化的方式為本領域技術人員所熟知。同理，以r3和r4均為甲基、n3和n4為4為例說明結構如式(iii)所示的化合物的製備方法：在惰性氣氛(零族氣體或氮氣)下，將13,13'-((2,5-二碘-1,4-亞苯基)雙氧基)雙(2,5,8,11-四氧雜十三烷)與三丁基乙烯基錫以及pd(pph3)4進行接觸；上述接觸的條件可以包括：溫度為90-120℃，時間為12-20h。

本領域技術人員應該理解的是，本發明所述的所有製備方法還可以包括對所得產物進行提純的步驟，對於提純的方法沒有特別的要求，可以採用本領域技術人員常規使用的各種提純方法，例如，可以採用萃取劑萃取，乾燥劑乾燥，並通過柱層析等方法除雜。

在本發明中，所述催化劑包括主催化劑和催化劑配體，所述主催化劑可以為醋酸鈀和/或pd(pph3)4，所述催化劑配體可以為三(鄰甲基苯基)磷；所述鹼性物質為三正丁胺和/或三乙胺。

在本發明中，所述結構如式(ii)所示的化合物與結構如式(iii)所示的化合物接觸的條件沒有特別的限定，例如，所述接觸條件可以包括：溫度為85-120℃，優選為90-110℃，時間為40-60h，優選為45-55h。

本發明還提供了一種含酯鍵的共軛聚合物，所述含酯鍵的共軛聚合物的結構如式(iv)所示，

其中，r5、r6和r7各自獨立地為h、c1-c5的烷基或n1、n2、n3和n4各自獨立地為3-12的整數，n為6-16的整數。

優選地，r5、r6和r7各自獨立地為h或c1-c3的烷基，n1、n2、n3和n4各自獨立地為4-10的整數，更優選為4-8的整數；n為10-14的整數；

優選地，r5為h，r6和r7均為甲基，n1和n2為8，n3和n4為4。

本發明還提供了一種含酯鍵的共軛聚合物的製備方法，，該製備方法包括：在鹼性物質存在下，將結構如式(i)所示的共軛聚合物與4-硝基苯基氯甲酸酯接觸。結構如式(i)所示的共軛聚合物可以按照前述方法製得，因此，含酯鍵的共軛聚合物的製備方法還可以包括按照上述方法製備結構如式(i)所示的化合物的步驟。

在本發明中，結構如式(i)所示的共軛聚合物、4-硝基苯基氯甲酸酯和鹼性物質的用量比例可以在較大範圍內變動，例如，結構如式(i)所示的化合物、4-硝基苯基氯甲酸酯和鹼性物質的摩爾比可以為1：(3-8)：(2-7)，優選為1：(4-7)：(3-6)。

在本發明中，所述結構如式(i)所示的共軛聚合物與4-硝基苯基氯甲酸酯接觸的條件沒有特別的限定，例如，所述接觸的條件可以包括：溫度為-10至40℃，優選為-5至35℃；時間為20-40h，優選為20-30h。

在本發明中，所述鹼性物質可以為三正丁胺和/或三乙胺，優選為三乙胺。可以與製備結構如式(i)所示的化合物的方法中使用的鹼性物質相同或不同。

本發明還提供了一種抑制和/或破壞蛋白質組裝的方法，該方法包括：將結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物與樣品進行接觸，所述樣品為含有蛋白質組裝體的樣品和/或能夠形成而未形成蛋白質組裝體的樣品。結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物在上文中已有描述，在此不再贅述。

術語「蛋白質組裝體」指的是蛋白質聚集形成的寡聚物或纖維，術語「蛋白質單體」指的是單分散形式存在的蛋白。蛋白質單體組裝形成蛋白質組裝體的條件可以根據蛋白的種類進行確定，例如β-澱粉樣蛋白(aβ)、胰島澱粉樣多肽(amylin)以及降鈣素(calcitonin)在37℃組裝，胰島素在65℃組裝。

根據本發明，所述樣品為能夠形成而未形成蛋白質組裝體的樣品時，所述接觸的條件包括：溫度為37±0.5℃，時間為10min以上，優選為5-30h。根據本發明的這種實施方式，所述能夠形成蛋白質組裝體的蛋白質單體可以為本領域各種能夠形成蛋白質組裝體的蛋白質單體，例如可以為β-澱粉樣蛋白(aβ)、胰島澱粉樣多肽(amylin)、降鈣素(calcitonin)、胰島素、tau蛋白和α-突觸核蛋白中的一種或多種。優選地，樣品中的蛋白質單體與結構如式(i)所示的共軛聚合物的摩爾比可以為1:0.01-20，優選為1:0.1-10。

在本發明中，所述樣品為含有蛋白質組裝體的樣品時，所述接觸的條件可以包括：溫度為37±0.5℃，時間為10min以上，優選為1-10h。根據本發明的這種實施方式，所述能夠形成蛋白質組裝體的蛋白質單體可以為本領域各種能夠形成蛋白質組裝體的蛋白質單體，例如可以為β-澱粉樣蛋白(aβ)、胰島澱粉樣多肽(amylin)、降鈣素(calcitonin)、胰島素、tau蛋白和α-突觸核蛋白中的一種或多種。上述蛋白可以商購獲得。所述蛋白質單體形成蛋白質組裝體的條件可以根據蛋白的種類進行確定。

優選地，樣品中的以蛋白質單體計的蛋白質組裝體與含酯鍵的共軛聚合物的摩爾比為1:0.01-20，優選為1:0.1-10。所述以蛋白質單體計的蛋白質組裝體指的是按照蛋白質單體的投料量計算蛋白質組裝體的量。

由於本發明的含酯鍵的共軛聚合物能夠抑制和/或破壞蛋白的組裝，故能夠降低蛋白組裝體對細胞的毒性。

本發明還提供了一種抑制蛋白寡聚體形成的方法，該方法包括：將結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物與能夠形成而未形成蛋白寡聚體的蛋白質單體進行接觸。

術語「蛋白質寡聚體」指的是以低聚體為主，一種低相對分子質量的蛋白聚集體。所述蛋白質寡聚體的形成條件可以根據蛋白質的種類進行確定。

在本發明中，結構如式(iv)所示的含酯鍵的共軛聚合物與能夠形成蛋白寡聚體而未形成的蛋白質單體進行接觸的條件包括：溫度可以為20-30℃，優選為22-28℃；時間可以為8-20h，優選為10-15h。

根據本發明，所述能夠形成蛋白質寡聚體的蛋白質單體可以為本領域各種能夠形成蛋白質寡聚體的蛋白質單體，例如可以為β-澱粉樣蛋白(aβ)、胰島澱粉樣多肽(amylin)、降鈣素(calcitonin)、胰島素、tau蛋白和α-突觸核蛋白中的一種或多種。上述蛋白可以商購獲得。

根據一種具體的實施方式，商購獲得的蛋白可以使用六氟異丙醇進行預處理使蛋白質以單體的形式的存在，β-澱粉樣蛋白(aβ)、胰島澱粉樣多肽(amylin)、降鈣素(calcitonin)均可以使用六氟異丙醇預處理的方式，其他蛋白可以根據蛋白的具體種類和性質使其保持單體的存在形式，可以為本領域的常規選擇。

在本發明中，樣品中的以蛋白質單體計的蛋白質寡聚體與含酯鍵的共軛聚合物的摩爾比可以為1:0.01-20，優選為1:0.1-10。所述以蛋白質單體計的蛋白質寡聚體指的是按照蛋白質單體的投料量計算蛋白質寡聚體的量。

蛋白質組裝體和蛋白寡聚體會引起細胞毒性，因此，通過抑制和/或破壞蛋白質組裝、抑制蛋白寡聚體形成可有效避免神經細胞損傷，提高細胞存活率。

以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。

以下實施例中，aβ42購自lifetechnologies公司，貨號為74335783a；amylin和calcitonin購自蘇州強耀公司；寡聚物多克隆抗體a11購自lifetechnologies公司，貨號為qd215255；aβ單克隆抗體6e10購自covance公司，貨號為803001；二抗hrp購自中杉金橋公司，貨號為zb-2301；催化劑pd(pph3)4購自sigma-aldrich公司，貨號為216666；催化劑配體p(o-tol)3購自sigma-aldrich公司，貨號為287822；其餘試劑均為常規市售產品，為分析純或色譜純；pc12細胞(atcccrl-1721)；

螢光檢測在hitachif-4500儀器上進行；圓二色光譜檢測在hitachijasco-j815儀器上進行；透射電鏡(tem)購自hitachis-7700；

室溫為25℃。

實施例1

本實施例用於說明結構如式(i)所示的共軛聚合物的製備方法

(1)單體的製備

r1和r2均為h，r3和r4均為甲基，n1和n2為8，n3和n4為4，式(ii)

所示單體的為單體3，式(iii)所示的單體為單體5：

單體3的製備：在10ml丙酮中加入k2co3(0.23g，1.68mmol)，通入n230min以除去溶劑中的o2。在n2保護下加入化合物2,5-二碘-1,4-苯二酚(0.20g，0.56mmol)和23-羥基-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三烷4-甲基苯磺酸酯(0.59g，1.12mmol)，將反應溫度升至60℃，在n2氣氛下反應30h。冷卻至室溫後，過濾洗滌沉澱。收集丙酮溶液用無水na2so4乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑。粗產物用矽膠柱層析分離純化，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯/甲醇(1/1/1，v/v)，得淡黃色液體(0.13g，22％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,δ):7.37(s,1h),4.55(t,j＝4.0hz,1h),4.09(t,j＝6.0hz,2h),3.74(t,j＝4.0hz,2h),3.62(m,2h),3.50(m,24h),3.42(m,2h).13cnmr(400mhz,cdcl3,δ):153.01,123.36,87.35,72.79,70.61,70.32,70.23,70.17,69.41,60.66.hr-ms(maldi,[m+k]):calcd.forc38h68i2ko18:1105.2127；found:1105.2132.

單體5的製備：將13,13'-((2,5-二碘-1,4-亞苯基)雙氧基)雙(2,5,8,11-四氧雜十三烷)(0.50g，0.67mmol)溶解在12ml甲苯中，通入n230min以除去溶劑中的o2，在n2保護下向該溶液中加入三丁基乙烯基錫(1.27g，4mmol)和乙醇洗滌過的pd(pph3)4(16mg)，升溫至100℃c反應16h。停止加熱待反應液冷卻至室溫後，用40ml濃度為2m的kf水溶液除去未反應的三丁基乙烯基錫。收集有機相，用無水na2so4乾燥，過濾，旋蒸除去溶劑。粗產物用矽膠柱層析分離純化，洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯/甲醇(1/1/1，v/v)，得無色油狀液體(0.21g，59％)。1hnmr(300mhz,cdcl3,δ):7.07-6.98(m,4h),5.74(dd,j＝16.5,1.2hz,2h),5.26(dd,j＝9.9,1.2hz,2h),4.13(t,j＝4.8hz,4h),3.85(t,j＝5.4hz,4h),3.75-3.63(m,20h),3.53(m,4h),3.37(s,6h).13cnmr(400mhz,cdcl3,δ):151.00,131.68,127.91,114.61,111.54,72.24,71.16,70.98,70.95,70.93,70.82,70.18,69.40,59.30.hr-ms(maldi,[m+k]):calcd.forc28h46ko10:581.2723.；found:581.2728.

(2)共軛聚合物ppv-oh(結構如下所示)的製備

在n2保護下將單體3(0.21g，0.20mmol)、單體5(0.11g，0.20mmol)，催化劑醋酸鈀(10mg，0.013mmol)，催化劑配體p(o-tol)3(20mg，0.066mmol)和三正丁胺(119μl，0.50mmol)溶解在5ml的dmf中，通n230min以除去溶劑中氧氣，反應液升溫至100℃，在氮氣保護下反應48h。停止加熱待反應液冷卻至室溫後，用甲醇透析2天，期間更換甲醇10次，透析袋截留分子量為7500，最後將甲醇旋蒸除去，得到深紅色油狀液體(0.18g，56％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,δ):7.52(br,2h),7.25(br,2h),4.53(br,1h),4.21-3.39(br,48h),3.19(s,3h)。gpc:mw＝29020,pdi＝1.15。

實施例2

本實施例用於說明含酯鍵的共軛聚合物ppv-np的製備

(50％的酯鍵取代)

將ppv-oh(15mg，0.01mmol)溶於2ml超幹二氯甲烷中，加入三乙胺(5.06mg，0.05mmol)，在0℃攪拌下滴加4-硝基苯基氯甲酸酯(12.09mg，0.06mmol)的二氯甲烷溶液。在0℃下繼續反應1h後移至室溫繼續反應24h。加入10ml二氯甲烷稀釋，用飽和食鹽水洗三次，用無水na2so4乾燥後，濃縮，在乙醚中沉降，得到深紅色油狀液體(12.3mg，74％)。1hnmr(400mhz,dmso-d6,δ):8.30(br,1h),7.54(br,3h),7.25(br,2h),4.34-4.05(br,5h),3.86(br,4h),3.67-3.36(br,38h),3.18(s,3h)。由核磁數據分析4-硝基苯基甲酸酯的取代度約為50％。

實施例3

本實施例用於說明含酯鍵的共軛聚合物ppv-np和蛋白的相互作用

(1)蛋白的準備

將凍幹的aβ42、amylin、calcitonin溶解在六氟異丙醇中，配成1mg/ml。超聲10min後在4℃震蕩2h以進一步溶解。隨後，將溶液分裝在離心管中，氮吹除去溶劑，真空乾燥2h。於-20℃儲存。

(2)通過監測ppv-np和aβ42作用後的螢光變化來研究它們之間的相互作用。

在濃度分別為0、5、10、20、30、40、60、80μm的aβ42溶液中加入ppv-np，使ppv-np的終濃度為10μm，37℃攪拌反應30min，用螢光光譜儀表徵不同濃度蛋白下ppv-np的螢光變化。在37℃下將終濃度為80μm的aβ42和10μm的ppv-np混合，監測不同作用時間後ppv-np的螢光變化。結果分別如圖1和圖2所示。

圖1為不同濃度aβ42與ppv-np作用的螢光光譜圖。從圖1中可以看出，隨著aβ42濃度的增加，ppv-np的螢光逐漸增強。

圖2為不同反應時間aβ42與ppv-np作用的螢光光譜圖。從圖2中可以看出，隨著反應時間的延長，ppv-np的螢光逐漸增強。

(3)通過核磁譜圖變化研究ppv-np和aβ42的相互作用。

將klvffae(aβ42的核心序列，作為模型來研究核磁，2.0mm)和ppv-np(4.0mm)在室溫下攪拌反應過夜，溶劑為dmso-d6。

圖3為klvffae和ppv-np反應後的核磁圖。從圖3中可以看出明顯的醯胺質子化學位移變化，表明klvffae和ppv-np之間存在疏水相互作用。在高場處賴氨酸側鏈ε位亞甲基化學位移的變化表明共價反應的發生。

實施例4

本實施例用於說明本發明提供的抑制蛋白組裝的方法

將六氟異丙醇處理後aβ42溶於10mm的naoh中，4℃離心(14000g，10min)，取上清液稀釋在10mm的pb溶液中，aβ42的終濃度為40μm。為了進一步驗證ppv-np對aβ42組裝的共價抑制作用，選用不含反應性基團的ppv-oh做陰性對照。將aβ42分別與ppv-np、ppv-oh在1:0，1:1，1:2，1:5，1:10摩爾比下37℃攪拌作用30min後，將上述溶液移至透析管透析3h，透析液為10mm的naoh(總體積的10％)與10mm的pb溶液(總體積的90％)。透析後在緩慢的攪拌下繼續37℃培養15h。取200μl樣品用圓二色光譜檢測aβ42組裝後的二級結構變化，光路長為1mm，掃描波長190-260nm，掃描速度為100nm/min，響應時間為4s，每個光譜是重複掃描3次的平均值。用tem進一步表徵ppv-np對aβ42組裝的抑制效果，取5μl培養後樣品，滴到普通碳膜銅網上，作用2min後，用超純水洗兩次，用3重量％的醋酸雙氧鈾染色1min後，用濾紙吸走染色液。晾乾後，用tem觀察。

圖4為相互作用前後的圓二色光譜圖。從圖4中可以看出單獨的aβ42培養後在216nm處有負峰，說明aβ42是以β摺疊的形式存在的，而隨著加入ppv-np量的不斷增加，在216nm處的負峰逐漸變弱至消失，在198nm處出現新的負峰，表明aβ42以無規捲曲的構象存在，即ppv-np抑制了aβ42的組裝。加入了ppv-oh的陰性對照組在培養後在216nm左右有負峰，和單獨培養aβ42相似，說明不含反應性基團的ppv-oh不能抑制aβ42的組裝。

圖5為aβ42組裝後的形貌。從圖5中可以看出，單獨的aβ42和加入ppv-oh的樣品組有纖維形成，加入ppv-np的樣品沒有形成纖維組裝體。

實施例5

本實施例用於說明本發明提供的破壞蛋白質組裝的方法

採用與實施例4相同的方法單獨培養aβ42，使其形成aβ42組裝體。aβ42組裝體與10倍摩爾過量的ppv-np在37℃下攪拌反應2h，透析3h除去dmso，用圓二色譜檢測aβ42的構象。對照組為不加ppv-np在相同操作下加等量dmso。

圖6為aβ42組裝體和ppv-np作用後的圓二色譜圖。從圖6中可以看出，加入ppv-np後aβ42恢復為無規捲曲構象，說明ppv-np可以破壞已經形成的組裝體。

實施例6

本實施例用於說明本發明提供的抑制蛋白寡聚體形成的方法

取六氟異丙醇處理後的aβ42，加dmso溶解成2mm，加入10mm的pb溶液稀釋成40μm，然後分別與ppv-np、ppv-oh、dmso作用30min，其中ppv-np、ppv-oh為10倍摩爾過量，dmso的體積和ppv-np體積相同。隨後，將樣品移入透析管，於室溫下透析12h，透析液為10mm的pb溶液，透析後將各個樣品定容為相同的體積。

利用斑點印跡法檢測aβ42寡聚體的形成。在硝酸纖維膜上分別滴2μl樣品，風乾。用含10重量％脫脂牛奶的10mm的tbst(含tween0.01體積％)室溫震蕩1h後，用tbst溶液洗三次，每次5分鐘。將寡聚物多克隆抗體a11以1:500(體積)或aβ單克隆抗體6e10以1:1000(體積)稀釋到含3重量％bsa的tbst中，在搖床上室溫作用一小時，用tbst溶液洗三次，每次5分鐘。然後分別用相應的二抗hrp孵育，利用增強的化學發光法檢測寡聚體的形成。

圖7為aβ42寡聚體的斑點印跡圖。從圖7中可以看出，ppv-np可以抑制aβ42寡聚體的形成。

實施例7

本實施例用於說明ppv-np對aβ42組裝體引起細胞毒性的抑制

pc12細胞在含10體積％牛血清的r1640培養基中置於37℃含5％二氧化碳的恆溫培養箱培養。pc12細胞接種在96孔板內，密度為8×103個/孔，放入37℃培養箱過夜貼壁培養。含有ppv-np和ppv-oh以及單獨的aβ42在37℃培養16h後，用培養基稀釋至濃度為20μm後加入到96孔板中與細胞作用48h。用mtt法對pc12細胞存活分析，去掉96孔板中上清液，加入mtt(100μl/孔)在37℃培養4小時，去掉上清液，加入dmso(100μl/孔)，將96孔板放入酶標儀中測570nm處的吸收。

圖8為經不同處理的pc12細胞存活率圖。由圖8可知單獨的aβ42和加入ppv-oh組對細胞有明顯的毒性，細胞的存活率約為46％。而加入了ppv-np後可以明顯的降低對pc12的細胞毒性，細胞的存活率約為100％。

實施例8

本實施例用於說明ppv-np抑制蛋白amylin或calcitonin組裝的方法

取六氟異丙醇處理後的amylin，加入10mm的naoh(總體積的10％)，用10mm的pb溶液(總體積的90％)稀釋至40μm。分別加入十倍摩爾過量的ppv-np、ppv-oh及與聚合物等體積的dmso。37℃下攪拌反應30min，移至透析管培養4h，透析液組成和緩衝液相同。取樣品進行圓二色譜測定和tem表徵。

取六氟異丙醇處理後的calcitonin，加dmso溶解成3.9mm，用10mm的pb溶液(含100mm的nacl)稀釋至60μm。分別加入十倍摩爾過量的ppv-np、ppv-oh及與聚合物等體積的dmso。37℃下攪拌反應30min，用透析管透析3h後轉移至微量反應管中繼續攪拌培養8h。取樣品進行圓二色譜測定和tem表徵。

圖9為ppv-np對amylin和calcitonin(簡稱ct)組裝的抑制。從圓二色譜圖中可以看出加入ppv-np後，amylin和calcitonin仍然以無規捲曲構象存在，而單獨的amylinn、calcitonin和加入ppv-oh的主要以β摺疊的形式存在。tem也進一步表明ppv-np可以有效抑制amylin和calcitonin組裝。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於此。在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合，這些簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容，均屬於本發明的保護範圍。