樟葉越橘苷的提取及其在健康產品中的應用的製作方法

2023-04-28 11:45:31 3

專利名稱：：樟葉越橘苷的提取及其在健康產品中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及健康產品(食品、保健品及藥物)
技術領域：
，具體地說是樟葉越橘苷(l-O-對羥基苯酚-6-0-咖啡醯基葡萄糖苷，以下簡稱PPCG)的提取及在健康產品(食品、保健品及藥物)中的應用。技術背景隨著人類生產力的迅猛發展，越來越多的人更加關注自身機體的健康保健。從大自然獲取物質基礎滿足這一需求仍是安全和快速的選擇。特別是那些已經為人類經驗驗證的生物資源包含多種活性組分，從中不斷提取、分離、純化並測試它們的生理活性，最終應用於健康產品(食品、保健品及藥物)中，是現代食品工業和製藥工業發展的基礎和主要途徑。杜鵑花科越橘屬(KacwV7i"歷)植物約300種，我國有47種，資源十分豐富。該屬植物有多種生理活性本草綱目中記載烏飯樹(fecd'/7/";7Z^acZ^3^/歷Thunb.)具有"利腸胃，補骨髓，固精駐顏，輕身明目"的功效；國外對歐洲越橘(K歷jTti^^L.)的研究發現其花色苷對眼科疾病和心血管疾病具有顯著療效；美國藥典記載，蔓越橘(F.a^co""sL.)是對付膀胱炎、尿道感染有效的輔助品；日本則從歐洲和我國東北林區進口越橘屬(fecc/m'"歷)植物的凍乾粉用於生產保健食品。國內外均有大量關於該屬植物活性成分研究的報導。我們研究發現樟葉越橘苷(PPCG)廣泛存在於橘屬(fecw77^/7)植物中，特別是在雲南產樟葉越橘(K3CWV7^7/B^/7S"'3/7"忍)中含量異常高，且其具有多種生理活性，在健康產品中的應用開發前景巨大。
發明內容本發明的目的是從雲南產樟葉越橘中提取樟葉越橘苷(PPCG)，以及其在健康產品(食品、保健品及藥物)中的應用。本發明的越橘苷的提取方法是取雲南產樟葉越橘(Facdw'ww^"a/Zam/w)，粉碎，加水68倍，煎煮23小時，過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附，先用水洗脫，除去寡糖類成分，再用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇，放置，結晶，過濾，結晶再用50°/。乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，5(TC以下乾燥，得樟葉越橘苷(PPCG);或煎煮液過濾後用乙酸乙酯或丁醇萃取，萃取液濃縮，殘留物加75%乙醇溶解，放置，結晶，過濾，結晶再用50%乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，5(TC以下乾燥，得樟葉越橘苷。越橘苷的應用取樟葉越橘苷加入食品或藥品中允許加入的助劑，製成飲料、口服液、片劑、膠囊等現有食品和藥品產品形式。取所製成的產品每日口服3次，每次服用相當於樟葉越橘苷25500mg。可用於高血脂、高膽固醇及血栓性心腦血管疾病治療；也可用於各種腫瘤疾病的輔助治療及緩解和減輕腫瘤疾病因放化療引起的副作用；也可用於細菌、病毒引起的身體發熱及炎症治療。樟葉越橘苷功能活性試驗如下一、對血液流變學的影響1、試驗材料1.1、供試樣品樟葉越橘苷樣品(WF-1)為米黃色粉劑，樣品批號050922。水溶性差，體外試驗用麗SO助溶，口服樣品用0.5%羧甲基纖維素助懸，飲用水稀釋至一定容積，小鼠按0.2ml/10g體重ig，大鼠按lml/100g體重ig。1.2、其他藥品試劑血脂康膠囊由北京北大維信生物科技有限公司生產，批號20050626，阿司匹林由山東新華製藥公司提供，二磷酸腺苷(adenosinediphosphate,ADP)、血小板活化因子(plateletactivatingfacter，PAF)及花生四烯酸(arachidonicacid，AA)系sigma公司產品，血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)測定試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司。燈盞花素片為雲南植物藥業有限公司產品，批號20040402。1.3、主要儀器設備LBY-NJ2型血液凝聚儀由北京普制生精密儀器研究中心生產，日本島津公司生產CL-770型臨床分光光度儀，北京賽科希德SA-6000型錐板粘度計等。1.4、實驗動物SD大鼠、ICR小鼠為SPF級，家兔為普通級，實驗動物生產許可證號SCXK(滇)2005-0008，由昆明醫學院實驗動物中心提供。2、方法與結2.1、統計學方法實驗結果用X土S表示，組間差異用t檢驗，P〈0.05表示組間差異有顯著性。2.2、對血小板聚集功能的影響2.2.1、富血小板血槳(platelet-richplasma,PRP)和貧血小板血漿(platelet-poorplasma,PPP)的製備。自清醒家兔頸動脈取血收集於塑料離心管中，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積之比為9:1)，lOOOrpm離心lOmin得PRP，吸出PRP後剩餘血液再以3000rpm離心lOmin得PPP，PPP用於調零或調整PRP中血小板的數目，試驗中血小板數控制在5X107L。2.2.2、血小板聚集性測定按Born's比濁法測定樣品不同濃度對ADP，PAF和AA誘導的血小板聚集的影響，即將樣品與PRP共同溫育10min，再加入不同誘導劑(終濃度分別為ADP3Mmol/L，PAF7.2nmol/L，AA0.35mraol/L)，測定5min內血小板最大聚集率(％)。結果見表l。_表1WF-l體外對ADP、PAF或AA誘導血小板聚集功能的影響#"3效度^&V、叛覆虞率J名豫6wg/"ADPPAFAA層幼0.5%66.6±2.767.9±4.172.5±3.51044.5±4.9a59.3±3.6a71.4±6.82040.1±4.5a56.1土2.4367.2±6.34037.6±4.1a51.1±4.7a65.4±6.58036.4±4.2a49.7±5.6a62.4±6.1b"=5x±S-5溶媒對照(0.5。/。DMSO)比ap<0.01bp<0.05結果表明，WF-l顯著抑制ADP誘導的血小板聚集作用，該作用呈一定的濃度相關性;此外，WF-l還有顯著抗PAF作用；對AA誘導的血小板聚集，WF-l只在較高濃度有抑制作用(80mg/L)。2.2.3對小鼠斷頭後張口喘氣時間的影響選用ICR小鼠50隻，雌雄各半，體重1822g,按體重隨機分為5組，即空白對照組，陽性對照組(燈盞花素片100mg、kg-、cf1)及SC-1低、中、高劑量組和WF-l低、中、高劑量組(分別按50、100、200mg、kg—t、d—'給藥)，樣品用飲用水稀釋至一定容積，按0.2ml/10g體重ig，每天一次，空白對照組ig等體積飲用水。連續給藥(或水)6天。末次給藥後lh進行斷頭張口喘息時間測定。結果顯示，除燈盞花素片組(100mg/kg)有顯著延長小鼠斷頭後張口喘氣時間外，其他各組喘氣時間與空白對照組比均無顯著差異。WF-1高劑量組張口喘氣時間雖較空白對照組略有延長，但無顯著性差異(P〉0.05)(表2)。表2WF-1對小鼠斷頭張口喘氣時間的影響tableseeoriginaldocumentpage62.2.4對出血時間的影響選用ICR小鼠50隻，雌雄各半，體重1822g，按體重隨機分成5組，分組及給藥量同前，陽性對照改用阿司匹林(30mg/kg)，連續給藥5天，末次給藥後lh用斷尾法進行出血時間測定[3]，將小鼠尾尖8面處剪斷，從出血開始(濾紙上出現血跡)計時，每半分鐘用濾紙吸去血滴一次，直到出血自然停止(濾紙上無血跡)，所計時間即為出血時間。結果顯示，WF-1100—200g.kg—'.d—'有顯著延長小鼠出血時間作用，與ASP作用一致，該作用呈一定的劑量相關性，見表3_表3WF-1對小鼠尾尖出血時間的影響_tableseeoriginaldocumentpage6n=10;±S與空白對照組比》<0.01，bp<0.052.2.5對凝血時間的影響一毛細玻璃管法選用ICR小鼠50隻，雌雄各半，體重2024g，按體重隨機分為5組，分組及給藥量與觀察對出血時間影響相同。按分組連續給藥5天，末次給藥後lh用毛細玻管法進行凝血時間測定。取內徑lmm、長10cm毛細玻管自小鼠一側眼球內眥插入球後靜脈叢，深的45mm，至血液流入毛細玻管內開始計時，血液注滿後將毛細玻管取出平放於桌上，每隔30秒折斷二端毛細管約0.5cm，至血凝絲出現為止，所歷時間即為凝血時間。表4WF-1對小鼠凝血時間的影響tableseeoriginaldocumentpage7r10;±S與空白對照組比》<0.01，、<0.05結果表明,WF-1有延長小鼠凝血時間作用。2.2.6對ADP誘發小鼠肺微循環血栓形成的影響ICR小鼠50隻，雌雄各半，體重1820g,按體重隨機分為5組，分組及給藥量同前,連續灌胃給藥5天，末次給藥後lh按文獻方法於小鼠尾靜脈iv400mg/kg的ADP生理鹽水溶液(0.lml/10g體重)，注畢，觀察並記錄15min內動物死亡數，計算死亡抑制率。動物總叛死亡數死亡抑制率(％)=-一盛m仏~動物總數結果表明100和200mg/kg體重WF-1有顯著降低靜脈注射ADP所導致的肺微血管栓塞動物死亡數，該作用呈劑量依賴趨勢(表5)表5WF-1對ADP致小鼠肺栓塞死亡的保護作用tableseeoriginaldocumentpage7與空白對照組比aP<0.01，bP<0.052.2.7對小鼠實驗性高脂血症血脂水平的影響雄性ICR小鼠50隻，體重1822g，按體重隨機分為5組，全部動物飼以含高脂肪，高膽固醇飼料，自由進食，飲水不限。高脂飼料配方為(W:W):膽固醇2%，蛋黃10%，豬油7%，丙基硫氧嘧啶0.1%，膽酸鈉0.3%，基礎飼料80.6%，在進食高脂飼料的同時，各給藥組按分組灌胃給予不同劑量的藥物，空白對照組給相同體積飲用水。5天後摘眼球取禁食12h空腹血，用酶法按試劑盒說明書操作程序，測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白一膽固醇(HDL—C)，結果見表6。結果表明，WF-1灌胃給藥有降低實驗性高脂血症小鼠血清TC和TG作用，該作用呈劑量相關性，200mg/kg體重降低TC和TG作用十分顯著，與模型組比P<0.01，隨著TC下降，HDL-C也有一定降低，但HDL-C/TC比值略有升高，說明WF-1對脂蛋白分布無有害影響。表6WF-1對小鼠實驗性高脂血症的影響tableseeoriginaldocumentpage8"=10Jc±saP<0.01與高脂對照組比較2.2.8對血漿粘度的影響雄性SD大鼠40隻，體重200240g，按體重隨機分為4組，分組及給藥量同前，高脂飼料餵養，飼料配方不變，連續給藥7天，禁食12h後由股動脈取血，1%肝素抗凝，分離血漿(3000卬m,10min)，用北京賽科希德SA-6000型錐板粘度計進行血漿粘度測定。結果顯示，WF-1無明顯影響大鼠血漿粘度作用(表7)表7WF-1對大鼠血漿粘度的影響tableseeoriginaldocumentpage8小結初步實驗結果顯示，樣品WF-1體外試驗有較好的抑制ADP、PAF誘導的血小板聚集作用，體內給藥能顯著降低靜脈注射ADP所致的肺微血管栓塞動物死亡數，顯著延長小鼠的出、凝血時間，WF-1在高劑量時(200mg/kg)可降低動物實驗性高脂血症血清TC和TG水平，但無降低血粘度作用。以上結果提示，WF-1具有抗血栓栓塞作用，具有良好的心腦血管疾病藥物開發前景。二、抗菌消炎作用1.材料樟葉越橘提取物、鹽酸環丙沙星、強力銀翹片。昆明種小鼠，體重1822g。Wistar大鼠，體重120200g。菌種有肺炎雙球菌菌液(濃度6XlS個/mL)、金黃色葡萄球菌菌液(濃度1.2Xl(^個/mL)。電腦數字式體溫計，VIS-7220型分光光度計。2方法2.1樟葉越橘提取物體內抗菌試驗2.1.1對肺炎雙球菌感染小鼠的保護作用取小鼠60隻，隨機分為4組，每組15隻。分別igl8X樟葉越橘提取物、9%樟葉越橘提取物、0.8%環丙沙星、生理鹽水，均為0.3mL10g—1體重。各組小鼠每日給藥l次，連續給藥4d(感染後各組動物繼續按上述方法給藥，直至試驗結束)。將引起小鼠卯％死亡的肺炎鏈球菌菌液(濃度3.16X1S個/mL)給小鼠ip0.5mL/只，觀察一周內各組小鼠死亡數。2丄2樟葉越橘提取物對金黃色葡萄球菌感染小鼠的保護作用取小鼠60隻，分組和給藥方法同2丄1。將引起小鼠90%死亡的金黃色葡萄球菌菌液(濃度6.6XlS個/mL)給小鼠ip0.5mL/只，觀察一周內各組小鼠死亡數。2.2樟葉越橘提取物抗炎試驗2.2.1樟葉越橘提取物對蛋清所致大鼠足蹠腫脹的影響取大鼠40隻，體重120—150g，隨機分為4組，每組10隻。分別igl8X樟葉越橘提取物、9%樟葉越橘提取物、4.5%強力銀翹片、生理鹽水，均為lmL，100g"體重。各組每天給藥l次，連續給藥4d。末次給藥前測量各組大鼠左後足蹠容積作為致炎前正常足蹠容積，於給藥後30min於左後足蹠Sc新鮮蛋清0.05mL/只。於注射蛋清後0.5、1、2、4及6h各測足蹠容積1次，記錄各組測量數據。2.2.2樟葉越橘提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響取小鼠40隻，體重18—22g，隨機分為4組，每組10隻。分別igl8X樟葉越橘提取物、9%樟葉越橘提取物、4.5%強力銀翹片、生理鹽水，均為0.2mL.10g"體重。各組每天給藥1次，連續給藥4d。末次給藥後lh在乙醚麻醉下，將二甲苯0.02mL塗在小鼠左耳前後兩面致炎，致炎後30min將小鼠處死，用7mm直徑打孔器在小鼠左右耳相同部位打下耳片，用電子天平稱重。記錄左右耳片重量，計算腫脹率。3.結果3.1體內抗菌試驗結果對照組、樟葉越橘提取物大劑量組、小劑量組、環丙沙星組各15隻小鼠腹腔感染肺炎雙球菌，死亡數分別是14、7、9、4隻。4組各15隻小鼠腹腔感染金黃色葡萄球菌，死亡數分別是13、5、8、l只。結果表明，樟葉越橘提取物大劑量組可使腹腔感染肺炎雙球菌小鼠和腹腔感染金黃色葡萄球菌小鼠的死亡數明顯減少，與對照組比較，差異分別有顯著意義(PO.05)和極顯著意義(PO.01)。3.2抗炎試驗結果大鼠足蹠腫脹試驗結果表明，樟葉越橘提取物對蛋清引起的大鼠足蹠腫脹有明顯抑制作用，大劑量組在致炎後0.5h、lh、2h和4h作用明顯，腫脹率與對照組比較差異有顯著性；小劑量組在致炎後0.5h、lh和2h作用較明顯，腫脹率與對照組比較差異有顯著性。小鼠耳腫脹試驗結果表明，樟葉越橘提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹有一定的抑制作用，大劑量組與對照組比較腫脹率差異有顯著性。4.討論實驗說明樟葉越橘提取物具有一定抗菌、抗炎的作用。三、抗腫瘤作用(細胞毒)取濃度為2XlS個/mt人胃癌細胞BGC-823混懸液，置於96孔微量培養板，每孔5(^1，同時加入等體積的不同濃度樟葉越橘提取物。使終濃度分別為2、4、6和8pg/ml，以空白培養基作為對照。每一實驗濃度設4個平行孔。然後在37'C二氧化碳溫箱中培養4048h，每孔加噻唑藍的PBS溶液20^il(5mg/ml)，37°C作用4h後，吸去上清液，每孔加0.10ml二甲基亞碸，振蕩5min後，在酶標儀上測定各孔A370nm，計算殺傷率，結果見圖l。試驗結果表明，樟葉越橘提取物中確存在對腫瘤細胞直接殺傷的成分。圖1是本發明的樟葉越橘提取物對BGC—823的殺傷作用。具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明作進一步的詳細說明，但不是對本發明的限定。實施例1:取雲南產樟葉越橘(F"accf"/wm甴朋/z'am/w)10公斤，粉碎，加水60公斤，煎煮2小時，過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附(或乙酸乙酯、丁醇萃取)，先用水洗脫，除去寡糖類成分，再用75%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇，放置，結晶，過濾，結晶再用50%乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，5(TC以下乾燥，得420g越橘苷。取該結晶400g粉碎，加入澱粉310g、蔗糖粉100g、乳糖100g、山梨醇50g，混勻，制粒，乾燥，整粒，與40g硬脂酸鎂，混勻，壓片，製成4000片。實施例2:取雲南產樟葉越橘(P^cc/m'wm10公斤，粉碎，加水80公斤，煎煮3小時，過濾，丁醇萃取，萃取液濃縮至幹，加75%乙醇水使完全溶解，放置，結晶，過濾，結晶再用50°/。乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，5(TC以下乾燥，得435g樟葉越橘苷。取該結晶400g粉碎，加入蔗糖粉420g、乳糖100g、山梨醇50g，混勻，制粒，乾燥，整粒，加入30g硬脂酸鎂，混勻，填裝成膠囊8000粒。權利要求1、一種越橘苷的提取方法，其特徵在於按以下進行取樟葉越橘粉碎，加水6～8倍，煎煮2～3小時，過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附先用水洗脫，除去寡糖類成分，再用75％乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇，放置，結晶，過濾，結晶再用50％乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，50℃以下乾燥，得樟葉越橘苷；或煎煮液過濾後用乙酸乙酯或丁醇萃取，萃取液濃縮，殘留物加75％乙醇溶解，放置，結晶，過濾，結晶再用50％乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，50℃以下乾燥，得樟葉越橘苷。2、用權利要求1所述的樟葉越橘苷的提取方法提取的樟葉越橘苷製備的食品或藥品，其特徵在於取樟葉越橘苷，加入食品或藥品中允許加入的助劑，製成飲料、口服液、片劑、膠囊。3、權利要求2所述的越橘苷製備的食品或藥品的應用，其特徵在於可以用於降血脂、膽固醇和抗血栓。4、權利要求2中所述的越橘苷製備的食品或藥品的應用，其特徵在於其可以用於腫瘤疾病的治療。5、權利要求2中所述的越橘苷製備的食品或藥品的應用，其特徵在於其可以用於病原性微生物引起的炎症治療。全文摘要本發明是樟葉越橘苷的提取及其在健康產品中的應用。提取方法取樟葉越橘粉碎，加水6～8倍，煎煮2～3小時，過濾，濾液用大孔吸附樹脂吸附先用水洗脫，除去寡糖類成分，再用75％乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至無乙醇，放置，結晶，過濾，結晶再用50％乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，50℃以下乾燥，得樟葉越橘苷；或煎煮液過濾後用乙酸乙酯或丁醇萃取，萃取液濃縮，殘留物加75％乙醇溶解，放置，結晶，過濾，結晶再用50％乙醇加熱溶解，放置結晶，過濾，50℃以下乾燥，得樟葉越橘苷。將其製成飲料、口服液、片劑、膠囊。可以用於降血脂、膽固醇和抗血栓，腫瘤疾病的治療，病原性微生物引起的炎症治療等。文檔編號A23L1/28GK101297692SQ20081005844公開日2008年11月5日申請日期2008年5月26日優先權日2008年5月26日發明者曹建新申請人:昆明理工大學