一種鳥苷生產菌株的篩選方法與流程
2023-04-28 15:47:06 3
本發明屬於發酵工程技術領域，具體涉及一種產鳥苷(Guanosine)的微生物菌株的選育方法。
背景技術：
鳥嘌呤核苷guanosine，又名鳥苷，其商品名稱為GR，又名9-13-D-呋喃核糖基鳥嘌呤。其用途十分廣泛，是食品和醫藥產品的重要中間體，可用於合成食品增鮮劑5'-鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉和核苷類抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用於製造三磷酸鳥苷鈉等藥物的主要原料。選育鳥苷生產菌時，選育了抗鳥嘌呤或鳥嘌呤結構類似物的突變株，發現喪失GMP還原酶的菌株主要積累鳥苷。日本的渡邊等將鳥苷生物合成途徑中的關鍵酶PRPP轉醯胺酶基因克隆到載體質粒中，然後將該重組質粒導入到枯草芽胞桿菌中，結果鳥苷的產量提高了4倍。三井等採用體外誘變的方法構建出SAMP合成酶缺失株，該工程菌株於34℃發酵70h，其鳥苷產量為19.0g/L。Nogami等人證明GMP還原酶陰性菌的鳥苷產量比陽性菌要高，並發現腺嘌呤或腺苷抑制IMP到GMP途徑中酶的活性，據此以枯草芽胞桿菌NO102為出發菌，得到抗腺嘌呤，腺苷突變株NT1017(8-AGr+Ade-+His-+AARs+GMPred-)，可在發酵液中積累5.4g/L鳥苷。Momose等研究發現8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜黃嘌呤都抑制菌體的生長，而這種抑制可以被鳥苷所解除，據此得到的抗這兩種嘌呤類似物的突變株能夠解除其對GMP合成途徑的抑制，從而提高鳥苷的產量。Komatsu等根據同樣的原理篩選了腺嘌呤缺陷，抗8-氮雜黃嘌呤，GMP還原酶陰性的突變株，並進一步篩選到核苷水解酶部分缺失的GR2176可積累鳥苷10.3g/L。
技術實現要素：
針對上述理論，本發明要解決的技術問題是為工業化大生產提供一種方便快捷的鳥苷生產菌株的有效篩選方法。高產穩定的
為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案是：一種鳥苷生產菌株的篩選方法，步驟為：
I.將待篩選的鳥苷生產菌接入含有培養基①的三角瓶中，振蕩形成培養液；
II.用接種針取步驟I培養液在平板培養基②中梯度劃線分純，培養得出單株；梯度劃線分純即平板劃線分純法，在劃線的過程就是菌液稀釋的過程；
III.將步驟II單株接入含有培養基③的三角瓶中，振蕩形成培養液；
IV.用接種針取步驟III培養液在平板培養基④中梯度劃線分純，得出二次分純單株，所得二次分純單株擴大培養，利用搖瓶發酵篩選出鳥苷生產菌株。
進一步：在上述鳥苷生產菌株的篩選方法中，步驟I中所述的振蕩條件為：35±2℃，轉速200±10rpm，振蕩培養16～24h；培養基①為葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.5±0.1％、蛋白腖0.2±0.05％、氯化鈉0.5±0.05％，餘量是水。
步驟II的培養條件為：33±2℃，培養24-48小時；培養基②為葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.1±0.05％、蛋白腖0.1±0.02％、氯化鈉0.5±0.02％、黃嘌呤0.01±0.005％、8-氮雜鳥嘌呤0.01±0.005％、8-氮雜黃嘌呤0.01±0.005％、瓊脂1.8±0.2％，餘量是水。
步驟III中所述的振蕩條件為：35±2℃，轉速200±10rpm，振蕩培養16～24h。培養基③為葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.1±0.02％、蛋白腖0.1±0.02％、氯化鈉0.5±0.01％、黃嘌呤0.01±0.002％、8-氮雜鳥嘌呤0.02±0.002％、8-氮雜黃嘌呤0.02±0.001％，餘量是水。
步驟IV的培養條件為：33±2℃，培養24-48小時，培養基④為葡萄糖1.0±0.2％、酵母膏0.5±0.02％、蛋白腖0.1±0.02％、氯化鈉0.5±0.02％、腺苷0.5±0.01％、瓊脂1.8±0.2％，餘量是水。
所述步驟IV中二次分純單株擴大培養是指將二次分純單株轉接到試管斜面中擴大培養的過程。
再進一步：為進一步選出更優良的鳥苷生產菌株，本發明還提供了由上述方法所得鳥苷生產菌株的搖瓶篩種步驟，即將上述鳥苷生產菌株在搖瓶培養，30～40℃，搖床振蕩培養24～48h，發酵液離心得上清液，利用紙層析分離雜質，在260nm處測紫外吸收值(A260)，從而得出最優良的幾株鳥苷生產菌，所述紙層析的層析液重量比為，異丙醇:氨水:水等於7:2:1。
與現有技術相比，本發明的有益技術效果是：在鳥苷菌的生產特性與代謝途徑基礎上，操作與理論相結合，通過結構類似物的壓迫作用，讓符合高產特性的菌株優先生長，有目的地進行篩選，為高鳥苷菌株的篩選提供了簡便、高效的篩選方法。最終得出穩定性好，產苷高的菌株，進行入庫保存，供工業大生產使用，保障工業生產鳥苷產量的穩定。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的內容作進一步詳述，實施例中所提及的內容並非對本發明的限定，製備過程中各個原材料的選擇可因地制宜而對結果並無實質性影響。
實施例
I.將待篩選的鳥苷甘油種液在接入含有培養基①的三角瓶中，振蕩培養，溫度為35℃，轉速200rpm，振蕩培養18h，至對數生長期停止培養。
II.在無菌操作臺上，用接種針取上述培養液在平板培養基②中梯度劃線分純，培養溫度33℃，培養40小時，得出單菌落。
III.無菌條件下挑選生長飽滿的3個單株接入含有培養基③的三角瓶中，振蕩培養，溫度35℃，轉速200rpm，振蕩培養20h。
IV.在無菌操作臺上，用接種針各取培養液在平板培養基④中梯度劃線分純，得出單株菌落，培養溫度33℃，培養24小時，各平板中選擇6個生長飽滿的單株株擴大培養待用。
再將由上述篩選方法得出的18株鳥苷生產菌株放在搖瓶培養，37℃，搖床振蕩培養48h，發酵液離心得上清液，經紙層析(異丙醇:氨水:水＝7:2:1)分離雜質後，用0.01M鹽酸溶液浸泡1小時，洗脫出鳥苷後，在260nm處測紫外吸收值(A260)，計算搖瓶發酵液鳥苷含量，結合糖耗分析，得到最優良的鳥苷生產菌株3株，此菌株製成甘油種液或凍幹種長期保存。
上述整個工藝流程共計約9-10天。