高比活耐熱N-醯基高絲氨酸內酯酶AiiA-AIO6及其編碼基因與應用的製作方法

2023-04-28 21:47:56 4

專利名稱：高比活耐熱N-醯基高絲氨酸內酯酶AiiA-AIO6及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高比活耐熱N-醯基高絲氨酸內酯酶AiiA-Aioe及其編碼基因與應用。
背景技術：
群體感應(quorum sensing, QS)是細菌的一種調控機制，指細菌通過感應特定信號分子的濃度來感知周圍環境中自身或其它細菌的數量，並調整相關基因的表達以適應環境的變化，這些特定的信號分子(又稱為自誘導物)。革蘭氏陰性細菌中典型的QS系統包括負責信號產生的IuxI類基因、反應調節因子IuxR類基因和LuxR蛋白結合區luxbox。革蘭氏陰性菌群體感應系統中最典型的一類信號分子是N-醯基-高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)類化合物。細菌細胞通過產生AHLs進行信息交流，調控某些特定生理性狀的表達。隨著對QS系統的深入研究，發現多種革蘭氏陰病原細菌的重要生理過程，包括毒性因子在內的次生代謝物的產生等均受QS系統的調控。如對人類主要條件致病菌銅綠假單胞菌晶片分析表明，在基因組中300多個基因受QS系統調控，其中包括了形成胞外蛋白酶、毒素和脂肪酶等致病因子表達的基因。再如引起植物軟腐病的重要致病菌胡蘿蔔果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)中，QS系統調控了包括合成和分泌能降解植物細胞壁的水解酶的表達及其它與寄主植物互作的毒性因子的產生。因此可以利用QS系統作為細菌病害防治的新靶點。目前已將幹擾QS系統中AHL信號分子的合成作為生物防治革蘭氏陰性病原菌的新靶標。而利用QS調控系統控制細菌病害的途徑之一是尋找能降解信號分子的酶，使AHL 信號分子不能達到調控的臨界濃度以阻斷細菌間的信息交流從而防止病原菌的感染。目前已報導的N-醯基高絲氨酸內酯酶，比活力較低且耐熱性較差，限制了其應用價值。因此，發掘比活力更高、耐熱性更好的新酶，成為目前研究的一個重要方向。

發明內容
本發明公開了一種高比活耐熱N-醯基高絲氨酸內酯酶AiiA-AIOe及其編碼基因與應用。本發明所提供的蛋白(AiiA_AI06蛋白)，來自蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，具有N-醯基高絲氨酸內酯酶功能，為如下(a)或(b)或(c)(a)序列表中序列1自N末端第2至沈9位胺基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(c)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-醯基高絲氨酸內酯酶功能的由序列1衍生的蛋白質。為了使(a)或(b)或(c)中的AiiA-Aioe蛋白便於純化，可在由序列表中序列1
3所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列
權利要求
1.一種蛋白質，為如下(a)或(b)或(c)(a)序列表中序列1自N末端第2至269位胺基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(c)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-醯基高絲氨酸內酯酶功能的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於它為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA 分子1)序列表中序列2自5』末端第4至807位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5』末端第4至810位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或幻或幻限定的DNA序列雜交且編碼具有N-醯基高絲氨酸內酯酶活性的蛋白的DNA分子；5)與1)或幻或幻限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有N-醯基高絲氨酸內酯酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為將權利要求2 或3所述基因插入載體pET18a(+)的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求4所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌為將權利要求4或5所述重組表達載體導入大腸桿菌得到的重組菌；所述大腸桿菌優選為大腸桿菌(Escherichia coli) BL21(DE3)。
7.如權利要求6所述的重組菌，其特徵在於所述重組菌為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)BL21pED8a(+)/aiia_AI06，其保藏號為 CGMCC No. 4621。。
8.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
9.權利要求1所述蛋白在降解N-醯基高絲氨酸內酯中的應用。
10.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於所述N-醯基高絲氨酸內酯為C4-HSL、 C6-HSL、 C7-HSL、 C8-HSL、 C 10-HSL、3-oxo-C6_HSL、3-oxo-C8_HSL、3-oxo-C14_HSL、 3-oxo-C10-HSL、3-hydroxy-C12-HSL 和 3-hydroxy-C14_HSL 中的至少一種；所述降解的溫度為0°C -50°C，優選為30°C ；所述降解的pH值為6. 0-9. 0，優選為8. 0。
全文摘要
本發明公開了一種高比活耐熱N-醯基高絲氨酸內酯酶AiiA-AIO6及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-醯基高絲氨酸內酯酶活性的由序列1衍生的蛋白質。本發明提供的AiiA-AIO6蛋白，是一種新的N-醯基高絲氨酸內酯酶，該酶比活力高、耐熱，具有較強的蛋白酶抗性和較好的降解各種底物的能力，可作為一種新型的生防酶製劑。
文檔編號A01P1/00GK102212508SQ20111008256
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者何夙旭, 周志剛, 張宇婷, 張美超, 徐俐, 曹雅男, 毛瑋, 霍鳳敏 申請人:中國農業科學院飼料研究所