心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條的製作方法

2023-04-25 13:04:26

心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條的製作方法
【專利摘要】一種心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條，所述試紙條包括底板和在底板上依次搭接粘貼的樣品墊、結合墊、包被墊及吸水墊，所述結合墊上同時包被有兩種不同粒徑螢光微球標記的抗心型脂肪酸結合蛋白的第一抗體，所述包被墊上包被有相間隔的檢測帶和質控帶，所述檢測帶固定有抗心型脂肪酸結合蛋白的第二抗體，所述質控帶固定有抗鼠IgG的抗體。本實用新型的試紙條兼顧了低值靈敏度和檢測的線性範圍，且可以實現快速、單人份定量檢測。
【專利說明】心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條

【技術領域】
[0001]本實用新型涉及臨床免疫檢測裝置領域，具體涉及一種心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條。

【背景技術】
[0002]心型脂肪酸結合蛋白(heartfatty acid binding protein，h-FABP)是一種對心肌損傷的早期診斷極其有用的生物標誌物。心肌細胞損傷後I小時之內就能夠快速釋放至血液中。h-FABP比肌紅蛋白(Myo)更加具有心臟特異性，心臟中h_FABP濃度比骨骼肌中高2-10倍，但Myo在心臟中的濃度卻比骨骼細胞中低2倍。相對於其他的急性冠脈綜合症診斷標誌物(如CK-MB、cTn1、cTnT及Myo等)，h_FABP更具有時間優勢，也有著更好的ROC曲線下分析，體現出更具優勢的診斷靈敏度和特異性。
[0003]目前臨床常用的檢測h-FABP的方法包括:膠乳增強免疫比濁法、膠體金免疫層析法、螢光免疫層析法等。膠乳增強免疫比濁法在全自動生化儀中檢測，可以實現自動化、並且快速的進行單人份檢測，但無法實現床旁診斷(POCT)。膠體金免疫層析法操作簡單，但只能實現半定量。
實用新型內容
[0004]摶術問題
[0005]螢光免疫層析法既可以實現快速檢測，又能夠進行精確定量，為臨床應用帶來了極大的便利。因此，需要一種基於螢光免疫層析法的心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條。
[0006]技術方案
[0007]一方面，本實用新型提供了一種心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條，其特徵在於，所述試紙條包括:
[0008]i)底板，和
[0009]ii)在所述底板上依次搭接粘貼以下組件:
[0010]i1-Ι)用於接收樣品的樣品墊，
[0011]i1-2)同時包被有兩種不同粒徑螢光微球標記的抗h-FABP的第一抗體的結合墊，
[0012]i1-3)包被有相間隔的檢測帶和質控帶的包被墊，其中所述檢測帶固定有抗h-FABP的第二抗體，所述質控帶固定有抗鼠IgG的抗體，和
[0013]i1-4)吸水墊。
[0014]在一個實施方式中，所述抗心型脂肪酸結合蛋白的第一抗體和第二抗體識別心型脂肪酸結合蛋白的不同表位。
[0015]在一個實施方式中，所述焚光微球上具有Cy3焚光素或Cy5焚光素。
[0016]在一個實施方式中，所述兩種不同粒徑大小的螢光微球的粒徑大小分別為10nm和 300nm。
[0017]在一個實施方式中，所述檢測帶和所述質控帶之間的間隔在0.3cm-0.5cm之間。
[0018]在一個實施方式中，所述試紙條的長度在8cm至1cm之間。
[0019]在一個實施方式中，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
[0020]有益效果
[0021]在本實用新型的試紙條中，獨立的樣品墊和結合墊的設計可以有效避免樣品中雜質對檢測靈敏度的影響，有利於提高檢測靈敏度。而且，兩種不同粒徑螢光微球的設計能夠同時滿足檢測中對高靈敏度和寬檢測線性範圍的要求。此外，試劑條檢測更為方便和廉價，有利於臨床應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1本實用新型的試紙條的側視示意圖。
[0023]圖2本實用新型的試紙條的俯視示意圖。
[0024]附圖標記:1_樣品墊、2-結合墊、3-包被墊、4-吸水墊、5-底板、6-檢測帶、7-質控帶。

【具體實施方式】
[0025]下文中將參照附圖來更詳細地描述示例性實施方式。所述附圖用於圖示說明本實用新型，而非對其進行限制。
[0026]圖1是本實用新型的試紙條的側視示意圖。
[0027]如圖1所示，本實用新型的試紙條包括底板5和在底板5上依次搭接粘貼的樣品墊1、結合墊2、包被墊3和吸水墊4。
[0028]樣品墊I與結合墊2搭接且用於接收樣品。本實用新型的試紙條所適合檢測的樣品包括但不限於血清、血漿、尿液。心型脂肪酸結合蛋白是一種對心肌損傷的早期診斷極其有用的生物標誌物。心肌缺血性損傷出現後，心型脂肪酸結合蛋白可以早在胸痛發作後諸如最早1-3小時在血液中被發現。樣品墊I可以起到樣品過濾的作用，由此可以提高檢測的靈敏度。例如，當待檢測樣品為血漿、血清時，接收層可以過濾樣品中顆粒性不溶物，使得樣品中所含的心型脂肪酸結合蛋白能夠更準確地被檢測。樣品墊I的材質為玻璃纖維素膜或者聚酯膜。
[0029]結合墊2位於樣品墊I和包被墊3之間，且分別與樣品墊I和包被墊3搭接。結合墊2用於布置與待測樣品中特定蛋白反應的抗體。本實用新型的試紙條的結合墊2上布置有特異性結合樣品中h-FABP的抗h-FABP的抗體，且此抗體由兩種不同粒徑大小的螢光微球分別標記。傳統的螢光免疫層析法所採用的單個螢光微球抗體存在一定的缺陷。在本實用新型的試紙條中，小粒徑的螢光微球標記的抗體使得檢測的線性範圍可覆蓋高值區域。大粒徑的螢光微球標記的抗體有利於低值的檢測以達到靈敏度的要求。兩種粒徑大小的螢光微球的使用使得本實用新型的試紙條可同時實現高靈敏度和寬檢測線性範圍的要求。在一個實施方式中，所述兩種不同粒徑大小的焚光微球的粒徑大小分別為10nm和300nm。在一個實施方式中，所述螢光微球上具有Cy3螢光素或Cy5螢光素。
[0030]樣品墊2的材質可與樣品墊I相同或不同，其優選玻璃纖維素膜。
[0031]包被墊3位於結合墊2和吸水墊4之間，且分別與結合墊2和吸水墊4搭接。包被墊3的材質優選為硝酸纖維素膜。包被墊3用於布置檢測帶和質控帶(參見圖2)。
[0032]檢測帶布置有另一種抗h-FABP的抗體。與結合墊2上布置的抗體相比，檢測帶上布置的抗體特異性結合不同的h-FABP的抗原表位。由此，通過在結合墊2和包被墊3上分別布置特異性結合h-FABP不同抗原表位的兩種抗體，從而實現用「免疫夾心法」對h-FABP進行定量測定，由此進一步提高了檢測的靈敏度。
[0033]質控帶布置有抗鼠IgG的抗體，其用於確定反應體系是否成立。
[0034]吸水墊4通過毛細作用提供樣品從樣品墊I至結合墊2至包被墊3迀移的動力。吸水墊4可由選自由諸如棉絨、玻纖等材料製成，優選由棉絨材料製成。
[0035]樣品墊1、結合墊2、包被墊3和吸水墊4整體依次搭接粘貼被布置於底板5上。
[0036]圖2是本實用新型的試紙條的俯視示意圖。圖2中與圖1相同的部分不再贅述。
[0037]如圖2所示，包被墊3布置有檢測帶6和質控帶7。檢測帶6和質控帶7之間的間隔可以在0.05cm至0.8cm之間。在一個實施方式中，檢測帶6和質控帶7之間的間隔在0.2cm至0.5cm之間，更優選在0.3cm至0.5cm之間。
[0038]本實用新型試紙條的整體長度在5cm至15cm之間，優選8cm至1cm之間。本實用新型的試紙條的整體寬度在0.2cm至0.8cm之間，優選在0.2cm至0.5cm之間，優選在
0.2cm至0.3cm之間，最優選為0.3cm。本實用新型的試紙條在提供靈敏度和檢測線性範圍的同時，通過降低試紙條的長度和/或寬度可降低抗體的用量，大大節約了生產成本。
[0039]本實用新型所提供的應用兩種不同粒徑螢光微球定量檢測h-FABP的螢光免疫層析試紙條兼顧了低值靈敏度和檢測的線性範圍，且可以實現快速、單人份定量檢測，加之體積小、易於攜帶和保存，為臨床使用提供了極大便利。加之其製備方法更加簡單，可以實現批量生產，有利於大規模推廣應用，具備廣闊的市場前景。
[0040]實施例
[0041]下述實施例中，所述h-FABP第一抗體、h-FABP第二抗體、抗鼠IgG抗體、Cy3螢光素標記的螢光微球、Cy5螢光素標記的螢光微球、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纖維素膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、高強度吸水紙均為市售產品。
[0042]所述應用兩種不同粒徑螢光微球檢測h-FABP的螢光免疫層析試紙條的製備方法為:
[0043]I)樣品墊的製備
[0044]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入樣品墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩衝液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液)中浸泡處理3_5小時後，於35_39°C鼓風乾燥箱中烘乾3_5小時。
[0045]2)結合墊的製備
[0046]A、結合墊的預處理
[0047]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入結合墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩衝液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液)中浸泡處理3_5小時後，於35_39°C鼓風乾燥箱中烘乾3_5小時。
[0048]B、標記抗體的兩種不同粒徑螢光微球的製備
[0049]將h-FABP第一抗體以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩衝液4°C透析過夜，調整濃度為 2mg/ml-5mg/ml。
[0050]使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩衝液洗滌小粒徑焚光微球(選自Cy3焚光素標記的焚光微球、Cy5焚光素標記的焚光微球中的任意一種)，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應20-30分鐘，充分洗滌螢光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩衝液復溶後加入透析過的第一抗體，使第一抗體與螢光微球的質量比為1: 8至1: 60，室溫反應2小時後，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩衝液室溫封閉30分鐘，充分洗滌螢光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液的保存液復溶至原體積。
[0051]使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩衝液洗滌大粒徑焚光微球(選自Cy3焚光素標記的焚光微球、Cy5焚光素標記的焚光微球中的任意一種)，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應20-30分鐘，充分洗滌螢光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩衝液復溶後加入透析過的第一抗體，使第一抗體與螢光微球的質量比為1: 20至1: 80，室溫反應2小時後，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩衝液室溫封閉30分鐘，充分洗滌螢光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液的保存液復溶至原體積。
[0052]將上述標記第一抗體的兩種不同粒徑的螢光微球按1: 10到10: I的比例進行混勻，即製備出標記抗體的兩種不同粒徑螢光微球。
[0053]C、結合墊的製備
[0054]將步驟B製備獲得的標記抗體的兩種不同粒徑螢光微球混合物使用定量噴膜儀以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勻噴塗於上述步驟A中預處理過的玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，於35-39°C鼓風乾燥箱中烘乾2-4小時，加入乾燥劑封存備用。
[0055]3)包被墊的製備
[0056]A、檢測帶的製備:將 h-FABP 第二抗體以 0.01-0.02M,pH7.4-8.2 的 Tris-HCl 緩衝液4°C透析過夜，使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02Μ，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液)將透析後的h-FABP第二抗體稀釋到0.2mg/ml-4mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以
1.2 μ 1/cm均勻噴塗於硝酸纖維素膜上，於35-39°C鼓風乾燥箱中烘乾2_4小時。
[0057]B、質控帶的製備:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液)將抗小鼠IgG稀釋到0.5mg/ml-3mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以0.8 μ 1/cm均勻噴塗於硝酸纖維素膜上，於35-39°C鼓風乾燥箱中烘乾2_4小時。
[0058]C、包被墊的製備:用封閉液(含有1-10% BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩衝液)將含有檢測帶和質控帶的硝酸纖維素膜封閉1_2小時，取出後置35-39°C鼓風乾燥箱中烘乾2-4小時，封袋備用。
[0059]4)試紙條及試劑卡的組裝
[0060]在溼度小於30%，溫度20_30°C條件下進行試紙條及試劑卡的組裝。底板選用PVC材料，在底板同一面的方向順次連接且相鄰部位部分重疊的樣品墊、結合墊、包被墊及吸水墊。在包被墊粘覆底板時，檢測帶的位置靠近結合墊，質控帶的位置靠近吸水墊。吸水墊為高強度吸水紙。組裝好後裁剪成試紙條，並組裝入試劑卡中。
[0061]5)校準品及待檢樣品的測定
[0062]將100 μ I的標準品或者待檢樣品加入到試劑卡的加樣孔，進行免疫層析反應，10-15分鐘後將試劑卡置於專門的螢光檢測儀中，通過讀取螢光信號的大小進行定量測定。
[0063]以上實施例僅僅是為了清楚地說明所做的舉例，並非對實施方式的限定。
【權利要求】
1.一種心型脂肪酸結合蛋白定量檢測試紙條，其特徵在於，所述試紙條包括: i)底板，和 ?)在所述底板上依次搭接粘貼以下組件: ?-1)用於接收樣品的樣品墊， i1-2)同時包被有兩種不同粒徑螢光微球標記的抗心型脂肪酸結合蛋白的第一抗體的結合墊， ?-3)包被有相間隔的檢測帶和質控帶的包被墊，其中所述檢測帶固定有抗心型脂肪酸結合蛋白的第二抗體，所述質控帶固定有抗鼠IgG的抗體，和i1-4)吸水墊。
2.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述抗心型脂肪酸結合蛋白的第一抗體和第二抗體識別心型脂肪酸結合蛋白的不同表位。
3.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述螢光微球上具有Cy3螢光素或Cy5螢光素。
4.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述兩種不同粒徑大小的螢光微球的粒徑大小分別為10nm和300nm。
5.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述檢測帶和所述質控帶之間的間隔在 0.3cm_0.5cm 之間。
6.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述試紙條的長度在8cm至1cm之間。
7.根據權利要求1的所述試紙條，其特徵在於，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
【文檔編號】G01N33/68GK204228721SQ201420674088
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】程海, 王義娜, 李鼎鋒, 聶聰, 祁雙, 戈軍, 劉勇 申請人:江蘇達駿生物科技有限公司